,
.

^
Bộ Y Tê
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHAN THỊ NGHĨA
Ẩéióv
U-f4t- ' -
ĐỊNH LƯỢNG ĐÔNG THỜI PARACETAMOL,
CLORPHENIRAMIN MALEAT VÀ
PHENYLPROPANOLAMIN HYDROCLORID TRONG VIÊN
NÉN DECOLGEN BANG PHƯƠNG PHÁP HPLC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2000-2005)
Người hướng dẫn : TS. Thái Duy Thìn
ThS. Võ Thị Nhị Hà
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá dược
Trường đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện : Tháng 8/2004 - tháng 5/2005
vi'' ' y , i
HÀ NỘI, tháng 5/2005 -j
V, ■ -V ,. / r' V
■I-V ffii
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại bộ môn Hoá dược -
Trường đại học Dược Hà Nội. Trong quá trình thực hiện khoá luận, tôi đã
nhận được sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô hướng dẫn, thầy cô giáo, cán
bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa dược.

Phần 2: Thực nghiệm và kết quả
18
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

18
2.1.1. Hoá chất - Dụng c ụ
18
2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu
18
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 20
2.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc k ý 20
2.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc k ý 25
2.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 27
2.2.4. Khảo sát độ chính xác của phương pháp 30
2.2.5. Khảo sát độ dúng của phương pháp

33
2 .2 .6 . ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định tính và định lượng
đồng thời PA, PH và CM trong viên nén Decolgen

35
2.3. Bàn luận 37
Phần 3: Kết luận và đề xuất 39
3.1. Kết luận 39
3.2. Đề xuất

.

40
Tài liệu tham khảo

United pharma có tác dụng chữa cảm cúm đã được sản xuất với công thức:
Paracetamol : 500 mg
Phenylpropanolamin hydroclorid : 25 mg
Clorpheniramin maleat : 2 mg
Trong các dược điển thông dụng hiện hành [3, 15, 19, 21 ] chủ yếu chỉ
có các chuyên luận cho thuốc chứa một thành phần. Vì vậy, các phương pháp
định lượng các dạng bào chế đa thành phần nói trên hầu hết phải tiến hành qua
nhiều công đoạn, tốn kém hóa chất và thời gian. Hiện có một chuyên luận
trong ƯSP 27 và tiêu chuẩn cơ sở của viên nén Decolgen [13] sử dụng phương
pháp HPLC để định lượng các hoạt chất trong hỗn hợp trên, nhưng mỗi chất
phân tích sử dụng một chương trình sắc ký khác nhau.
Hiện nay, do nhu cầu sử dụng và sản xuất các thuốc đa thành phần ngày
càng tăng, việc đảm bảo chất lượng và hiệu quả điều trị là một yêu cầu tất yếu.
Với mục đích tìm một phương pháp chung, đơn giản và nhanh, phù hợp với
điều kiện trang thiết bị hiện nay của đa số phòng và trung tâm kiểm nghiệm,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Định lượng đồng thòi paracetamol,
clorpheniramin maleat và phenylpropanolamin hydroclorid trong viên
Decolgen bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu:
- Xây dựng chương trình sắc ký thích hợp để có thể định tính và định
lượng đồng thời paracetamol, phenylpropanolamin hydroclorid và
clorpheniramin maleat.
- Áp dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng các hoạt chất
nói trên trong viên nén Decolgen có trên thị trường.
Phầni: TỔNG QUAN
l.l.PARACETAMOL [1, 3, 4, 6, 15, 16, 18, 19, 21, 22]
1.1.1. Công thức cấu tạo:
HO— — NH—CO—CH3
CgHgNOs (M=151,16)
Tên khoa học: N-acetyl-p-aminophenol
hoặc: p-hydroxy acetanilid

(NaNƠ2) trong môi trường acid tạo ra hợp chất diazoni (phản ứng diazo hoá),
chỉ thị là tropeolin-00 hoặc dùng điện thế kế.
- PhưoTig pháp Kieldahỉ [1]
Nguyên tắc: Dựa trên sự vô cơ hoá các hợp chất có chứa nitơ khi đun với
acid H2SO4 đặc với sự có mặt của kali hay natri sulphat. Khi đó nitơ chuyển
thành NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2S04 Thêm NaOH vào hỗn hợp
phản ứng rồi cất kéo NH3 giải phóng ra bằng hơi nước vào dung dịch chuẩn
H2SO4 0,1N dư. Chuẩn độ acid H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N.
- Phương pháp đo quang [1, 3, 15,19, 21]
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân tử paracetamol,
cực đại hấp thụ của paracetamol trong dung môi methanol là 245 nm, trong
môi trường kiềm là 257 nm. Tính kết quả dựa vào giá trị độ hấp thụ quang đo
được và độ hấp thụ riêng hoặc so sánh với chuẩn.
- Phương pháp đo ceri [1, 3, 15]
Nguyên tắc: Trong dung dịch acid, paracetamol sau khi thuỷ phân là một
chất khử, ceri IV là một chất oxy hoá sẽ nhận thêm 1 electron để chuyển
thành ceri III, phát hiện điểm kết thúc bằng íeưoin (phức chất sắt của 0-
phenatrolin). sắt ở trong phức này có thể là sắt II hoặc sắt III, phức chất sắt II
có màu đỏ, phức chất sắt III có màu xanh. Tại điểm tương đương, khi bắt đầu
thừa ceri IV, phức sắt II chuyển thành sắt III, làm dung dịch đổi màu từ đỏ
sang xanh.
[(C,2H8N2)jFe]^" - e ^ [(C,2HsN2)3Fe]="
- Phương pháp HPLC [12,22]
Theo USP 27 [22], định lượng paracetamol sử dụng cột L7, 150mm X 4.6
mm, pha động: nước- methanol- acid acetic băng (79:20:1), tốc độ dòng 1
ml/phút, detector u v 280 nm, thể tích tiêm 5 |_il.
1.2. PHENYLPROPANOLAMIN HYDROCLORID [15, 16, 17, 18, 20,
22]
1.2.1. Công thức cấu tạo:
OH

- Phưoiig pháp định lượng acid-base [15]
Hoà tan phenylpropanolamin hydroclorid trong hỗn hợp dung môi acid
HCl và alcohol, sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1M, xác định điểm
tương đương bằng phương pháp đo điện thế và đọc thể tích thêm vào giữa hai
điểm uốn.
- Phưoìig pháp HPLC [12, 22]
Theo USP 27 [22], định lượng phenylpropanolamin hydroclorid sử dụng
cột Lll, 150mm X 4.6 mm, pha động; methanol - dung dịch đệm phosphat
(60:40), tốc độ dòng 2 ml/phút, detector u v 214 nm, thể tích tiêm 20 ỊLil.
1.3.CLORPHENIRAMIN MALEAT [1, 3, 4, 6 , 15, 16, 18, 19, 20, 21, 2 2 ]
1.3.1. Công thức cấu tạo:
_
___
_
H CH,
/ = \ / X
HC - COOH
o
C16H19CLN2.C4H4O4 (M =390,87)
Tên khoa học:3-(4-clorophenyl)-3-(2-pyridyl)propyldimethylamin
hydromaleat.
hoặc: 2 -[p-cloro-a-[2-(dimethylamino)ethyl]benzyl]pyridin maleat.
1.3.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng, không mùi.
- Nhiệt độ nóng chảy: 130-135°c.
- pKa = 9,2.
- Độ tan: Độ tan tính theo mg/ml ở 25°c là: trong nước 160, ethanol 330,
cloroíorm 240, methanol 130, ít tan trong ether, benzen.
- Có khả năng hấp thụ quang phổ vùng tử ngoại, cực đại hấp thụ trong
môi trường acid là 265 nm, trong môi trường kiềm là 262 nm.

việc định lượng các thành phần bằng các phương pháp cổ điển sẽ gặp nhiều
khó khăn do phải chiết tách phức tạp. Chính vì vậy phương pháp HPLC được
lựa chọn là giải pháp tốt trong việc phân tích thuốc hỗn hợp nhiều thành phần
bởi nhũng ưu điểm như có thể phân tích đồng thời, không cần chiết tách hoạt
chất, cho kết quả nhanh, tin cậy.
1.4. PHƯƠNG PHÁP HPLC [2, 5, 8, 9, 10, 11]
1.4.1. Khái quát phương pháp HPLC
sac ky long hieu nang cao (HPLC) la mot phuorng phap tach hoa ly dua
vao ai luc khac nhau cua cac cha't khac nhau giua hai pha luon tiep xuc va
khong dong tan v6i nhau. Pha dong la chat long chay qua cot vdi mot tdc do;
nhat dinh du6 i ap suat cao, con pha tlnh la mot chat ran ducfi dang hat min
hoac chat long duac bao tren mot chit mang ran, hoac mot cha't mang ran da
duoc lien ket hoa hoc v6 i cac nhom huu ca. Pha dong cung v6 i mlu thir duac
bom qua cot du6 i ap sua't cao, cac chat phan tich se di chuyen theo pha dong
qua cot v6i toe do khac nhau tuy theo ai luc ciia chung v6 i hai pha va dan den
su tach cac chat. Cac chat sau khi ra khoi cot duoc nhan biet b6 i bo phan phat
hien la detector. Qua trinh sac ky dua tren co che hap phu, phan bo, trao doi
ion hay ray phan tir la tiiy thuoc loai pha tinh sir dung.
1.4.2. Cac dai lirang dac trirng
sign al
C o mp o n en t
C om p o n e n t
H inhl: Sac ky do cua hai chat va cac thong so dac trung
•Thời gian lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột cho
đến khi chất tan ra khỏi cột sắc ký đạt giá trị nồng độ cực đại, tới detector và
cho pic trên sắc ký đồ.
Nếu gọi ĩr là thời gian lưu giữ của một chất thì:
Trong đó: Ir là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực).
to là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (thời gian

• Hệ số chọn lọc a:
Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau khi chúng có giá trị k khác nhau, hệ
số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký:
_ ^RB ~ ^ 0 — ^RB
^RA ~ h Ìr A
Theo qui ước, ở đây B là chất lưu giữ mạnh hơn A, vì vậy a luôn lớn hơn
1, a càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Để tách riêng hai chất
thường chọn 1,5 < a < 2,0.
• Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết:
Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột
(N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H).
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức:
N=16x
2
=5,54x
ị ]
^Wj
Trong đó; w là chiều rộng đo ở đáy pic
w 1/2 là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao pic.
Nếu cột sắc ký có chiều dài là L thì ta có biểu thức:
h4
N
Cột có N lớn (hay có H nhỏ) là cột có hiệu lực cao.
• Độ phân giải Rgi
Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trong cùng
một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính như sau:
_ 2 X ịtiịg —Íra)_ 8X )
' w,+w, K2(a) + K2(.)
CÓ thể xác định Rs theo phương trình khác: Rç X X —
4 a I + kg

- Detector phát hiện quang phân tử.
- Detector phổ nguyên tử.
- Detector huỳnh quang.
- Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng).
- Detector chiết suất.
- Detector đo độ dẫn nhiệt.
Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector cho phù hợp
để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất. Trong các loại trên, thì
detector hấp thụ quang phân tử hiện nay đang được dùng phổ biến nhất.
5.Trang bị chỉ thị kết quả: ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến
nhất là máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng pic.
Đó là 5 bộ phận cần thiết tối thiểu cần phải có của một hệ thống HPLC.
Hình 2: Sơ đồ khối hệ thống HPLC hoàn chỉnh
1.4.4. Pha tĩnh trong HPLC
• Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất
phân tích. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ,
đường kính cỡ hạt từ 3-10 ịiim, diện tích bề mặt riêng từ 50 — 500 mVg-
• Phân loại pha tĩnh:
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử.
Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong
kỹ thuật HPLC.
- Căn cứ theo trạng thái rắn hoặc lỏng của pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là chất
rắn, người ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC). Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc
ký lỏng-lỏng (LLC).
- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó
làm hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp chỉ ở lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt).
• Điều kiện đối vói một pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những

Tốc độ dòng pha động
pH của pha động.
1.4.6. Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động
Cách chọn pha tĩnh và pha động thích hợp để tách được hỗn hợp chất cần
phân tích là rất quan trọng. Dựa vào tính chất của mỗi pha đã nêu trên người ta
chọn pha tĩnh, pha động phù hợp nhau, chẳng hạn:
- Sắc ký pha thuận: Pha động là các dung môi hữu cơ kị nước, không
phân cực hay ít phân cực. Cột hay sử dụng là cột Lichrosorb Si 60.
- Sắc ký pha đảo: Pha động là hệ dung môi phân cực, các dung môi tan
được trong nước, điển hình là methanol, acetonitril. Nói chung dung môi cho
hệ pha đảo là nước cất, alcol Ngoài các dung môi chính còn có các dung
dịch đệm pH (hay sử dụng dung dịch đệm phosphat) để ổn định cho quá trình
sắc ký. Sắc ký pha đảo thường dùng để tách các chất phân cực. Có nhiều cột
để lựa chọn, loại thường sử dụng là cột alkyl hoá Cg, Cj8 với các tên thương
phẩm khác nhau. Tuỳ theo điều kiện cơ sở và phương pháp tiến hành thí
nghiệm mà người ta chọn loại cột thích hợp
Việc lựa chọn pha tĩnh và pha động phù hợp với chất phân tích có tính
chất quyết định đối với quá trình sắc ký, do đó cần lựa chọn, thay đổi sao cho
phù hợp để việc phân tích đạt kết quả cao nhất. Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến
chi phí khi lựa chọn pha tĩnh và pha động.
1.4.7. Cách đánh giá pic
• Đánh giá diện tích pic: Để tính diện tích pic, người ta có thể dùng tích
phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn trong chương trình.
• Đánh giá chiều cao pic: Phương pháp này áp dụng khi k hằng định. Đo
chiều cao pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.
1.4.8. Cách tính kết quả
• Phương pháp ngoại chuẩn: Dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử
trong cùng điều kiện. Kết quả mẫu thử được tính toán so với mẫu chuẩn đã
biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.
• Phưcỉng pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và

- Máy lắc siêu âm-SONOREX
- Máy đo PH Meter 3305-Jenway
- Cân phân tích Mettler AB 204 độ chính xác 0,1 mg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức 1000,0ml; 100,0ml; 50,0ml;
25,0ml; 2 0 ,0 ml; 10,0ml; ống đong, pipet chính xác, pipet thưòỉng, cốc có mỏ
và các dụng cụ thuỷ tinh khác.
2.1.2. Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu.
a. Đối tượng nghiên cứu
Viên nén Decolgen do công ty United Pharma sản xuất có công thức:
Paracetamol ; 500mg
Phenylpropanolamin.HCL ; 25 mg
Clorpheniramin maleat : 2 mg
(Tá dược: Tinh bột, Povindon, Natri tinh bột Glycolat, Magnesi Stearat,
D&c Yellow #10, D&c Red # 22, D&c Red # 33).
Mẫu 1 có số kiểm soát; 402221
Mẫu 2 có số kiểm soát: 404971
b.Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời PA, PH
và CM trong viên nén Decolgen. Để xây dựng chương trình sắc ký thích hợp,
chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn các điều kiện sau:
Kiểu sắc ký áp dụng
Cột tách sử dụng
Các điều kiện về pha động (thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng) để cho kết
quả tách tốt nhất
Bước sóng thích hợp phát hiện ba chất.
• Để đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành:
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất
Khảo sát độ chính xác của phương pháp
Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn.

• Qua tham khảo tài liệu và nghiên cứu tính chất hoá lý của các chất phân
tích PH và CM là các muối base hữu cơ, PA có tính acid nên đều là những
chất có tính phân cực, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký pha đảo để phân tích.
Với điều kiện sẵn có của bộ môn, chúng tôi chọn cột Nucleosil C18 trong quá