Development of a nonradioactive receptor-
ligand binding assay towards drug development
strategy in Vietnam

Nguyen Anh Luong

Hanoi university of Science, VNU; Faculty of Biology
Major: Genetics; Code: 60 42 70
Supervisors: Assoc.Prof.PhD. Dinh Doan Long
Date of Presenting Thesis: 2011 Abstract. Tổng quan về phương pháp đo tương tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử
dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam: Khái quát về dược lý
phân tử; Các đích tác dụng của thuốc; Về thụ thể kết cặp G protein (GPCR); Thụ thể
angiotensin II; Các phương pháp nghiên cứu xác định tương tác thụ thể và phối tử; Y
học cổ truyền và tài nguyên dược liệu. Trình bày các phương pháp nghiên cứu: Quy
trình chiết xuất dịch chiết methanol; Thu thụ thể màng; Xác định nồng độ protein sử
dụng phương pháp Bradford; Phương pháp elisa để xác định lượng phối tử gắn
fluorescein; Quy trình thí nghiệm liên kết (binding assay); Phản ứng tương tác giữa các
phối tử đã biết và dịch chiết với thụ thể đích; Phương pháp xử lý kết quả. Trình bày kết
quả và thảo luận: Xác định nồng độ protein thu được từ gan chuột; Tối ưu phản ứng
ELISA; Tối ưu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết; Thí nghiệm liên kết thụ
thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa); Phản ứng cạnh tranh của F-AT II với các
phối tử đã biết; Nghiên cứu sàng lọc một số dịch chiết thực vật.

Keywords. Di truyền học; Thuốc Việt Nam; Đồng vị phóng xạ; Thụ thể

Content
Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú
trên thế giới với hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật đã được xác định, với

Agtr1a, hoặc AT
1A
) và Agtr1b (hay AT
1B
). Hai loại thụ thể này do các gen khác nhau quy định
có trình tự tương đồng quan trọng trong vùng mã hóa. Các thụ thể này tương đồng về ái lực với
với angiotensin II và các chất đối vận không peptide và không thể phân biệt về mặt dược lý
mặc dù chúng có sự phân bố khác nhau và được điều hòa khác nhau [25]. So sánh trình tự gen
mã hóa thụ thể AT
1
ở người và chuột, có tới hơn 95% trình tự axit amin tương đồng [22], và có
ái lực tương đồng với chất chủ vận tự nhiên là angiotensin II [25].
Gan chuột là mô có sự phân bố của thụ thể angiotensin II cao thứ hai, chỉ sau tuyến
thượng thận [40].
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn mô gan để thu protein thụ thể này do mô gan lớn
hơn và thu mẫu cũng dễ dàng hơn.
Sau khi mẫu mô thu được được nghiền đồng thể, tiến hành đo nồng độ protein thu được
theo phương pháp của Bradford. Với BSA là protein chuẩn, đường chuẩn được xây dựng, với
phương trình y = ax + b; trong đó y là giá trị OD ở bước sóng 595nm, còn x là giá trị nồng độ
protein (mg/ml). Với các mẫu pha loãng từ mẫu protein gốc thu được sau khi nghiền đồng thể,
sau khi đo OD
595
ta tìm được giá trị OD của mẫu pha loãng trong giới hạn của đường chuẩn đã
xây dựng, từ đó tính được nồng độ của mẫu pha loãng này rồi từ số lần pha loãng suy ngược ra
nồng độ của mẫu protein gốc ban đầu. Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định được giá trị
của nồng độ protein thu được từ gan chuột, nồng độ thu được là 50 mg/ml.
2. Tối ưu phản ứng ELISA
Để tối ưu phản ứng ELISA cho các phản ứng giúp xác định được lượng phối tử đặc hiệu
F-AT II từ phản ứng liên kết, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp của
phản ứng ELISA có thể xác định được.

-9
M).
3. Tối ưu nồng độ protein thụ thể trong phản ứng liên kết
Để thực hiện được các thí nghiệm liên kết giữa thụ thể và phối tử chúng tôi tiến hành thí
nghiệm xác định nồng độ protein thụ thể phù hợp cho thí nghiệm. Thí nghiệm được thực hiện
với dải nồng độ protein thụ thể từ 2,5 mg/ml đến 80 mg/ml. Nồng độ của phối tử đặc hiệu F-
AT II trong các phản ứng này là 10
-8
M, đây là nồng độ được tham khảo từ những nghiên cứu
trước đây trên thụ thể này với phối tử đặc hiệu là AT II đánh dấu phóng xạ [47].

Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ protein với phối tử.
Kết quả được trình bày trong hình 3, cho thấy ở nồng độ lượng phối tử liên kết đặc hiệu
với thụ thể đích tăng dần cho đến nồng độ protein là 10 mg/ml, ở đó phản ứng bắt đầu đạt được
giá trị tối đa. Từ kết quả này, giá trị nồng độ protein thích hợp cho các phản ứng liên kết thụ thể
- phối tử được chúng tôi thực hiện trong các thí nghiệm tiếp theo là 10 mg/ml.
Cùng với thí nghiệm này, thời gian ủ cho phản ứng liên kết thụ thể - phối tử cũng được
thực hiện. Giá trị thời gian ủ phù hợp nhất là 40 phút.
4. Thí nghiệm liên kết thụ thể - phối tử đặc hiệu (thí nghiệm bão hòa)
Với các điều kiện thí nghiệm đã tối ưu, đó là thời gian ủ 40 phút, và nồng độ protein thụ
thể 10 mg/ml đã được xác định thông qua các thí nghiệm trước đó, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm tiếp theo để xác định được các giá trị K
d
và B
max
đặc trưng cho phối tử đặc hiệu F-AT
II. Thí nghiệm được thực hiện với phản ứng liên kết với dải nồng độ phối tử đặc hiệu từ 10
-7
M
đến 10

-12
– 10
-4
M) và losartan (dải nồng độ từ 10
-10
– 10
-2
M). Kết quả thu được được
xử lý, biểu diễn trên hình 5. Giá trị K
i
của AT II và losartan lần lượt là 13x10
-9
M và 3,6x10
-7

M. Giá trị K
i

của AT II trong nghiên cứu này là khá tương đồng với các nghiên cứu đã công bố
trước đây [7, 48], và so sánh với giá trị K
d
của F-AT II trong nghiên cứu này ta thấy có sự
tương đồng cao, cho thấy phối tử đánh dấu F-AT II và phối tử không đánh dấu AT II không có
nhiều khác biệt về ái lực. Điều này cũng củng cố thêm những đánh giá về sự ổn định và ái lực
của phối tử được đánh dấu fluorescein sử dụng trong các nghiên cứu trong các lĩnh vực khác
trên thụ thể angiotensin II như trong các nghiên cứu đã được đề cập trong phần tổng quan tài
liệu.
Giá trị K
i
của losartan được xác định cao hơn trong các nghiên cứu khác được xác định

µg/ml.

Hình 6. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết cỏ mần trầu.
Liên kết đặc hiệu và giá trị IC
50
(trong ngoặc) được xác định với các mẫu  PEI081101 (a); 
PEI081102 (b); ▼ PEI081103 (c).
Với các mẫu dịch chiết hạ khô thảo (LPV081101, LPV081102, LPV081103), giá trị IC
50

thu được đạt giá trị xoay quanh 0,8 µg/ml (lần lượt với các mẫu là 1,1 ± 0,4; 0,8 ± 0,6 và 0,5 ±
0,3). Điều này cho thấy, các dịch chiết này có khả năng ức chế cao phản ứng tương tác giữa thụ
thể angiotensin II với phối tử đặc hiệu của nó. Giá trị K
i
của các mẫu này trung bình là khoảng
0,8 µg/ml. Kết quả cho thấy, có thể có những chất có tác dụng dược lý tác dụng lên thụ thể
angiotensin II trong các mẫu dịch chiết từ cỏ mần trầu và hạ khô thảo. Đây là những cây cần
được chú ý cùng trong các nghiên cứu sâu hơn của đề tài này.

Hình 7. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hạ khô thảo.
Liên kết đặc hiệu và giá trị IC
50
(trong ngoặc) được xác định với các mẫu  LPV081101 (d); 
LPV081102 (e); ▼ LPV081103 (f).
Log [dịch chiết], µg/ml
0 0,01 0,1 1 10 100 1000
Log [dịch chiết], µg/ml

Hình 8. Ức chế liên kết F-AT II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết hòe. Liên kết
đặc hiệu và giá trị IC

50
và K
i
của các mẫu dịch chiết trong nghiên cứu
Dịch chiết
Mẫu
IC
50
(g/mL)
K
i
(g/mL)
Eleusine indica – Cỏ mần trầu
PEI081101
1.6 ± 0.3
1.2
PEI081102
1.1 ± 0.5
0.8
PEI081103
0.7 ± 0.6
0.5
Prunella vulgaris – Hạ khô thảo
LPV081101
1.1 ± 0.4
0.8
LPV081102
0.8 ± 0.6
0.6
LPV081103

3. Tăng huyết áp và điều trị trong y học cổ truyền, giáo trình học viện Y dược học cổ truyền
Việt Nam.
4. Phạm Nguyễn Vinh, Hồ Quang Trí, Hà Ngọc Bản, Phạn Nguyễn Khoa (2006), Bệnh tăng
huyết áp: cơ chế - dịch tễ - lâm sàng chẩn đoán và điều trị, Viện Tim thành phố Hồ Chí
Minh.
Tài liệu tiếng Anh
5. Ayensu E.S., DeFilipps R.A. (1978), Endangered and Threatened Plants of the United
States. Washington, DC:Smithsonian Institution.
6. Beck-Sickinger, A.G. (1996), Structural characterization and binding sites of G-protein-
coupled receptors. Drug Discovery Today, 1:502–513.
7. Bergsma DJ, Ellis C, Kumar C, et al. (1992), Cloning and characterization of a human
angiotensin II type 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 183:989-995.
8. Berk BC, Corson MA. (1997), Angiotensin II signal transduction in vascular smooth
muscle: role of tyrosine kinases. Circ Res, 80:607-616.
9. Birnbaumer L, Abramowitz J, Brown AM. (1990), Receptor-effector coupling of G
proteins. Biochim Biophys Acta, 1031:163–224.
10. Bouscarel B., Blackmore P.F., Exton J.H. (1988), Characterization of the angiotensin II
receptor in primary cultures of rat hepatocytes. J Biol Chem, 263(29): 14913 – 14919.
11. Bradford M.M. (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72: 248–
254.
12. Carey RM, Wang ZQ, Siragy HM. (2000), Role of the angiotensin type 2 receptor in the
regulation of blood pressure and renal function. Hypertension, 35:155-163.
13. Curnow KM, Pascoe L, White PC. (1992), Genetic analysis of the human type-1
angiotensin II receptor. Mol Endocrinol, 6:1113-1118.
14. Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons; 2003.
15. Cheng YC, Prusoff WH. (1973), Relationship between the inhibition constant (K
i
) and the
concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC

27. Jourdain E., et al. (2011), The Pattern of Influenza Virus Attachment Varies among Wild
Bird Species. PLoS One 6:e24155.
28. Katzung B.G. (2007), Basis and clinical pharmacology, 10
th
ed. McGraw Hill, LANGE.
29. Lefkowitz R.J., Roth J., Pastan I. (1970), Radioreceptor Assay of Adrenocorticotropic
Hormone: New Approach to Assay of Polypeptide Hormones in Plasma. Science 170: 633.
30. Li XC, Carretero OA, Navar LG, Zhuo JL. (2006), AT1 receptor-mediated accumulation of
extracellular angiotensin II in proximal tubule cells: role of cytoskeleton microtubules and
tyrosine phosphatases. Am J Physiol Renal Physiol, 291:F375-F383.
31. Lloyd R.V. ( 2001), Morphology methods: cell and molecular biology techniques. Humana
Press.
32. Lundstrom K.H. and Chiu M.L. (2006), G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery,
CRC Press Taylor & Francis Group,.
33. Mahoney CW. (1999), High-throughput nonradioisotopic determination of binding of
platelet-derived growth factor to platelet-derived growth factor receptor beta-extracellular
domain using biotinylated ligand with enzyme-linked immunosorbent assay. Anal
Biochem., 276(1):106-8.
34. Nakajima M., Hutchinson H.G., Fujinaga M., et al. (1995), The angiotensin II type 2 (AT2)
receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gain-of-function study using
gene transfer. Proc Natl Acad Sci USA, 92:10663-10667.
35. Noda K, Feng YH, Liu XP, et al. (1996), The active state of the AT1 angiotensin receptor is
generated by angiotensin II induction. Biochemistry, 35:16435-16442.
36. Noga E.J., Udomkusonsri P.(2002), Fluorescein: A rapid, sensitive, nonlethal method for
detecting skin ulceration in fish. Vet Pathol 39:726–731.
37. Nguyen Dao Ngọc Van and Nguyen Tap (2008), An overview of the use of plants and
animals in traditional medicine systems in Vietnam:A Traffic Southeast Asia report,
Published by TRAFFIC.
38. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. (2006), How many drug targets are there?
Nature Rev. Drug Discov. 5: 993–996.

48. World Health Organization (2002), Traditional Medicine Strategy 2002–2005, Geneva.
49. Zander E.D. (2011), The Science and Business of Drug Discovery. Springer.