BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI










LƯU THỊ PHƯƠNG
PHÁT TRIỂN THUỐC TRỪ SÂU THẢO MỘC
PHÒNG TRỪ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG
(PIERIS RAPAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số : 60.42.02.01

Giảng viên hướng dẫn : TS. ðặng Xuân Nghiêm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… ii
LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn,
giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ bộ môn Sinh học
phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ Sinh học – Trường ñại học Nông
nghiệp Hà Nội
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô trường Trường ñại
học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi
suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo TS. ðặng Xuân Nghiêm ñã
dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn
thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn tới cùng thầy giáo TS.
Nguyễn Văn Giang, Kĩ sư Nguyễn Ngọc Hòa, Kĩ sư Nguyễn Khắc Hải, các bạn
sinh viên, gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều kiện ñể tôi học tập và hoàn
thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Mặc dù tôi ñã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt
tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất
mong nhận ñược những ñóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2013.

Học viên

2.1.3 Các loại enzyme chính trong dịch tiêu hóa của sâu 8
2.2 Tổng quan về các loại thực vật sử dụng trong ñề tài 20
2.2.1 Hạt gấc 20
2.2.2 Quả ớt 22
2.2.3 Xoan ta 24
2.3 Tình hình nghiên cứu thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc sinh học 25
PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.1 Vật liệu và ñối tượng nghiên cứu 29
3.1.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 29
3.1.2 ðối tượng nghiên cứu 29
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… iv
3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 29
3.1.4 Thiết bị và hóa chất sử sụng 29
3.2 Phương pháp nghiên cứu 31
3.2.1 Chuẩn bị sâu xanh bướm trắng cho nghiên cứu 31
3.2.2 Chuẩn bị dịch chiết từ thực vật 31
3.2.3 Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn cho sâu 31
3.2.4 Khảo sát hiệu lực diệt sâu 32
3.2.5 Thu dịch chiết enzyme tiêu hóa từ sâu xanh (Mehrabadi và Bandani,
2009) 32
3.2.6 Hoạt tính gây ức chế các enzyme có trong ruột sâu của các dịch chiết 32
3.2.7 Khảo sát hiệu lực diệt sâu trên cây trồng trong phòng thí nghiệm 33
3.2.8 Tách chiết quả ớt bằng các dung môi hữu cơ khác nhau 33
3.2.9 Khảo sát hiệu lực gây chết trên ñồng ruộng 33
3.2.10 Ảnh hưởng của các loại dịch chiết tới một vài chỉ tiêu nông sinh học
của cải bắp 34
3.3 Phương pháp xử lí số liệu 37

APMSF : Amidinophenyl-methane sulfonyl-fluoride.
BVTV : Bảo vệ thực vật.
CMC : Carboxymethyl cellulose.
CT : Công thức.
DMSO : Dimethyl sulfoxide.
DNSA : Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution.
GFP : Green-fluorescent protein.
LD
50
: Lethal dose 50.
LC
50
: Lethal concentration 50.
LDL : Low Density Lipoproteins.
Na 2,6D : Na 2, 6-dichlorophenol indophenol.
pHMB : parahydroxymercuribenzoate.
PMSF : Phenylmethanesulfonylfluoride.
P. rapae : Pieris rapae (L.), sâu xanh bướm trắng.
TLCK : Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone hydrochloride.
TPCK : Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone.
TRPV1 : Transient Receptor Potential V1.
TS : Tiến sĩ. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… vii

DANH MỤC BẢNG

9 Hiệu lực diệt sâu với cây trồng trong phòng thí nghiệm. 46
10 Hiệu lực diệt sâu của dịch chiết gấc và ớt khi tách chiết bằng các dung
môi khác nhau. 48
11 Hiệu lực diệt sâu ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau của dịch chiết ớt
tách chiết bằng methanol. 49
12 Hiệu lực diệt sâu ở các nồng ñộ pha loãng khác nhau của dịch chiết
gấc tách chiết bằng H
2
O. 51
13 Nồng ñộ tối ưu diệt sâu của các loại dịch chiết. 52
14 Hình ảnh thí nghiệm xác ñịnh nồng ñộ tối ưu diệt sâu của các loại
dịch chiết. 53

15 Số lượng sâu con/cây sau 4 tuần phun. 54
16 Hiệu lực diệt sâu của các dịch chiết ngoài ñồng ruộng. 55
17 Hình ảnh rau cải bắp ñang trong giai ñoạn cuốn bắp 57

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 1

PHẦN I. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Sâu và các sinh vật gây hại là những tác nhân hạn chế ñáng kể năng suất cây
trồng trên khắp thế giới. Các nhà khoa học ước tính, hàng năm, thiệt hại mùa màng
do sâu hại lên ñến 30% và con số này còn cao hơn ở các nước ñang phát triển
(Thomas và Waage, 1996). Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) là sâu hại rau họ
hoa thập tự (cruciferous vegetables) chủ yếu trên toàn thế giới, chúng trực tiếp ăn lá,

khoa học bảo vệ thực vật ñã tập trung nghiên cứu biện pháp sinh học và coi biện
pháp này là biện pháp cốt lõi trong hệ thống phòng trừ dịch hại tổng hợp.
Các nghiên cứu nhằm kiểm soát sâu hại tập trung vào 3 hướng chính: nghiên
cứu sử dụng các vi khuẩn, virus, nấm bệnh là thiên ñịch của mỗi loài sâu bệnh, nghiên
cứu sản xuất các protein ñộc cho sâu hại và côn trùng từ vi khuẩn, như Bt từ Bacillus
thuringensis (Tabashnik, 1994); nghiên cứu tạo ra các thuốc trừ sâu hại từ protein và
các hợp chất thứ sinh của thực vật như các protein ức chế enzyme tiêu hoá (PPIs) từ
một số loại hạt (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2000) hay azadirachtin và các chất có
trong dịch chiết lá và hạt cây xoan Ấn ðộ (Azadirachta indica) (Amadioha, 2000,
Dương Anh Tuấn, 2002, Montes-Molina và cộng sự, 2008). Nước ta có nguồn tài
nguyên thực vật phong phú và ña dạng, nhiều trong số này ñã ñược dùng làm thuốc
chữa bệnh (ðỗ Tất Lợi, 2006). Khả năng kháng khuẩn và kháng sâu bệnh của một số
cây thuốc cũng ñã ñược các nhà khoa học nước ta khảo sát và nghiên cứu (Lê Doãn
Liên và cộng sự, 2000, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 2000, ðặng Xuân Nghiêm, 2002).
Tuy nhiên, số lượng những nghiên cứu ñó còn rất ít ỏi so với tiềm năng ứng dụng thực
vật làm thuốc trừ sâu sinh học ở nước ta.
Vì thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện ñề tài: “Phát triển thuốc trừ sâu
thảo mộc phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae)” nhằm nghiên cứu hiệu
lực diệt và gây ngán ăn của một số dịch chiết từ các thực vật tiềm năng có hiệu lực
cao ñối với sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae). ðồng thời, nghiên cứu phối hợp
các dịch chiết/hợp chất từ các thực vật khác nhau ñể phát triển chế phẩm trừ sâu
hiệu quả hơn .
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 3

Khảo sát nhằm tìm ra loại dịch chiết từ thực vật có khả năng diệt trừ và gây


4
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 5

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về sâu xanh bướm trắng Pieris rapae (Lynnaeus)
2.1.1. Sự sinh trưởng và phát triển của sâu xanh bướm trắng
Sâu xanh bướm trắng phấn bố rộng rãi trên toàn châu Âu, Bắc Phi và châu Á
và cũng ñã vô tình ñược ñưa vào Bắc Mỹ, Australia và New Zealand. Sâu xanh có
phạm vi ký chủ rộng gồm 9 họ và 35 loài thực vật khác nhau như họ hoa thập tự, họ
cúc, họ bách hợp v.v. Tuy nhiên chúng chỉ phá hại nặng trên rau họ hoa thập tự và
là ñối tượng phải phòng trừ ở một số nước như Trung Quốc, Malaysia, Nhật Bản,
Philippin, khu vực Trung Mỹ và Australia.v.v.

TrứngẤu trùng

NhộngCon cái trưởng thành

sau của lá rau. Một bướm có thể ñẻ từ 50 - 200 trứng. Bướm sâu xanh sống khá lâu
từ 2 - 5 tuần lễ. Sâu xanh mới nở gặm chất xanh của lá rau, từ tuổi hai trở lên gặm
thủng lá rau và ăn kiệt chỉ còn gân lá. Vì vậy nếu ñể mật ñộ cao thì ruộng rau sẽ bị
trơ trụi, xơ xác. Vòng ñời của sâu xanh bướm trắng từ 26 - 30 ngày. Trong ñó giai
ñoạn trứng từ 6 - 8 ngày, sâu non 10 - 14 ngày, nhộng 7 - 8 ngày. Bướm vũ hóa sau
3 - 4 ngày thì ñẻ trứng (Lyu và cộng sự, 1995).
Sâu phát sinh và gây hại nặng từ tháng 10 năm trước ñến tháng 5 năm sau,
nhưng thường nặng nhất từ tháng 2 ñến tháng 5 vì thời tiết lúc này phù hợp với sinh
trưởng và phát triển của sâu. Sâu xanh thường tập trung và gây hại nặng ở những
ruộng rau xanh tốt (Capinera, 2008). Các nghiên cứu về sinh thái quần thể ñều cho
rằng sâu xanh bướm trắng có khả năng sinh sản và phát tán mạnh khi nhiệt ñộ thích
hợp là 29 - 31°C và chúng luôn có mật ñộ cao ở những khu có trồng xen các loại
cây có hoa hoặc nhiều cây hoa dại trên bờ ruộng.
Ở Việt Nam trước ñây sâu xanh bướm trắng có phát sinh và gây hại trên rau
họ hoa thập tự nhưng chưa nghiêm trọng. Các nhà côn trùng học ở nước ta xếp sâu
xanh bướm trắng vào hạng thứ yếu, tuy nhiên trong nhiều năm gần ñây sâu xanh
bướm trắng phát sinh gây hại nặng và ñược coi là ñối tượng phải phòng trừ ở nhiều
ruộng rau trong cả nước. Các nghiên cứu của Lê Văn Trịnh (1998) cho tới nay là
một trong những nghiên cứu khá ñầy ñủ về sâu xanh bướm trắng, và kết quả cho
thấy vòng ñời của sâu xanh bướm trắng từ 19 - 30 ngày tuỳ theo ñiều kiện nhiệt ñộ,
ẩm ñộ khác nhau. Số trứng một bướm cái ñẻ là 120,5 - 141,6 và tỷ lệ nở của trứng
là 90,2 - 95,5%. Mỗi năm có 15 lứa sâu phát sinh với khoảng cách giữa cao ñiểm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 7

hai lứa là 20 - 26 ngày. Trên ruộng rau xuất hiện mật ñộ cao từ tháng 1 ñến tháng 5
(mật ñộ lên tới 9 con/cây), thời gian khác trong năm mật ñộ sâu thấp, ñặc biệt giữa
tháng 7 tới tháng 9 (ít khi vượt quá 1 con/cây). Thời vụ gieo trồng cũng là một vấn


báo cáo. Trong giai ñoạn ñầu của nhiễm trùng, ấu trùng không hoạt ñộng và có màu
nhạt màu. Khi bệnh tiến triển, cơ thể sâu bướm biến màu vàng, và có xu hướng xuất
hiện phình to. Sau khi chết, cơ thể hóa ñen, lớp da bị vỡ, và sau ñó cơ thể bị thối rữa
(Capinera, 2008).
Các biện pháp phòng chống sâu xanh bướm trắng chủ yếu hiện nay là sử
dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học. Các loại thuốc ñược sử dụng phổ biến hiện nay
ñó là: VISERIN 4.5EC thuốc có nguồn gốc hóa học thuộc gốc Pyrethroid, Cymerin
10EC, Karate 2.5EC, Catex 1,8EC, 3,6 EC, v.v. .Ưu ñiểm của phương pháp này là
cho hiệu quả nhanh, mạnh, rõ rệt, dễ dàng sử dụng trên diện rộng và giá thành rẻ.
Tuy nhiên nếu không sử dụng ñúng cách, liều lượng, loại, thời ñiểm có thể gây tác
hại rất lớn tới chính con người và môi trường ñất, nước, không khí cùng với việc
làm giảm chất lượng nông sản ñưa ra thị trường. Hiện nay còn có các biện pháp
phòng trừ bằng các phương pháp sinh học, như thuốc trừ sâu sinh học (Vimatox 1.9
EC, Ratoin10EC, Delfin WG (32BIU), Biocin 16WP) chủ yếu dùng vi khuẩn
Bacillus thuringiensis (chế phẩm Bt), sử dụng các loại thiên ñịch (ong bắp cày).
Ngoài ra, sâu xanh bướm trắng hại chủ yếu trên lá rau, vì vậy khi phát hiện có
thể dùng biện pháp thủ công (dùng tay) giết sâu non và nhộng ñối với những vùng có
diện tích nhỏ, các biện pháp canh tác, cách ly các vùng trồng rau bị bệnh .v.v. Tuy
nhiên, các biện pháp này chưa thực sự hiệu quả và có tác dụng phòng trừ chưa cao.
2.1.3. Các loại enzyme chính trong dịch tiêu hóa của sâu
Sâu xanh bướm trắng gây hại chủ yếu trên các cây rau thuộc họ thập tự như
cải bắp, súp lơ, cải xanh, v.v. Các loại cây này chứa các vật chất hữu cơ chủ yếu là
tinh bột, cellulose, protein tương ứng với các nhóm enzyme chính cần nghiên cứu
ñó là amylase, cellulase và protease.
* Tổng quan về protease
Là nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-
NH)
n
trong phân tử protein, polypeptide ñến sản phẩm thủy phân cuối cùng là các

Protease ñược phân chia thành hai nhóm lớn là endopeptidase và
exopeptidase dựa vào vào vị trí tác ñộng trên mạch polypeptide. Exopeptidase lại
ñược phân chia thành hai loại: aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở
ñầu N tự do của chuỗi polypeptide ñể giải phóng ra một amino acid, một dipeptide
hoặc một tripeptide; carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu C
của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
Dựa vào ñộng học của cơ chế xúc tác, endopeptidase ñược chia thành bốn
nhóm:
Nhóm thứ nhất: Serine proteinase là những proteinase chứa nhóm –OH của
gốc serine trong trung tâm hoạt ñộng và có vai trò ñặc biệt quan trọng ñối với hoạt
ñộng xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin và
subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme ñộng vật như chymotrypsin,
trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin
Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt ñộng mạnh ở vùng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 11
kiềm tính và thể hiện tính ñặc hiệu cơ chất tương ñối rộng.
Nhóm thứ 2: Cysteine proteinase là các proteinase chứa nhóm –SH trong
trung tâm hoạt ñộng. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như
papayin, bromelin, một vài protein ñộng vật và proteinase ký sinh trùng. Các
cystein proteinase thường hoạt ñộng ở vùng pH trung tính, có tính ñặc hiệu cơ
chất rộng.
Nhóm thứ 3: Aspartic proteinase hầu hết thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin
bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic
proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt ñộng và thường hoạt ñộng
mạnh ở pH trung tính.
Nhóm thứ 4: Metallo proteinase là nhóm proteinase ñược tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Chúng thường ñòi hỏi sự có

PMSF

1mm
TPCK

0,7mm
TLCK
10
µM
Leu

1mM
pHMB

0,1mM
E-64
5mM
DAN

Thuộc
loại
Ephemeroptera
E. trispina
Odonata
A. juncea
Plecoptera
A. stigmatica
Orthoptera
O. yezoensis
Dictyoptera

+ +
+
+
+ +

+


+

+
+

+
+

+

+ + +

++

++

++

++
+

++

++

++

++

++
++

+
+

++
++

++

++


+

+

+

+

+
+
+

+
+
++
+

++

+

++

Cy

Ký hiệu: Cy: cystein M: metallo S: serine C: chymoTrypsin T:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 13
Trypsin +: ức chế một phần, ++: ức chế mạnh.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 14
Các hoạt chất ức chế protease
ðể chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh.v.v. một số loại cây trồng có khả
năng tổng hợp các chất chống lại chúng. Một trong các hợp chất là chất ức chế
protease, các chất ức chế này ñược phân loại thành các họ khác nhau dựa trên sự tương
quan về cấu trúc, phương thức tác ñộng và vị trí trung tâm xúc tác của chúng (Barrett,
1986, Grudkowska và Zagdanska, 2004).
Vào năm 1947, lần ñầu tiên các nhà khoa học ñã chứng minh ñược vai trò
bảo vệ thực vật của PPI khi Mickel và Standish quan sát thấy ấu trùng của một số
loài côn trùng không thể phát triển bình thường trong các sản phẩm ñậu tương. Sau
ñó các chất kìm hãm trypsin trong ñậu ñương cho thấy ñộc tính với ấu trùng của bọ
cánh cứng (flour beetle), Tribolium confusum (Haq và cộng sự, 2004). PPI chủ yếu
có trong củ và hạt, tuy nhiên nó cũng xuất hiện các bộ phận khác trên cây (De Leo
và cộng sự, 2002), chúng sinh ra ñể chống lại côn trùng sâu hại và các mầm bệnh
(Ryan, 1990). PPI có khả năng ức chế protease trong ruột côn trùng ngăn cản và
dừng sự sinh trưởng và phát triển của chúng (Lawrence và Koundal, 2002). Hầu hết
PPIs tương tác với các protease mục tiêu của chúng bằng cách tiếp xúc với các vị trí
hoạt ñộng (xúc tác) của protease (ức chế cạnh tranh), dẫn ñến sự hình thành của một
phức chất ổn ñịnh ức chế protease không còn khả năng hoạt ñộng (Dorrah, 2004).
PPI có chứa một ñơn vị duy nhất ñược gọi là chất ức chế ñơn giản, và các
PPI có chứa nhiều ñơn vị ức chế ñược gọi là chất ức chế phức tạp và chúng ñược

0.5 % AcOH
1 - 100 µM
APMSF-HCl
(4-
Amidinophenyl-
methane
sulfonyl-fluoride)
252.7 Trypsin, serine H
2
O
(20 mg/ml).
-20 °C
10-50 µM
Arphamenine A 387.4 Metallo-protease H
2
O, MeOH IC
50
:
0.006 µg/ml
Diprotin A 341.5 Metallo protease H
2
O K
i
:2.2 µM
E-64 357.4 Papain, cysteine
proteases
H
2
O, DMSO
dung dịch nước +

(PPI)
ca. 22000 trypsin, factor Xa H
2
O
(1 mg/ml) Nhiệt
ñộ và pH cao
10-100 µg/ml
nguồn
http://www.sciencegateway.org/resources/ protease.htm)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ……………… 16* Tổng quan về amylase
Vào năm 1814, Kirchoff Saint Petercburg (Nga) ñã chứng minh hạt lúa mạch
nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành ñường ở nhiệt ñộ từ 40°C - 60°C.
Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu ñược kết tủa có
khả năng phân giải tinh bột thành ñường, và ñặt tên là diastase (xuất phát từ tiếng
Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, ñó là amylase). Năm 1851, Leuchs ñã phát
hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành ñường. Sau ñó, các enzyme
amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và ñộng vật, trong hạt nảy
mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt ñầu ñược quan tâm nghiên cứu (Nguyễn
Hữu Chấn, 1983).
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử
polysaccharide với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH => RH + R’-OH