BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Các giai đoạn của 1 phản ứng PCR……………………………………17
Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ
đường nền…………………………………………………………………………… 20
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 1
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner,
Kleinerfelter trong chẩn đoán trước sinh. Thai nhi mắc hội chúng Patau (trisomy 13)
…………………………………………………………………………………… 23
Hình 4. Lấy máu ngoại vi ở người lớn………………………………………….24
Hình 5. Lấy máu ngoại vi ở trẻ…………………………………………………24
Hình 6. Cấy máu……………………………………………………………… 25
Hình 7. Dung dịch Demecolcine……………………………………………… 26
Hình 8. Ly tâm 1800 rpm trong 8 phút………………………………………….26
Hình 9. Nhỏ KCl vào mẫu trong ống ly tâm………………………………… 26
Hình 10. Nhỏ axit acetic vào mẫu đã được ly tâm………………………………27
Hình 11. Sau khi cho dung dịch carnoy vào lần 2………………………………27
Hình 12. Dung dịch có màu trắng khi nhỏ dung dịch Carnoy lần 3…………….27
Hình 13. Nhỏ lame (kiểu nhỏ ngang)………………………………………… 28
Hình 14. Nhỏ lame cao (kiểu nhỏ cao)………………………………………….28
Hình 15. Nhuộm lame bằng Giemsa: buffer…………………………………….28
Hình 16. Quan sát NST dưới kính hiển vi………………………………………29
Hình 17. Ống type được đánh số theo mã số của ống chứa dịch ối…………….31
Hình 18. Mẫu được lắc ủ 99
0
C 800rpm trong 10 phút………………………….31
Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc………………………………….31
Hình 20. Nhỏ dung dịch wash buffer type 6………………………………… 31

CHỮ VIẾT TẮT
CHỮ VIẾT TẮT NỘI DUNG
NST Nhiễm sắc thể
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 4
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
LỜI MỞ ÐẦU
Trong sự phát triển của mỗi quốc gia hiện nay, ngành Y nắm một vai trò vô cùng
quan trọng. Không những đóng góp to lớn cho nền kinh tế mà ngành Y còn góp phần
củng cố mặt đời sống nhân sinh cho quốc gia đó. Với một quốc gia khỏe mạnh về thể
chất người lao động, quốc gia đó mới có chỗ dựa vững chắc để phát triển mạnh mẽ nền
kinh tế của mình.
Cùng với sự tiến triển của khoa học, bệnh di truyền ngày càng được mọi người
chú ý. Theo thống kê của nhi khoa, gần 20 năm nay, tỉ lệ trẻ em chết vì bệnh di truyền
đã giảm mạnh, cò tỉ lệ trẻ phát bệnh và tỷ lệ tử vong do dị tật bẩm sinh và bệnh di
truyền dần dần tăng cao.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 5
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Trong quá trình phát triển tự nhiên của nhân loại, do ảnh hưởng của các nhân tố,
làm cho chất di truyền trong cơ thể biến đổi. Trong những biến đổi này có một loại
biến đổi về con số và kết cấu của nhiễm sắc thể nhân tế bào được gọi là dị dạng nhiễm
sắc thể, một loại khác là đột biến gen. Vì vậy tất cả bệnh do nhiễm sắc thể và gen trong
nhân tế bào biến dạng gây cản trở cho sự thay thế, gây ra sự thiếu hụt dung môi có liên
quan dẫn đến cơ thể di truyền sang đời sau, tạo nên sự hỗn hợp về sinh lý nhân thể, cơ
năng sinh hóa, gây cản trở quá trình thay thế, loại bệnh này uy hiếp sức khỏe của con
người. Vì thế việc xét nghiệm sớm trước sinh là việc rất quan trọng nhằm ngăn chặn
việc sinh con bị tật gây nên gánh nặng cho gia đình và xã hội.
Với nội dụng thực tập tốt nghiệp: “một số kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán các
bệnh” tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM. Chúng em đã

+Nhập liệu: Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng
mẫu.
Lấy mẫu
Kiểm tra
Nhập liệu
Thực hiện xét nghiệm
Trả về nơi giới thiệu hoặc điều trị chuyên khoa
Tư vấn
Kiểm tra kết quả
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 7
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Ra kết quả
Lưu hồ sơ
Kết thúc
Nhập kết quả
Không đạt
Đạt
Không đạt
Đạt
+Thực hiện xét nghiệm: Thực hiện xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật xét
nghiệm nhiễm sắc thể đồ máu gồm các bước nuôi cấy 72 giờ, thu hoạch và chuẩn
bị lam 2 ngày, đọc và phân tích.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 8
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
+Ra kết quả xét nghiệm.
+Kiểm tra kết quả, nếu không đạt thì lấy mẫu lại.
+Nhập kết quả xét nghiệm và in phiếu trả kết quả qua phần mềm nhiễm sắc
thể đồ máu cho bệnh nhân.

Xét nghiệm karyotube hay Lập bộ nhiễm sắc thể là xét nghiệm khảo sát bộ nhiễm
sắc thể trong 1 tế bào. Xét nghiệm được thực hiện bằng cách nuôi cấy tế bào trong môi
trường đặc biệt. Sau thời gian thích hợp tế bào được thu hoạch và được nhuộm đặc
trưng. Kỹ thuật nhuộm hiện nay là GTG (Giemsa trypsin G-banding).
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
10
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Người bình thường có 46 nhiễm sắc thể, chia thành 22 cặp thường và 1 cặp giới
tính. Mỗi cặp có kích thước, hình dạng và cấu trúc đặc trưng.
Sau khi nhuộm, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể được khảo sát
bằng kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần và được phân tích, xếp thành bộ hoàn chỉnh
bằng phần mềm chuyên dụng.
Loại mẫu có thể sử dụng cho kỹ thuật này gồm: máu, dịch ối, gai nhau, dây rốn,
máu dây rốn.
Karyotube được chỉ định xét nghiệm cho tất cả các đối tượng nghi ngờ bị rối
loạn di truyền, dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần, vô sinh – hiếm muộn, sẩy
thai liên tiếp…
Tiêu chuẩn để xếp loại nhiễm sắc thể trong lập karyotube
Lúc đầu người ta chỉ căn cứ vào chiều dài của NST để căn cứ và đặt tên cho
chúng từ 1 đến 23 theo thứ tự từ dài đến ngắn (công ước Denver 1960), nhưng ngay
sau đó cũng năm 1960 Patau không đồng ý và đề xuất thêm tiêu chuẩn vị trí phần tâm,
sau này được quốc tế chính thức chấp nhận.
Phân loại nhiễm sắc thể
Ở người bộ NST 2n = 46 trong đó có 22 cặp NST thường (autochromosome) và 1
cặp NST giới tính (sex chromosome). Dựa vào đặc điểm hình thái như độ dài, vị trí
tâm động người ta sắp xếp các NST thành từng nhóm. 46 NST người được chia thành
7 nhóm, kí hiệu là A, B, C, D, E, F và G trên nguyên tắc dài trước ngắn sau, nếu các
NST bằng nhau thì tâm giữa đặt trước, tâm lệch đặt sau:
-Nhóm A có 3 cặp NST có kích thước lớn nhất, gọi tên từ số 1 đến 3, cặp số 1

đoạn cuối kép, mất đoạn giữa.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
12
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
-Chuyển đoạn (Translocation) Chuyển đoạn là hiện tượng trao đổi các đoạn của
NST. Chuyển đoạn NST đã được xác định là hay gặp nhất trong rối loạn cấu trúc của
NST [63]. Có hai kiểu chuyển đoạn là chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal translocation)
và chuyển đoạn hòa hợp tâm (Robertsonian translocation).
-Lặp đoạn (duplication) là hiện tượng một đoạn nào đó của NST được nhân đôi
lên. Lặp đoạn xảy ra khi 2 NST tương đồng ghép đôi với nhau không tương xứng
trong kỳ đầu của phân bào giảm phân, có sự đứt của 2 NST và trao đổi đoạn giữa 2
đoạn khác nhau của 2 NST trong cặp tương đồng. Trong trường hợp này có 2 NST bị
thay đổi cấu trúc, nhưng không mất đi hoặc tăng thêm vật liệu di truyền trong tế bào.
Khi các NST trong cặp tương đồng này phân ly nhau trong giảm phân sẽ tạo ra hợp tử
mang NST lặp đoạn (trisomi từng phần) hoặc NST thiếu một đoạn có liên quan
(monosomi từng phần)…
-Đảo đoạn (invertion) là sự bất thường cấu trúc do NST bị đứt ở hai điểm, đoạn
giữa hai điểm đứt quay ngược 1800 rồi nối lại, do đó một số gen bị đảo ngược thứ tự
so với đoạn ban đầu. Có ba kiểu đảo đoạn: đảo đoạn ngoài tâm, đảo đoạn quanh tâm
đối xứng, đảo đoạn quanh tâm không đối xứng.
+Đảo đoạn ngoài tâm: hai chỗ đứt ở cùng một nhánh của NST và đoạn đảo
không chứa tâm, NST không thay đổi hình thái.
+Đảo đoạn quanh tâm đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh và cách đều tâm, NST
không thay đổi hình thái.
+ Đảo đoạn quanh tâm không đối xứng: hai chỗ đứt ở hai nhánh, khoảng cách
tâm không đều nhau, NST có cấu trúc lại và thay đổi hình thái.
1.2.2.Sinh học phân tử
1.2.2.1.QF-PCR
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang

GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
14
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự
sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là
94-95
0
C trong vòng 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính.
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt
cặp với khuôn. Các mồi được thiết kế sao cho đầu 3
’
định hướng đoạn trình tự cần
nhân nên quá trình tổng hợp ADN sẽ diễn ra trên cả hai mạch, qua suốt vùng trình tự
đó; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40
0
C – 70
0
C, tuỳ thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai.
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72
0
C giúp cho DNA polymerase sử dụng
vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. ADN polymerase gắn vào
đầu 3
’
tự do của mồi và sử dụng dNTP để tổng hợp các mạch mới theo chiều 5
’
– 3
’

phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu
quả cao.
+Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF)
và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh
động của chúng khác nhau.
1.2.2.2.Real time PCR (xét nghiệm HPV)
Siêu vi sinh dục papilom ở người (Human Papillomavirus) còn gọi là siêu vi
HPV, là siêu vi thông thường gây nhiễm trùng tế bào da. Thông thường, cơ thể sẽ tự
chống lại siêu vi HPV trước khi chúng có thể gây ra những vấn đề sức khỏe. Vì lý do
này, hầu hết những người bị nhiễm siêu vi HPV không có triệu chứng và không biết
mình đã bị nhiễm bệnh. Nhưng đôi khi cơ thể không tự chống lại siêu vi HPV. Trong
những trường hợp này, siêu vi HPV có thể gây ra các vấn đề cho sức khỏe, như: Mụn
cóc sinh dục ở đàn ông và phụ nữ; ung thư cổ tử cung ở phụ nữ; những loại ung thư ít
phổ biến khác ở đàn ông và phụ nữ, như ung thư hậu môn.
Siêu vi HPV làm cho những tế bào bình thường trong cơ thể trở nên bất thường.
Người ta không thể nhìn thấy hay cảm thấy những tế bào bất thường này. Hầu hết các
trường hợp, cơ thể sẽ tự chống lại siêu vi HPV và các tế bào sẽ trở lại bình thường.
Nhưng nếu không thì siêu vi HPV có thể biến tế bào thành ung thư theo thời gian. Sau
nhiều năm thì ung thư mới phát triển ở một người bị nhiễm siêu vi HPV. (Nguồn:
Marina D.M Lima
a

, b
, Paulo Henrique Braz-Silva
a

, c
, Sônia M. Pereira
d

được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện
di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình
được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong
một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết
của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ.
Phân tích tổng quát một phản ứng Real-time PCR
Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong
khuếch đại mẫu. Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu
huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại
trong tube, được trình bày trong trục y.
Đường cong khuếch đại có 2 pha, 1 pha hàm mũ được tiếp theo bởi một pha ổn
định. Trong suốt pha hàm mũ, số lượng PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy
nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm cho một
hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm nàu phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn
định (các chu kỳ 28-29).
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
18
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Hình 2.
Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền
Đầu tiên tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền, và việc tăng tín hiệu huỳnh
quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18) cho dù sản phẩm tích lũy theo
hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép
phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu
kỳ ngưỡng (C
T
). Do đó giá trị C
T
được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản

quang, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc
thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu và chính xác. FISH đặc biệt có hiệu quả trong việc
phát hiện những mất đoạn gen nhỏ (microdeletion), hoặc để khẳng định nguồn gốc của
các loại chuyển đoạn đặc biệt.
Ngoài ra interphase FISH (FISH nhanh) còn được sử dụng rộng rãi trong chẩn
đoán trước sinh, để phát hiện những bất thường số lượng của một số nhiễm sắc thể
thường gặp (13,18,21,X,Y)
Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp sau: Chẩn đoán trước sinh các
bất thường số lượng NST ở thai nhi, phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
20
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
truyền, xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc, phát hiện các bất thường
nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư.
Kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh:
Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử dụng để sàng lọc một số hội
chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy
13), hội chứng Edward (trisomy 18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng
Kleinerfelter (XXY)… với ưu điểm:
-Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối. Hoàn
thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày. Chú ý: Các quyết định
đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào một mình kết quả FISH
-Độ chính xác cao
-Yêu cầu chỉ 10-20ml dịch ối.
-Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai nhau.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
21
LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner,

-Bước 2: Kiểm tra
Kiểm tra mẫu máu lấy có đạt yêu cầu thực hiện xét nghiệm không.
-Bước 3: Nhập liệu
Nhập thông tin bệnh nhân và bệnh phẩm, ghi nhận chất lượng mẫu
-Bước 4: Thực hiện xét nghiệm:
Cấy mẫu -> Thu hoạch -> Nhỏ lam -> Nướng lam -> Nhuộm lam -> đọc
lam, phân tích kết quả.
+Cấy mẫu:
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
23
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Hút 0,5 -1 ml máu (hút lấy phần trắng ở giữa các tế bào máu và huyết tương khi
máu đã tách lớp) cho vào 8ml môi trường nuôi cấy sau đó đậy kín để tủ ấm 37
0
C trong
3 ngày.

Hình 6.
Cấy mẫu
+Thu hoạch:
Nhỏ 100μl dung dịch demecolcine vào mỗi ống máu, ủ ở 37
0
C/ 30 phút (trong
máy lắc ổn nhiệt đảm bảo demecolcine hòa tan hết trong máu), lấy ra ly tâm 1800 rpm
trong 8 phút rồi hút bỏ dịch nổi.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang
24
LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ