BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG S02 VÀ ẢNH HƯỞNG
CỦA QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN ĐẾN THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ
MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NGƯU TÂT
* Người hướng dẫn: - TS. vũ VẢN ĐIL*,
- PGS.TS. BÙI THỊ BẰNG
* Nơi thực hiện: - TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
-VIỆN DƯỢC LIỆU
* Thời gian thực hiện: 08/2003-05/2004
NGUYỄN TRƯỜNG LÂP
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩKHOÁ ỉ 999
Hà Nội, tháng 05/2004
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn:
TS. VŨ VĂN ĐIỀN
PGS -TS .BÙI THỊ BẰNG
Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều công sức và thời
gian truyền thụ những kiến thức quý báu, hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khoá luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các bác,
các cô, chú, anh, chị đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực khoá luận:
BS.CKI. Lê Xuân Ấi-Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc
Hà Nội.
TS. Trần Minh VỊnh-PGĐ Trung tâm nghiên cứu phòng chống ưng thư
TS. Lê Kim Loan- Viện Dược Liệu
DS. Nguyễn Thị Phương - Viện Dược Liệu
DS. Nguyễn chiến Binh- Viện Dược Liệu
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo và các cán bộ nhân viên
bộ môn Dược Học c ổ Truyền, khoa Hoá phân tích-Tiêu chuẩn Viện Dược
Liệu, cùng toàn thể bạn bè và người thân đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành

2.2.4. Thử tác dụng chống đông máu của dược liệu Ngưu tất

34
2.3. BÀN LUẬN KẾT QUẢ
37
PHẨN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT41
BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
MO: Mẫu dược liệu không xông sinh, sấy khô ở 60°c.
* Các mẫu xông sinh với tỷ lệ sinh khác nhau:
Ml: Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 0.5kg/tạ.
M2: Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ lkg/tạ.
M3: Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ.
M4: Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 3 kg/tạ.
* Các mẫu xông sinh với lượng 1.5 kg/tạ ở các thời gian xông khác nhau:
Tl: Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ trong 4h.
T2: Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ trong 12h.
\ T3: Mẫu dược liệu xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/tạ trong 24h.
* Các mẫu xộng sinh trong lò được phủ kín bằng cót:
í M10: Mẫu dược liệu không xông sinh sấy khố. ) Yc 5 ^ '*> ?-£?
Mil: Mẫu dược liệu vừa xông sinh xong, tỷ lệ 1.5 kg/tạ.
MI2: Mẫu dược liệu xông sinh sấy khô với tỷ lệ 1.5 kg/tạ.
* Các mẫu xông sinh trong lò được phủ kín bằng nilon:
M20: Mẫu dược liệu không xông sinh sấy khô.} 1 1 ọ
M21: Mẫu dược liệu xông sinh không rửa sấy khô với tỷ lệ 1.5 kg/tạ.
M22: Mẫu dược liệu xông sinh rửa sau sấy khô với tỷ lệ 1.5 kg/tạ.
* Các mẫu mua trên thị trường:
MTQ1: Mẫu dược liệu của Trung Quốc mua tại công ty Dược Liệu TWII.

Để đạt được các mục tiêu trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
- Nghiên cứu bảo quản Ngưu tất sau khi sơ chế.
- Theo dõi sự thay đổi hàm lượng một số thành phần hoá học và lưu huỳnh tổng số.
- Nghiên cứu phương pháp định lượng so 2 tồn dư trên Ngưu tất.
- Thử tác dụng chống đông máu của ngưu tất sau sơ chế và bảo quản.
PHẦN I : TỔNG QUAN
1.1. Tóm tắt đặc điểm của vị thuốc Ngưu tất
1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bô và thu hái:
Vị thuốc Ngưu Tất là rễ phoi hay sấy khô của cây Ngưu Tất: Achyranthes
bidentata Blume; họ rau giền Amaranthaceae.
Cây thuộc thảo cao lm, thân mảnh, lá mọc đối, hình trứng, đầu nhọn, mép
lá nguyên dài 5-12 cm, rộng 2-5 cm. Cụm hoa là bông ở đầu cành hay kẽ lá.
Hoa mọc hướng lên trên nhưng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả
nang, lá bắc còn lại và nhọn thành gai cho nên vướng phải có thể mắc vào
quần áo.
Cây mọc ở Trung Quốc, Việt Nam và các nước Đông Nam Á. Trồng bằng
hạt, ở đồng bằng thì trồng vào tháng 9-10, thu hoạch vào tháng 2-3. Vùng
miền núi thì trồng vào tháng 2-3, thu hoạch vào tháng 9-10. Muốn lấy giống
thì cây sau khi thu hoạch, cắt bớt rễ, cắt bớt thân và trồng lại khoảng 4 tháng
nữa mới lấy hạt.
Năng suất hiện nay khoảng 1.2 tấn một hecta [1,5].
1.1.2. Thành phần hoá học:
Rễ có chứa saponin, khi thuỷ phân cho sapogenin là acid oleanolic. Ngoài
ra còn có ecdysteron và inokosteron, glucose, galactose, rhamnoza, muối kali
[1,9,5] và một số thành phần khác như betain, polysaccharide, emodin,
physcion [17,5].
Gần đây một saponin Triterpen mới được chiết tách từ Ngưu tất là
bidentatoside [23].
1.1.3. Công dụng [2,3,9,12,5]:
♦ Tính vị, quy kinh:

♦ Tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây mất trí nhớ trên chuột bằng
scopolamin và MK-801 [22]
1.1.5. Chế biến và bào chế:
♦ Chế biến [1,14]:
Dược liệu sau khi thu hoạch có nhiều cách chế biến khác nhau tuỳ theo
từng vùng, từng địa phương:
♦ Rửa sạch bùn đất, phơi sấy khô.
♦ Cắt bỏ rễ con, rửa sạch, xông sinh một đêm, phơi hay sấy khô ở nhiệt độ
40-50°C đến thuỷ phần 15-18%, phân loại, bó thành từng bó để bảo quản.
♦ Dũ sạch đất, phơi héo đem xông sinh cho mềm, rửa sạch phơi khô nhăn vỏ,
xông sinh lại để bảo quản, độ ẩm < 13%.
♦ Qua khảo sát thực tế tại xã Yên Ninh - Hưng Yên, Ngưu tất sau khi thu
hoạch chặt bỏ phần thân phơi nắng trong một ngày, rửa sạch, để ráo nước
đem xông sinh với tỷ lệ 1.5 kg/ tạ, sau khi xông sinh xong để Ngưu tất
trong lò, lấy bao tải đậy kín và cứ 2-3 tuần lại xông sinh 1 lần để bảo quản
vnfi lưrinơ sinh 200 g/ltạ dược liệu, khi bán thì lấy ra để đem bán.
Khi sử dụng làm thuốc người ta phải qua khâu bào chế cổ truyền. Có nhiều
phương pháp bào chế khác nhau, tuỳ theo mục đích điều trị mà chọn phương
pháp chế biến thích hợp như: Ngưu tất thái dùng sống, Ngưu tất trích rượu,
Ngưu tất trích muối, Ngưu tất sao cám, Ngưu tất thán sao, Ngưu tất sao đen.
1.2. Diêm sinh:
1.2.1. Nguồn gốc:
Diêm sinh còn gọi là sinh, diêm vàng, hoàng nha, lưu hoàng, thạch lưu
hoàng, oải lưu hoàng, tên khoa học là sulfur - là một nguyên tố có sẵn trong
thiên nhiên hay do chế từ những hợp chất có chứa lưu huỳnh trong thiên
nhiên. Lưu huỳnh có thể tồn tại dưới dạng tự do, hay sunphua như: pyrit,
sunphua kẽm, hoặc sunphua các kim loại khác, sunphua hydro 1Tuỳ theo
nguồn gốc và cách chế biến khác nhau, lưu huỳnh có khi là bột màu vàng, có
khi là những cục to không đều màu vàng tươi, hơi có mùi đặc biệt, ít tan trong
nước, trong rượu và ete, tan nhiều hơn trong dầu. Khi đốt lên cháy với ánh lửa

là 0,5 mg/m3 không khí và trung bình trong một ngày đêm 0.05 mg/m3 không
khí đối với khu nhà ở và đối với nơi sản xuất là 10 mg/m3.
Không khí bị nhiễm anhydrit suníurơ gây kích thích niêm mạc, ho, khó
thở, xâm nhập đường tiêu hoá gây buồn nôn. Con người có thể nhận biết được
mùi anhidrit suníurơ trong khí quyển ở nồng độ rất thấp 8 mg/m3 [11]
1.3.2. Phương pháp định lượng SƠ2 :
Trên thế giới một số tác giả đưa ra phương pháp định lượng S02 bằng
phương pháp sắc ký lỏng cặp ion pha đảọ kết hợp với quang phổ tử ngoại hoặc
phương pháp sắc ký ion loại trừ (ion- exclusion chromatography) với bộ phát
hiện (detector) điện hoá. Việc áp dụng các phương pháp này còn gặp nhiều
khó khăn về thiết bị [24].
Khi sơ chế dược liệu bằng phương pháp xông sinh, dư lượng S02 trên dược
liệu vượt quá mức cho phép gây ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.Vấn đề
này mới được quan tâm trong mấy năm gần đây. Vì vậy, cho đến nay trong
các chuyên luận dược liệu của Dược điển các nước chưa có phương pháp định
lượng S02 trong dược liệu.
Trong Dược điển Việt Nam III có dẫn một phương pháp định lượng S02
mới - có khả năng áp dụng được đối với dược liệu. Trong phương pháp này
S02 được làm bay hơi ra khỏi mẫu phân tích bằng hơi nước. Vì vậy mầu sắc
của dược liệu không ảnh hưởng đến quá trình chuẩn độ [4].
1.3.3. Sự cần thiết phải xây dựng phương pháp định lượng S 0 2:
Xông sinh không chỉ là một biện pháp diệt sâu mọt, nấm mốc trên dược
liệu mà còn làm cho dược liệu có hình thức đẹp nên được dùng rộng rãi ở các
địa phương.
Nhiều dược liệu sau khi thu hái để bảo quản người ta thường xông sinh
khói lưu huỳnh. Trong quá trình xông sinh, phần lớn lưu huỳnh oxy hoá tạo
thành S02 bám vào dược liệu có tác dụng diệt khuẩn, tẩy trắng dược liệu. Tuy
nhiên dư lượng S02 trong dược liệu vượt quá mức cho phép sẽ ảnh hưởng đến
sức khoẻ của người dùng. Việc định lượng S02 trong dược liệu hầu như chưa
có tài liệu nghiên cứu. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu để có thể đưa ra

-►Thrombin
(5)
Yếu tố hoạt hoá
Plasminogen
(2)
(2)
VIII
Fibrinogen — Fibrin
Chuyển dạng
► Hoạt hoá
Ca
2+
(1 )Coumarin và dẫn chất
(2)Heparin (thuốc có tác dụng ức chế sự tạo thành và hoạt động của thrombin)
(3)Heparin liều thấp làm tăng tác dụng của Antithrombin III
(4)Thuốc ức chế ngưng tập tiểu cầu
Plasmin M

Plasminogen
(7)
(6)
Fibrinogen

► sản phẩm tiếu fibrin
(bền vững)
(5)Thuốc kích thích tiêu fibrin
(6)Thuốc Thrombolytic-streptokinase
(7)Thuốc Thrombolytic-urokinase
o
Theo cách phân chia của Howell (sơ đồ 2) quá trình đông máu được chia

Là thời gian tạo thành sợi Fibrin (sợi huyết) sau khi đã cho một lượng thừa
Thrombin vào huyết tương citrat hoá.
Thuốc có tác dụng chống đông máu phải có tác dụng ức chế hoạt hoá đông
máu, kéo dài thời gian đông máu.
PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU:
2.1.1. Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu:
> Nguyên liệu:
Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu gồm có:
- Rễ Ngưu tất tươi thu hoạch ở Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây
thuốc Hà Nội (Viện Dược liệu). Dược liệu được chia làm 2 loại:
+ Các mẫu Ngưu tất không xông sinh (Sau khi thu hoạch được rửa sạch và
sấy khô): MO, M10, M20.
+ Các mẫu xông sinh: Ml, M2, M3, M4, Tl, T2, T3, Mil, M12, M21, M22.
- Các mẫu Ngưu tất trích muối, trích rượu, c h1 o
- Các mẫu Ngưu tất mua trên thị trường Hà Nội tháng 3/2004.
> Hoá chất, thuốc thử:
Cồn tuyệt đối, acid sulfuric72%, KOH, dung dịch HC1 0.5N, ortho-
toluidin, Thioure, chỉ thị methyl da cam, HC1 đậm đặc, H202, chỉ thị xanh
bromo thymol, dung dịch NaOH 0.1N đạt tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam
III. Thromboplastin, Cephalin- kaolin, dung dịch CaCl2, Thrombin của hãng
Stago (Pháp).
> Thiết bị:
- Máy đo độ ẩm Precisa MA30Ò thụy Sĩ. V
- Máy quang phổ ƯV_VIS cary 1E của hãng Varian (Mỹ).
- Cân phân tích Sartorius Thuỵ Sĩ.
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm:
2.1.2.1. Phương pháp bảo quản Ngưu tất sau sơ chế:
Các mẫu dược liệu Ngưu tất MO, Ml, M2, M3, M4, Tl, T2, T3 sấy khô ở

Hàm lượng saponin (tính theo acid oleanolic) được tính theo công thức:
c. Xác định hàm lượng lưu huỳnh tổng số:
Thực hiện tại phòng Phân tích môi trường-Viện công nghệ môi trường.
Định lượng theo phương pháp cân.
Nguyên tắc:
Mẫu được nghiền nhỏ và vô cơ hoá bằng phưởng pháp kiềm chảy với
Na2C03. Hỗn hợp nóng chảy được lấy bằng nước cất nóng, acid hoá bằng HC1
và dùng để định lượng lưu huỳnh dưới dạng BaS04 bằng phương pháp trọng
lượng (AOAC official method 955.48- 1955).
2.I.2.3. Nghiên cứu định lượng S 0 2 trong dược liệu Ngưu tất:
Dựa vào phương pháp định lượng lưu huỳnh dioxyd chung trong Dược Điển
Việt Nam III chúng tôi đã cải tiến cho thích hợp với định lượng S02 trong
dược liệu, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Nguyên tắc của phương pháp:
Khí S02 được lấy khỏi mẫu dược liệu bằng hơi nước, cho hấp thụ vào
dung dịch H20 2 đã trung hoà bằng dung dịch NaOH 0.1N. Trong dung dịch
H20 2, S02 được oxy hoá tạo thành H2S04. Định lượng H2S04 tạo ra bằng dung
dịch NaOH 0.1N (CĐ) với chỉ thị xanh bromothymol (CT). Từ thể tích dung
dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ ta tính được hàm lượng S02 trong mẫu.
Dc X Pt X c ]
Trong đó: Dt: Mật độ quang ống thử.
X(%) =
Dt X Pc X 10000
Dc: Mật độ quang ống chuẩn.
Pt: Khối lượng dược liệu (g).
Pc: Lượng acid oleanolic (g).
B: Độ ẩm dược liệu (%).
Phương trình phản ứng như sau:
so2+ h 2o 2 -> h 2so4
2NaOH + H2S04 -> Na2S04 + 2H20

quản ở các điều kiện khác nhau:
❖ Bảo quản trong tải dứa ở nhiệt độ phòng bình thường. '")
❖ Bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ phòng bình thường.
❖ Bảo quản trong tải dứa phòng có điều hoà và máy hút ẩm.
Sau thời gian 3 tháng đem kiểm tra. Kết quả được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Tình trạng các mẫu sau 3 tháng bảo quản ở các điều kiện khác nhau:
STT
Tên
mẫu
Điều kiện bảo quản
-Tải dứa
-Nhiệt độ phòng
-Túi nilon
-Nhiệt độ phòng
-Tải dú
phòng
-Có đi
máy húi
ra, nhiệt độ
ều hoà và
ẩm
Độ ẩm
(%)
Khối lượng
(kg)
Độ ẩm
(%)
Khối lượng
(kg)
Độ ẩm

T3 18.61 2.1
10.16 2.4
0.90 3.1
Tinh trạng
Dược liệu mốc
nhiều
Dược liệu mềm,
dẻo, không mốc
Dược liệu khô cứng
, giòn, không mốc
thì tất cả các mẫu đều
Nhận xét:
- Bảo quản trong tải dứa ở nhiệt độ phòng bình thường
bị mốc nhanh.
- Bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ phòng bình thường thì dược liệu mềm,
dẻo, không mốc. ự r_ 9
- Bảo quản trong tải dứa ở phòng cổ điều hoà và máy hút ẩm dược liệu không
bị mốc nhưng rất khô cứng, giòn.
Bảo quản trong tải dứa ở nhiệt độ phòng bình thường. Ngưu tất đều bị mốc,
nên chúng tôi không tiến hành định lượng đường, saponin, lưu huỳnh tổng số
và không theo dõi tiếp. Còn bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ phòng bình
thường và bảo quản trong tải dứa ở phòng bình thường, có điều hoà và máy
hút ẩm Ngưu tất không bị mốc do dó chúng tôi tiến hành định lượng đường,
saponin, lưu huỳnh tổng số và tiếp tục theo dõi bảo quản.
2.2.2. Theo dõi sự thay đổi hàm lượng một sô thành phần hoá học và Lưu
huỳnh tổng số:
Tiến hành định lượng đường, saponin,^ư u huỳnh tổng số ở các mẫu Ngưu
tất: MO, Ml, M2, M3, M4, Tl, T2, T3 được bảo quản theo 2 phương pháp
khác nhau:
- Bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ phòng bình thường.

Trộn đều, nút bông và đun cách thuỷ sôi đúng 8 phút,
ấy ra làm nguội với
nước lạnh. Đo mật độ quang ở 630 nm của ống chuẩn ống thử đối với mẫu
trắn«- pív,.bf- Ẩ<ù- -9 fv* • R
♦ Định lượng saponin:
- Mẫu thử:
Cân chính xác khoảng lg bột Ngưu tất cho vào cối sứ nghiền kĩ với cồn 80°
(từng ít một), chuyển vào bình định mức 100 ml. Tráng chày cối bằng cồn 80°,
cho vào bình trên và thêm cồn đến vạch, lắc đều, lọc lấy dịch trong.
- Pha mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 0.04 g acid oleanolic, hoà tan trong cồn 80° vừa đủ
100 ml.
- Pha thuốc thử: Dung dịch Vanilin 8%: Vanilin 800
Cồn tuyệt đối 10
Acid sulfuric 72%: Nước cất 28
Acid sulfuric đặc 72
- Tiến hành:
Lần lượt hút chính xác thể tích các dung dịch thử, dung dịch chuẩn và thuốc
thử cho vào 3 ống nghiệm to như bảng sau:
ống nghiệm
Ống trắng
Ống chuẩn
Ống thử
Cồn 80°
0.5ml
Dung dịch chuẩn
0.5 ml
Dịch lọc
0.5 ml
Dung dịch vanilin 8% 0.5 ml

0.028 0.022 0.033
2 MI
14.33
10.57 12.13 1.35
6.72 2.44
9.86 5.12
1.96 2.900
1.244 1.293
3 M2 12.22
8.61 14.46
1.44
6.86 4.43 9.87
6.49
3.25
3.660 4.010 1.866
4
M3 11.38
10.56 10.44 1.28
10.40
3.77 10.03 6.50
2.20 4.090
2.643 3.730
5 M4
12.40
10.64 12.33
1.49
6.26 4.38
10.04 5.04
2.60 4.950
4.117

5.76 2.77
3.470 2.361
2.776
Sự thay đổi
(% tăng hoặc giảm so với ban đầu; c
'
.

\ c'
. ĩ k y .
"Ỵ
(386.7/
> N
24SJ,
{ l ệ
31.9:
20.0
Bảng 2: Hàm lượng đường, saponin, Lưu huỳnh tổng ở các mẫu bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ phòng
Đường tự do(%)
Saponin(%)
Lưu huỳnh tổng(mg/g)
■ Trung bình đợt 0
□ Trung bình đợt 1
□ Trungbình đợt 2
Hình l:Hàm lượng trung bình đường tự do, saponin, lưu huỳnh tổng ở cấc
Nhận xét:
- Dược liệu không bị mốc.
- Hàm lượng đường tự do ở mẫu không xông sinh cao hơn mẫu xông
sinh.
- Hàm lượng saponin ở mẫu không xông sinh và mẫu xông sinh khác nhau

1.31
1.44 4.66
2.43 9.87 6.44 2.87
3.660 4.711 5.694
4 M3
11.38 1.11
0.97 1.28
6.47 2.05 10.03 5.87 2.75
4.090 4.758 5.355
5
M4 12.40
1.36 1.25 1.49 9.59
1.88
10.04 6.67 2.78 4.950
4.490 5.065
6
TI
8.17 0.66 1.05
1.35 4.56 1.40
10.07 5.57 1.97 3.610
4.216
4.439
7 T2 13.03
1.08 1.96 1.32
7.46 1.48
9.96 6.12 2.74 3.940
4.605 4.836
8
T3
10.66 1.00 1.04 1.22

Bảng 3: Hàm lượng đường, saponin, lưu huỳnh tổng ở các mẫu bảo quản trong tải dứa ở phòng có điều hoà và máy hút
.4