BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
t r ự Ạ g j h ị íịặ n g
lỈỊ ‘cỊ
,V' I*' ì
NGHIÊN cúu
BÁN CẤP CỦA
DẪN XUẤT ARTEMISININ GẮN FLUOR ở DỘNG VẬT
■ ■
THỰC NGHIỆM
■ ■
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợc s ĩ KHOÁ 2001 - 2005)
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Trường
TS. Trương Văn Như
Nơi thực hiện: VIỆN SR - KST - CT TRUNG ƯƠNG
Thời gian thực hiện: 2/2005 - 4/2005
HÀ NỘI, THÁNG 5 - 2005
ì í m
Q c À M Ơ Q l
OlhảẽL d ịf t kẨứưt thòưih Uhỡéi LuÁn tấ t ểLạídệftf
æÙL b ò jf tẢ lÌM ig. k ú i h ÚỈL b i ê í a â h ẹ ư i i ê i ÇîS^,
QỈjạAijụẪềL (XjuâiL Q'ifttòfiạ,f ÇÎS^. Çîv^d^iq. (Dă^L Q lh u lỈL k a i
nạẪtòi útầự, đ ă trự e m ịt hưêi^ig. dẫễ^i giúfL đẽ^ £jrwL kíỳăễL
ih à n lt Uhiỳú. lu ãtL , Ò m æÙL c h ă n ikiư tÍL ecưn. ổfL lùỀsL S(J¿
• •
3CSÇÎ - tn u iạ - ưjổníỊ. đjỄL tạLi% đỉỀLL UiềĩL ũ ề e đ Ãjâ o ú i
châí^ ÌMĩ^ưig. t h i â b if d iư ig. eiJi OỈL đỗ4^iạ- ữ ú l (th À ) ehẨ% í^n
làm . Uhúă iíiậ n .
Qủng. n h á tt ílịp. iiMMf eMi xitL dujç^ (ĩăụ^ iÀ Làftg. lùeJt
đểL tớ i eÚA thÂiỊ. giáj^f eầ qiáo^ đ ã dạụ, d ẫ tồ i tí^ iạ , 3ÂjjỐt
€ịAijCL trh th h ợe tộfL tụ i trưè^Lg.^ xỉễL eảển đwL eáe th ầ ự eẵ

ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Tình hình sốt rét trên thê giối và Việt Nam 2
1.1.1. Tình hình sốt rét trên thê giới
2
1.1.2. Tình hình sốt rét ở Việt Nam
2
1.2. Tình hình KST sốt rét kháng thuốc SR 3
1.3. Tình hình nghiên cứu artemisinin và dẫn xuất của nó

6
1.3.1. Nguồn gốc tách chiết và xác định cấu trúc

6
1.3.2. Tính chất của Artemisinin

8
1.3.3. Độc tính của Artemisinin và dẫn xuất của nó 9
1.3.4. Dược động học
10
1.4. Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn flour

11
1.4.1. Sơ lược vê qui trình tổng hợp các dẫn chất artemisinin
gắn fluor 11
1.4.2. Đặc điểm các dẫn chất artemisinin gắn fluor và BB 134 12
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 14
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nhiệm

14

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng sốt rét Plasmodium gây ra,
bệnh sốt rét đã và đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho sức khoẻ cộng đồng
ỏ những vùng sốt rét lưu hành.
Mặt khác tình trạng KST SR kháng thuốc SR ngày càng trở lên phức tạp [1]
và đã lan rộng ra tất cả các vùng SR lưu hành trên thế giới, trong đó có Việt Nam.
Kháng thuốc của p. falcipanum đã làm tăng tỷ lệ SR ác tính, tăng các vụ dịch SR và
tăng tỷ lệ tử vong. Trước tình hình trên việc nghiên cứu một thuốc mới chống SR có
hiệu lực với p . falcipanum là hết sức cần thiết.
Artemisinin và dẫn xuất là những thuốc SR mới được chiết từ cây Thanh hao
hoa vàng (Artemisia annua.L. ), hiện nay đang được sử dụng rộng rãi để điều trị
bệnh SR ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam. ART và dẫn xuất có ưu điểm là ít độc,
lại có hoạt tính và hiệu quả điều trị cao. Tuy nhiên, ART và dẫn xuất của nó còn có
nhược điểm là thời gian bán thải ngắn, tỷ lệ tái phát bệnh sốt rét còn cao (47%).[ 2 ]
Để khắc phục tình trạng trên một loạt các dẫn xuất của ART như: artesunat,
artemether, arteether, dihydroartemisinin đã được ra đời. Các nhà khoa học Pháp
cũng đã tổng hợp ra một dẫn suất mới của ART là BB 134. Viện SR - KST - CT
trung ương đã phối hợp với cộng hoà Pháp nghiên cứu tiền lâm sàng dẫn xuất trên
trong đề tài cấp nhà nước giai đoạn 2002 - 2005. Thực hiện một phần của đề tài,
trong khoá luận này chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu độc tính bán cấp của
dẫn xuất artemisinin gắn flúor ở động vật thực nghiệm”.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau;
1. Đánh giá ảnh hưởng của BB134 lên một số chỉ sô' huyết học ở thỏ thực
nghiệm.
2. Đánh giá ảnh hưởng của BB134 lên một sô chỉ số hoá sinh ở thỏ thực
nghiệm.
3. Đánh giá ảnh hưởng của BB134 lên tim mạch ở thỏ thực nghiệm.
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sốt rét trên thê giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình sốt rét trên thế giới.
Mặc dù đã có tiến bộ trong công tác phòng chống nhưng bệnh sốt rét

kháng, do vậy nguy cơ bùng nổ SR vẫn còn là mối đe doạ cho những vùng có
SR lưu hành.
Tình hình SR ở Việt Nam từ năm 1991 đến năm 2003 được trình bày
tóm tắt ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Sô ca mắc SR, sốt rét ác tính, sô vụ dịch SR và sô bệnh nhân
tử vong ở Việt Nam từ năm 1991 - 2003 [2,18].
Năm
BNSR
KSTSR
BNSRAT
Sô vụ dịch
SR
Tử vong
1991 1.091.251
187.994 31.741
144 4.646
1995 666.153
100.116 4.222 3
348
1998 383.341 72.091
1.447 4 183
1999
341.529
75.534
1.516 8 190
2000 293.016
74.316
1.161 2 148
2001 257.793
68.699

- Kháng độ 1 (RI): Hết sốt và sạch KST SR trong tuần đầu nhưng lại tái
phát KST từ ngày 8-28.
- Kháng độ 2 (R II); Số lượng KSTSR giảm dần nhưng không hết hẳn,
tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng < 25% so với ngày NO.
- Kháng độ 3 (R III): Số lượng KST SR giảm dần nhưng không hết hẳn,
cho tới ngày thứ 7 vẫn còn nhưng > 25% so với ngày NO hoặc lượng KST
không giảm, thậm chí còn tăng cao hơn so với NO.
Việt Nam là một trong những nước xuất hiện KST kháng thuốc sớm
trên thế giới. Trường hợp đầu tiên p. falciparum kháng cloroquin được phát
hiện tại Nha Trang năm 1961, An Khê (1964)
Năm 1968 lần đầu tiên xuất hiện một vụ dịch khá lớn do p .falciparum
kháng cloroquin xảy ra ở Quỳnh Thắng Nghệ An [1]. Sau giải phóng miền
Nam, có sự giao lưu giữa hai miền, biến động dân cư lớn. Đến năm 1995 đã
xác định p .falciparum kháng cloroquin ở hầu như 100% vùng sốt rét ở các
tỉnh miền Nam và rộng ra nhiều tỉnh miền Bắc [18],
Những nghiên cứu 20 năm gần đây ở Việt Nam cho thấy: đáp ứng của
p. falciparum với thuốc SR ở các khu vực SR lưu hành khác nhau thì có mức
độ kháng cũng rất khác nhau. Giai đoạn 1991-1995 các nghiên cứu tại các
vùng khác nhau cho thấy p. falciparum kháng cloroquin RII, RIII, từ 10,5 -
96,7%. Giai đoạn 1996 - 2000 tỷ lệ thất bại muộn p. falciparum bằng
cloroquin từ 22,2% - 56,3% [2].
Nghiên cứu năm 2001 - 2002 tại một số tỉnh miền Trung cho thấy
p.falciparum kháng cloroquin RII, RIII là 37,5%, tỷ lệ điều trị thất bại đến
ngày thứ 28 từ 48,0% - 71,9%. Với hỗn hợp sulfadoxin - pyrimethamin, tỷ lệ
điều trị thất bại 73%. Phác đồ artesunat đơn thuần, liệu trình 5 ngày tỷ lệ thất
bại muộn là 17,5%. Viên sốt rét CV-8 chưa thấy có thất bại [16].
ở nước ta tỷ lệ kháng fancidar tương đối cao mặc dù thuốc này đưa vào
sử dụng chưa lâu. Năm 1998, trong một nghiên cứu tại nhiều điểm trong cả
nước của Nguyễn Duy Sỹ đã xác nhận tỷ lệ kháng RI = 31,7%, RII = 25,8%,
RIII = 14% (n=243).

(Asteraceae) là cây thảo, sống hàng năm, mọc hoang thành từng đám ở vùng
đồi ven suối, ven sông, ở những nước ôn đới và nhiệt đới như Trung Quốc,
Mông Cổ, Iran, Châu Âu, Bắc và Nam Mỹ, một số nước Đông Nam Á. Cây
cao từ 1,2 - 1,5 m, lá xẻ lông chim 2 lần, thành phiến dẹt, phủ lông mềm, có
mùi thơm. Cụm hoa hình thành một thuỳ kép, lá bắc tổng bao hình trứng hoặc
bầu dục, hoa màu vàng nhạt. Trong một cụm hoa có sáu hoa, xung quanh là
hoa cái, ở giữa là hoa lưỡng tính. Hoa nhỏ chỉ dài bằng một màng lọc, mặt vỏ
có tuyến dẩu [12].
ở Việt Nam cây mọc nhiều ở Lạng Sơn, Cao Bằng còn ở Quảng Ninh,
Hà Bắc, Bắc Thái, Hải Hưng cũng có cây Thanh hao mọc nhưng thưa thớt,
không có khả năng khai thác [15].
Hiện nay, cây Thanh hao hoa vàng được trồng ở nhiều tỉnh phĩa Bắc và
một số tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Lâm Đồng, Long An nhằm đáp ứng
cho nhu cầu chiết xuất artemisinin
* Tách chiết và xác định cấu trúc của astemisinin.
Năm 1972 các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất từ dịch chiết
ether của lá cây Thanh hao hoa vàng một chất có hoạt tính chữa sốt rét đầu
tiên gọi là artemisinin.
Tiếp đó năm 1984, Klayman D.L., và cộng sự đã chiết ART từ dược
liệu khô bằng ether dầu hoả sôi, tách ART bằng sắc ký cột và kết tinh lại trong
cyclohexan. Sau đó nhiều tác giả khác đã nêu phương pháp chiết và phân lập
ART từ hỗn hợp các sesquiterpen để thu được ART.
ở Việt Nam từ năm 1989 nhóm nghiên cứu của Đinh Huỳnh Kiệt đã
công bố kết quả chiết ART từ lá cây Thanh hao hoa vàng bằng ete dầu hoả
[11]. Sau đó việc chiết xuất artemisinin phát triển rất nhanh chóng và năng
suất tăng lên rất nhiều.
* Cấu trúc. Cấu trúc của ART được xác định bằng kết hợp các phương pháp
phân tích nguyên tố, nhiễu xạ tia X, cho công thức phân tử là: C|5H220g.
15 C H 3
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của artemisinin.

R= -0 -CH2-C6H4-C0 0 Na : artelinat
•4
H,c
Hình 1.2. Các dẫn xuất của artemisinin.
1.3.3. Độc tính của artemisinin và dẫn suất của nó.
* Độc tính cấp.
Artemisinin và dẫn chất là những thuốc ít độc [21]. Các nghiên cứu về
độc tính cấp và bán cấp của artemisinin và các dẫn xuất của nó đối với động
vật thực nghiệm là tương đối thấp. Độc tính của ART và dẫn xuất trên chuột
nhắt trắng thấp hơn chloroquin (bảng 1.3).
Bảng 1.3. Liều chết 50% (LD50) của ART và dẫn xuất.
Loài súc vật
Tên thuốc
Đường dùng
thuốc
LD 50 (mg/kg)
Artemisinin
Uống
Tiêm bắp
4228
3840
Chuột nhắt
Artesunate
Uống
Tiêm bắp
1180
475
Dihydroartemisinin
Uống
1150

chưa thấy ảnh hưởng đến các quá trình hưng phấn và ức chế lên hệ thần kinh
cấp cao ở chuột nhắt trắng và liều 50 mg X 5 ngày trên chuột cống trắng [13].
Artemether và arteether liều 12,5 mg/kg đến 50 mg/kg thể trọng ảnh
hưởng rõ đến chức năng não bộ của chó. Meshlick và cộng sự đã nhận thấy
khi dùng artemether liều cao trên chuột cống đã gây hoại tử neuron ở các vùng
đặc biệt (nhân đỏ và nhân tiền đình) của não [23].
Các nghiên cứu trên chuột cống trắng cho thấy với liều uống 250- 500
mg/kg dùng 14 ngày liên tục, ART và dẫn xuất của nó không ảnh hưởng đến
trọng lượng, không làm thay đổi điện tâm đồ, công thức máu, hình ảnh vi thể
gan, tim, phổi, thận ở chuột thí nghiệm [3,4],
ART và dẫn xuất có thể qua được hàng rào sau thai và hàng rào máu
não, nên ảnh hưởng của ART và dẫn xuất khi dùng cho người mang thai còn
có nhiều ý kiến khác nhau. Các nghiên cứu về đột biến động vật đã cho thấy
rằng ART không phải là chất gây đột biến [21], không gây quái thai của bào
thai chuột cống.
1.3.4. Dược động học.
Các nghiên cứu trên động vật cho thấy, nồng độ ART thấp trong huyết
tương sau khi uống, nhưng nồng độ ART cao hơn sau khi tiêm bắp. Nghiên
cứu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đo nồng độ ART trên chuột nhắt
và chuột cống cho thấy, nồng độ ART cao hơn trong huyết tương 1 giờ sau khi
uống và thời gian bán thải là 4 giờ ở chuột nhắt và 1 giờ ở chuột cống. Thuốc
phân phối rộng khắp cơ thể, thuốc được bài tiết qua thận và nước tiểu trong 24
giờ.
Các nghiên cứu về dược động học trên người còn rất hạn chế, trong một
số nghiên cứu cho thấy thời gian tồn tại ART trong cơ thể ngắn. ART gắn vào
Protein của huyết tương khoảng 65%.
1.4. Tình hình nghiên cứu dẫn xuất artemisinin gắn fluor.
1.4.1. Sơ lược về qui trình tổng hợp các dẫn chất artemisinin gắn fluor
15 Ç H 3
.R

Dihydroartemisinin
17,9
Arteether
10,98
Artelinic acid
13,11
Dạng không acetal
Deoxartemisinin (DOA)
213,36
10-(n-by tyl)-DO A
165,12
10-benzyl-DOA
385,6
10-cacboxy propy 1-DO A
386,88
10-cacboxybytyl-DO A
374,4
Ngoài ra , các kết quả nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính chống sốt rét
invitro của dạng không acetal mạnh hơn 8 - 9 lần so với dạng acetal.
Dựa vào các nghiên cứu này, các nhà khoa học Pháp chủ trương gắn
một nhóm chức bền vững với chuyển hoá là -CF3 trong đó liên kết C-F rất bền
vững với các phản ứng oxy hoá và thuỷ phân). Điều này vừa làm tăng độ bền,
tăng thời gian bán thải của thuốc, mặt khác nó còn ngăn cản các phản ứng
thuỷ phân và oxy hoá góp phần làm giảm các tác dụng gây độc đối với thần
kinh.
Khi thay ửiế gốc R bằng nhóm piperazinoethanol sẽ được chất BB134
(16 - piperazinoeửianol-10a - triluoromethyl - anhydrodihydroartemisinin) [20].
lí CH3
M M .
-OH

- Điện tim thỏ được ghi trên máy điện tim Cardiofax của Camperation
Việt Nam - Japan 1994
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu.
* Thiết kế nghiên cứu.
Độc tính bán cấp của BB 134 được nghiên cứu trên thỏ, thỏ gồm 20 con
được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô 10 con.
- Lô 1 uống BB 134 liều 9 mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục
- Lô 2 lô chứng uống Gôm arabic 1% như lô uống BB 134.
SỐ thỏ này dùng để xét nghiệm các chỉ số huyết học, sinh hoá, điên tim
vào các ngày trước uống thuốc (NO), sau 14 ngày uống thuốc (N14), sau 28
ngày uống thuốc (N28)
Hình 2.1. Hình ảnh thỏ thực nghiệm đang uống thuốc.
* Các chỉ số nghiên cứu.
+ Các chỉ số về huyết học:
- SỐ lượng hồng cầu (x T/1)
- SỐ lượng bạch cầu (x GA)
- Công thức bạch cầu (%)
- Hàm lượng Hemoglobin (gA)
+ Các chỉ số về sinh hoá bao gồm:
• Các chỉ số về hoá sinh gan.
- Hàm lượng SGOT (uA)
- Hàm lượng SGPT(uA)
- Hàm lượng bilirubin (M mol/l)
• Các chỉ số về hoá sinh thận.
- Hàm lượng Creatinin (Mmol/1)
- Hàm lượng protein (g/1)
- Hàm lượng Bilirubin(Mmol/l)
+ Các chỉ số về điện tim: Nhịp tim (lần/phút), sóng p [biên độ (mv),
thời khoảng (sec)], khoảng PQ (sec), phức bộ QRS [biên độ (mv), thời khoảng
(sec)], sóng T [biên độ (mv), thời khoảng (sec)], khoảng QT (sec).

A thử
Kết quả: Nồng độ lilurubin x =

X 85,5
- A mẫu
+ Hàm lượng protein toàn phần trong huyết thanh.
Nguyên lý: Protein huyết thanh tạo phức màu với muối đồng trong môi
trường kiềm. Đậm độ màu tỷ lệ với nồng độ protein có trong dung dịch.Tiến
hành đo màu ở bước sóng 550 nm trên máy tự động LISA của hãng Viphaco
(Pháp) ở nhiệt độ 37°
A thử
Kết quả: Protein (g/1) =

X 60
A mẫu
+ Hàm lượng creatinin trong huyết thanh.
Creatinase
Creatinin + HiO
Creatin + H2O
Creatin
Creatinase
■> Sarcorin + Urê
Sarcorin + O2 + H2O
Sarcorinoxy dase

>■ Glyxin + HCHO + tỈ2v^2
H2O2 + EHSPT + 4 aminoantipyrin

> Đỏ quinon
Đậm độ đỏ quinon tỷ lệ với nồng độ Creatinin có trong dung dịch. Tiến

uống thuốc (N14) và sau 28 ngày uống thuốc (N28), kết quả được tìình bày ở
bảng 2.1
Bảng 2.1. Ảnh hưỏng của BB134 lên thể trọng thỏ
(X±SD, n ^10)
Thời điểm NC
LôNC
Lô chứng
(1)
LôuốngBB134
(2)
p
(l)-(2)
NO
1^7 ±0,05
1^ 7±0fi3
>0,05
N14
2,22 ± 0,13
2^2 ±0,06
>0,05
N28
2^3 ±0,09
2^2 ±0,04
>0,05
PN14-N 0
>0,05
<0,05
PN28-N 0
<0,05
<0,05

p
(1) - (2)
NO
21,44 ±8,11
22 ± 12,4
>0,05
N14
17,56 ±7,91 16,75 ± 5,72
>0,05
N28
24,22 ± 5,63
20,08 ± 7,28
>0,05
PN 14-N 0
>0,05
>0,05
PN 28-N 0
>0,05
>0,05
Qua kết quả bảng ở 2.2 cho thấy hàm lượng SGOT trong máu thỏ của lô
uống thuốc BB 134 liều 9 mg/kg/ngày X 28 ngày liên tục tại thời điểm NO,
N14, N28 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng và so với
trước uống thuốc (p > 0,05).

Trích đoạn Ảnh hưởng của BB134 lên chức năng gan, thận

---