m
BỘ Y TẾ
TRUỒNG ĐAI HOC D ươc HÀ NÔI
VŨ BÍCH HẠNH
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ NHÓM CHẤT CỦA TÁO MÈO
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999-2004)
Người hướng dẫn

Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
TS. Nguyễn Văn Đổng
Bộ môn Hoá sinh
Tháng 2-5/2004
HÀ NỘI, THÁNG 5-2004
&
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Đồng -
người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp em hoàn thành khoá luận
này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, các cô kỹ
thuật viên ở Bộ môn Hoá Sinh đã luôn ủng hộ và tạo điều kiện tốt nhất để
em có thể thực hiện khoá luận. Cám ơn khoa Hoá Sinh - BV 19-8 đã giúp đỡ
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn phòng Đào tạo, phòng Quản lý Khoa
học, thư viện Quốc gia, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp em
hoàn thành khoá luận đúng thời hạn.
Hà Nội 20.5.2004
Sinh viên
Vũ Bích Hạnh
MỤC LỤC

3.2.3.Ảnh hưởng của thuốc tới các chỉ số lipid ở ngày thứ 20

31
3.2.4.Nhận xét chung và bàn luận
38
Phần 4. Kết luận và đề xuất 40
KÝ HIỆU VIẾT TẮT
■ Apo
■ CH
■ CHE
■ CHO
■ CM
■ GPO
■ HDL
■ HDL-C
- HMGCoA
■ IDL
■ LCAT
■ LDL
■ LDL-C
■ Lp
■ LPL
■ POD
■ TG
■ VLDL
■ VXĐM
Apoprotein
Cholesterol
Cholesterol esterase
Cholesterol oxidase

khắc phục nhược điểm đó.
Ở Việt Nam, các thuốc hạ lipid máu chủ yếu là thuốc ngoại nhập, thường có
giá thành đắt. Các công trình nghiên cứu và sản xuất thuốc trên chưa nhiều, phạm vi
sử dụng còn hạn chế.
Từ thực tế đó, mục đích của luận văn là phát hiện, nghiên cứu và so sánh tác
dụng hạ lipid máu của Táo mèo với Sơn tra-một dược liệu Trung Quốc đã được
nhiều tài liệu chứng minh là có tác dụng hạ Cholesterol máu. Sơn tra từ lâu đã được
biết đến trong nhiều bài thuốc phòng và điều trị hội chứng tăng lipid máu, tuy nhiên
ở Việt Nam vị thuốc Sơn tra được thay thế bằng Táo mèo- một cây khác cả chi và
loài đối với sơn tra Trung Quốc. Tác dụng của táo mèo chưa được nghiên cứu cụ thể,
do đó vấn đề được đưa ra là "liệu táo mèo có thực sự thay thế được sơn tra trong việc
hạ lipid máu hay không?".
1
Nội dung và mục tiêu cụ thể:
+ Xây dựng mô hình gây tăng Cholesterol ngoại sinh trên chuột nhắt trắng
bằng thức ăn giàu cholesterol là óc lợn.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của sơn tra và táo mèo tới một số chỉ số lipid trên
mô hình gây tăng Cholesterol ngoại sinh.
+ Các chỉ số lipid được thực hiện để khảo sát là:
• Cholesterol toàn phần (CH)
• Cholesterol trong HDL (HDL-C)
• Triglycerid (TG)
• Tỷ số HDL-C/ CH
2
PHẦN 1
TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỂ LIPID :
1.1.1. Đại cương về Lipid [1], [9], [11] :
*Lipid là sản phẩm ngưng tụ của acid béo và alcol, hầu hết là các ester hoặc
amid của acid béo với alcol.

lipid phải liên kết với protein thành lipoprotein (Lp). Phần protein liên kết với lipid
được gọi là apoprotein (Apo).Theo T.KOVANE-1985, cấu trúc phân tử Lp như sau:
Phân tử Lp có dạng hình cầu, đường kính từ 100-800 A°. Trong phân tử, các phân tử
lipid liên kết với phần protein bằng lực liên kết Vander-Wal. Phần lõi của phân tử
Lp chủ yếu là các phân tử lipid không phân cực (cholesterol ester, triglycerid )-
Phần vỏ Lp được cấu tạo bởi các Apo và các phân tử lipid phân cực (phospholipid,
cholesterol tự do ). Chính nhờ có lớp vỏ này nên Lp có khả năng hoà tan trong
nước, vận chuyển được tới các tổ chức, các mô trong cơ thể. Các Apo, do cấu trúc
peptid của mình, có thể quyết định bản chất và lượng của lipid kết hợp. Kích thước
và tỷ trọng của mỗi loại Lp chủ yếu phụ thuộc vào lượng lipid ở lớp lõi trung tâm.
Dựa vào tỷ trọng, có thể phân loại Lp như sau:
- Hạt vi thể dưỡng chất( Chylomicron) : d < 0,94
- Lipoprotein có tỷ trọng rất thấp ( VLDL): 0,94 <d < 1,006
- Lipoprotein có tỷ trọng trung bình (IDL): 1,006 <d < 1,019
- Lipoprotein có tỷ trọng thấp (LDL) : 1,019 <d < 1,063
- Lipoprotein có tỷ trọng cao (HDL) : 1,063 <d < 1,210
1.1.2.2. Receptor của Lp [7]
Lp có vai trò quan trọng trong cơ thể, cho nên rối loạn chuyển hoá Lp dẫn
đến bệnh hiểm nghèo như các bệnh về VXĐM. Ngoài yếu tô gây bệnh của
cholesterol thì vai trò của receptor Lp rất quan trọng.
Receptor LDL được nghiên cứu chi tiết bởi Brown và Goldstein (giải Nobel
1985) : là một chuỗi peptid gồm 822 acid amin, một phần xuyên màng. Phần NH2
tận cùng ở ngoài tế bào tương tác với LDL, còn phần -COOH tận cùng nằm trong
bào tương và cho phép LDL hoà nhập với lysosom. Receptor LDL có ở hầu khắp
mọi tế bào, đặc biệt ở các tế bào thâu tóm cholesterol. Receptor LDL có thể gắn
4
nhiều loại Lp như LDL, IDL, HDL và theo một số tác giả cả với VLDL. Receptor
LDL tham gia điều hoà chuyển hoá LDL. Nếu có nhiều receptor LDL, đa số các hạt
IDL được loại khỏi máu, và chỉ còn ít IDL chuyển thành LDL. Nếu lượng các
receptor LDL giảm, sự phân giải IDL bởi gan sẽ chậm lại, sẽ có một lượng lớn hơn

❖ Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL):
LDL là sản phẩm chuyển hoá của VLDL, có 25% protein (chủ yếu là Apo
B100) và 75% lipid (chủ yếu là cholesterol nội sinh). LDL vận chuyển cholesterol
tới mô và tương tác với receptor-LDL trên màng tế bào. Các hạt LDL được tế bào
thâu tóm, cholesterol được dùng làm nguyên liệu tổng hợp steroid tham gia thành
phần màng tế bào.
Cholesterol trong LDL được coi là cholesterol "xấu", là mục tiêu chính trong
điều trị hạ cholesterol máu. Các hạt LDL đường kính rất nhỏ, chứa nhiều
cholesterol, được thoái hoá theo 2 con đường: phần lớn các hạt LDL mang
cholesterol từ gan tới các tổ chức và tương tác với receptor LDL trên màng tế bào;
một phần nhỏ LDL thoái hoá theo con đường kém đặc hiệu hơn, trong đó có sự tham
gia của đại thực bào. Khi nồng độ cholesterol trong máu tăng cao thì sự thoái hoá
theo con đường này cũng tăng, dẫn tới sự ứ đọng cholesterol ở đại thực bào thành
động mạch (gây bản vữa xơ) và đại thực bào ở gân và da (gây u vàng).
❖ Lipoprotein có tỷ trọng cao (HDL):
HDL được tổng hợp ở gan và ruột, có chứa 50% protid ( trong đó Apo AI
64%, Apo A2 20%, Apo c 11%, Apo D 3%, Apo E 2%) và khoảng 50% lipid (trong
đó phospholipid 30%, cholesterol 18%, triglycerid 2%). Lượng cholesterol trong
HDL được gọi là cholesterol "tốt" bởi vì cholesterol được HDL vận chuyển từ các tế
bào ngoại vi về gan để thải ra ngoài bằng đường mật. Lượng cholesterol HDL tỷ lệ
nghịch vói nguy cơ tai biến về tim mạch, với VXĐM.
Ở người HDL thấp, nguy cơ bệnh mạch vành nhiều hơn gấp 8 lần
(Framingham 1977).
1.1.3. Bệnh tăng lipid máu:
1.1.3.1. Phân loại [5], [7] :
-Theo Fredrickson (1967): dựa vào điện di phân loại Lp, có 5 typ :
* Typ I : Tăng Chylomicron máu hay tăng TG ngoại sinh.
6
* Typ I I : Tăng p lipoprotein máu (chia thành 2 chi typ).
+ Typ lia, tăng cholesterol huyết gia đình hay tăng cholesterol nguyên phát.

* Điều trị bằng chế độ ăn:
Tuỳ thuộc vào từng typ mà có chế độ ăn khác nhau, tuy nhiên có thể tóm tắt
chung như sau:
- Chế độ ăn nên giảm cholesterol (có nhiều trong lòng đỏ trứng, óc súc vật,
gan, thịt mỡ, bơ giảm mỡ (vì có nhiều acid béo), giảm carbonhydrat (nhất là loại
hấp thụ nhanh như đường), giảm rượu và bia, giảm calo để giảm cân nếu béo.
- Trong thực đơn nên tăng cường rau quả tươi và các sản phẩm ngũ cốc, nên
ăn cá ít nhất 3 lần/tuần hoặc 30g/ngày. Cá có acid béo không bão hoà thuộc họ
omega 3, dặc biệt là acid eicosa penta enoic và acid docosa hexa enoic, những acid
này làm giảm cholesterol máu.
♦♦♦ Điều trị bằng thuốc:
* Sau khi đã thực hiện triệt để chế độ ăn, giảm cân và tập luyện mà vẫn
không làm giảm lipid huyết thanh xuống đến mức độ cần thiết thì mới sử dụng
thuốc.
* Một số thuốc thường gặp trong điều trị bệnh tăng lipid máu:
- Resin mật ịcholestyramine và cholestipoiy. là nhựa trao đổi ion, làm cho
acid mật bị gắn trong ruột, ngăn cản sự tái hấp thu acid mật qua thành ruột. Vì nhiều
cholesterol được sử dụng để tổng hợp acid mật nên các chất thụ cảm LDL-C ở bề
mặt tế bào tăng lên, do đó có sự giảm nồng độ LDL-C trong máu (có thể giảm tới
35%).
Tác dụng phụ: táo bón, đau bụng, buồn nồn, nôn, phù, đau ngực, nấc, ợ hoi.
- Acid nicotinỉc: là vitamin tan trong nước và làm hạ VLDL tới 40%, có thể
làm hạ LDL-C từ 15% tới 30% và có thể tăng HDL-C từ 10% đến 30%.
Tác dụng phụ: sưng nóng đỏ đau, mẩn ngứa, phát ban, buồn nôn, rối loạn tiêu
hoá, chán ăn, chóng mặt và giảm huyết áp.
- Chất ức chế HMG CoA reductase: là loại thuốc mới ngăn cản tối đa sinh
tổng hợp cholesterol, gồm có Lovastatin, Provastatin và Simvastatin.Thuốc ngăn
cản hoạt tính của enzym, dẫn tới sự giảm tập trung cholesterol trong tế bào, nên làm
tăng chất thụ cảm LDL, từ đó làm giảm LDL-C máu tới 40%.
8

❖ Nguyên Văn Đồng và cộng sự (trường ĐH Dược HN) đã nghiên cứu tác
dụng hạ lipid máu của 1 số vị thuốc: Xuyên khung, Đương quy, Đào nhân, Đan sâm,
Giá đậu xanh, Hy thiêm trên chuột gây tăng cholesterol ngoại sinh thấy giảm rõ rệt
CH huyết, giảm lipid toàn phần, giảm tỷ lệ p/a Lp.
1.1.5. Một số mô hình gây tăng cholesterol ngoại sinh trên chuột:
1.1.5.1. Trên chuột cống [26] :
- Chuột cống mới thôi bú có mức cholesterol cao hơn 2-3 lần so với chuột
trưởng thành. Điều này có thể do hàm lượng chất béo trong sữa cao, vì khi thay sữa
bằng chế độ ăn bình thường thì CH máu gần bằng ở chuột trưởng thành.
Nồng độ CH máu bình thường của chuột cống mới thôi bú trọng lượng 60-90 g là
101 mg%.
- Nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng chuột cống để gây tăng CH máu.
Tuỳ theo tuổi của chuột, thời gian gây tăng và đặc biệt là chế độ ăn, các tác giả đã
gây được sự tăng CH máu ở những mức độ khác nhau.
■ Fillios và c s đã gây tăng CH máu ở chuột cống lên tới 1100 mg% sau 28
ngày bằng chế độ ăn có bổ sung CH, Na cholat và thiouracil.
■ Fukushima và c s đã gây tăng CH máu chuột cống lên tới 245 mg% sau
28 ngày bằng chế độ ăn có bổ sung CH 1% và dịch chiết mật bò 0,5%.
■ Ruegamen và cs đã gây tăng CH máu ở chuột cống mới thôi bú lên tới
436 mg% sau 14 ngày bằng chế độ ăn có bổ sung CH, chất béo và acid
cholic.
1.1.5.2. Trên chuột nhắt [6] :
- Mô hình đầu tiên gây tăng CH máu trên chuột nhắt là của TS Nguyễn Văn
Đồng- trường ĐH Dược Hà Nội (1995), được xây dựng dựa theo mô hình của
Ruegamen trên chuột cống. Tác giả đã cải tiến một số điểm : chế độ ăn có bổ sung
CH nguyên chất và mỡ lợn, thời gian gây tăng ngắn hơn. Kết quả là đã gây tăng CH
máu ở chuột nhắt 84% trong 7 ngày.
10
1.2.TỔNG QUAN VỂ Dược LIỆU:
1.2.1. SƠN TRA [3,20,21]

* Bằng phương pháp điện di mao quản, đã tách được 4 flavon trong
c.pinnatiýida với nồng độ lần lượt là: vitexin-2"-rhamnosid 0,35 Ịig/ml; hypeside 0,3
ng/ml; rutin 0,4 Ịig/ml; vitexin 0,29 |J.g/ml [24].
* Thông báo đầu tiên về thành phần hoá học của dịch sắc Sơn tra được đưa ra
7/2001, cho thấy trong đó có 9 hợp chất: vitexin, quercetin, hyperoside, rutin,
paeoniAorin, protocatechaldehyde, (+) - catechin, danshensu, và acid citric [23].
1.2.1.3. Tác dụng dược lý [21] :
- Kích thích tiêu hoá (đặc biệt tiêu hoá protid ) và tăng cường hoạt động của
dạ dày.
- Làm hạ cholesterol máu bằng cánh tăng chuyển hoá cholesterol. Nó làm
giảm các mảng vữa xơ trên thành động mạch. Thuốc còn làm tăng lưu lượng mạch
vành, làm giảm tiêu thụ oxy và chống thiếu máu cục bộ. Ngoài ra, nó còn có tác
dụng tăng co bóp tim và hạ huyết áp. Thuốc cũng có tác dụng kháng khuẩn.
Sơn tra hầu như không độc, chỉ khi dùng liều cao thì có thể gây chóng mặt
và buồn nôn.
1.2.1.4. Công dụng và liều dùng:
- Tây y: coi Sơn tra (hoa, quả, lá) là một vị thuốc chủ yếu tác dụng trên tuần
hoàn và giảm đau, an thần. Dùng trong các trường hợp ứ máu, cholesterol máu cao,
chứng đau thắt ngực và huyết áp cao.
12
- Đông y: lại coi Sơn tra là một vị thuốc chủ yếu tác dụng trên bộ máy tiêu
hoá.
Theo tài liệu cổ, sơn tra có vị chua, ngọt, tính ôn, vào 3 kinh tỳ, vị, can, tiêu
được các thứ thịt tích trong bụng. Tuy nhiên, cũng theo tài liệu cổ ghi về sơn tra còn
nói thêm là sơn tra phá được khí, hành ứ, hoá đờm dãi, giải được độc cá, lở sơn,
chữa tả lỵ, tri huyết khối, giảm đau.
Liều dùng: 9- 12g (DĐTQ)
1.2.2.TÁO MÈO [3,4,15]
Còn có tên sơn tra, gan, pom rừng, chua chát, chi-tô-di (Mèo), sán sá (Tày)
Vị thuốc là quả chín đã thái phiến phơi hay sấy khô cùa cây Chua chát

PHẦN 2
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN cứ u :
2.1.1. Sơn tra : mua tại cửa hàng thuốc ở Nam Ninh, Trung Quốc, đã được xác định
đúng loài và bộ phận dùng. Xử lí và chế biến theo TCDĐ Trung Quốc.
2.1.2. Táo mèo : mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội. Xử lí và chế biến theo TCDĐ II
(TCVN 3469-80).
2.1.3. Lopid : là thuốc chống tăng lipid huyết [16]:
- Tên hoạt chất: Gemfibrozil.
- Dạng thuốc: nang 300 mg.
- Dược lý và cơ chế tác dụng:
Gemfibrozil là một chất tương tự acid íibric không có halogen. Gemfibrozil
làm giảm nồng độ Lp giàu triglycerid, như VLDL, tăng nhẹ nồng độ HDL và có tác
dụng khác nhau trên LDL. Tác dụng trên nồng độ VLDL có thể chủ yếu do tăng
hoạt tính của lipoprotein lipase, đặc biệt trong cơ, dẫn đến tăng thuỷ phân lượng
triglycerid trong VLDL và tăng dị hoá VLDL. Gemfibrozil còn làm thay đổi thành
phần của VLDL do làm giảm sản sinh ở gan Apo c III là chất ức chế hoạt tính của
LPL, và cũng làm giảm tổng hợp triglycerid trong VLDL ở gan.
Cùng với tác dụng trên lipid máu, Gemfibrozil còn có tác dụng giảm kết tập
tiểu cầu nên làm giảm nguy cơ về bệnh tim mạch.
* Thuốc được sử dụng như một chất kiểm chứng.
2.2. PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM :
2.2.1. Xử lý và chế biến dược liệu :
Dược liệu được chọn lọc, xử lý và chế biến theo tiêu chuẩn Dược điển.
❖ Sơn tra và táo mèo toàn phần được chế biến thành cao lỏng 3:1 như sau :
- Dược liệu rửa sạch, loại tạp và bỏ những hạt rơi rụng.
- Cho dược liệu vào nồi, đổ ngập nước 2-3 cm, sắc trong 2h. sắc 3 nước. Hai
nước sắc đầu gạn, lọc để riêng. Lần 3 ép kiệt, để lắng, lọc trong.
15
- Trộn 3 nước sắc cô đặc tới cao lỏng 1:1 (1 kg dược liệu: 1 lít cao).

Chuột nhắt trắng, đực, 120 con, sau khi được nuôi một tuần cho thích nghi,
loại đi những con bất thường, tiến hành chia lô một cách ngẫu nhiên với khẩu phần
ăn hàng ngày như sau:
□ Lô trắng (n = 5): Cơm 10 g.
Bột cá 0,5 g.
Nước uống tự do.
□ Lô chứng (n = 30): Chế độ ăn giống lô trắng, có bổ sung thêm 2g óc lợn
và 0.1 ml dầu cọ.
□ Lô uống Lopid- Gemfibrozil (n = 15): Chế độ ăn giống lô chứng, bổ sung
thêm 2,4 mg Gemfibrozil/con/ngày. (Lô đối chiếu).
□ Lô uống cao Sơn tra (n = 15): Chế độ ăn giống lô chứng, bổ sung thêm
0,016 ml cao Sơn tra/con/ngày (tương đương 48mg Sơn tra/con/ngày).
□ Lô uống cao Táo mèo (n = 15): Chế độ ăn giống lô chứng, bổ sung thêm
0,016 ml cao Táo mèo/con/ngày (tương đương 48mg Táo mèo/con/ngày).
□ Lô uống cao Thịt quả Táo mèo (n = 15): Chế độ ăn giống lô chứng, bổ
sung thêm 0,016 ml cao thịt quả Táo mèo/con/ngày (tương đương 48mg thịt quả
Táo mèo/con/ngày).
□ Lô ăn hạt Táo mèo (n = 15): Chế độ ăn giống lô chứng, bổ sung thêm
48mg bột hạt táo mèo/con/ngày.
Sau các thời điểm 7, 10, 20 ngày, tiến hành lấy máu, tách huyết thanh làm
bệnh phẩm xét nghiệm 3 chỉ số : Cholesterol toàn phần, triglycerid và HDL-C.
2.2.4. Phương pháp định lượng các chỉ số lipid máu :
2.2.4.1. Chuẩn bị bệnh phẩm :
Máu lấy ở tĩnh mạch cổ chuột, được hứng vào ống nghiêm khô, sạch (chú ý
khi lấy máu để máu chảy theo thành ống nghiệm, tránh vỡ hồng cầu). Để yên trong
30 phút, tách nhẹ cục máu đông khỏi thành ống, sau đó ủ ấm ở 37°c, sau 30 phút
đem ly tâm (tốc độ 2500 vòng/ phút, trong 5 phút), tách huyết thanh để làm xét
nghiệm.
2.2.4.2. Phương pháp định lượng :
Các xét nghiệm lipid máu được tiến hành tại khoa Hoá Sinh- Bệnh viện 19-8,

Glycerol + ATP giyceroi kinase ^ Glycerol-3-phosphat + ADP
Glycerol-3-phosphat + 0 2

—
-
► dihydroxyaceton phosphat + H20 2
H20 2 + 4-aminoantipyrin + 4-chlorophenol P0D^ quinoeimin + HC1 + H20
- Cách tiến hành:
18
Mẫu
Thuốc
Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu chuẩn
Huyết thanh chuột
IOịiI
Triglycerid chuẩn
lOịú
Thuốc thử
1000 ịủ
1000 ịú 1000 ịú
Trộn đều, ủ ở 37°c trong 5 phút. Đo độ hấp thụ của mấu thử và mẫu chuẩn so với
mẫu trắng ở bước sóng 500 nm. Tính ra nồng độ TG thử.
- Thuốc thử: HUMAN triglycerids liquicolormon°
* Phương pháp xác định HDL-C:
- Nguyên tắc: Chylomycron, VLDL, LDL được kết tủa bởi acid
phosphotungstic và magnesium clorid, sau đó được định lượng như cholesterol.
- Cách tiến hành:
+ Chuẩn bị mẫu thử dịch trong HDL :
Huyết thanh chuột
500 |il
Dung dịch kết tủa (Chứa acid

x = - ± x .
«;•=! '
5 là độ lệch chuẩn
ổ =
n - 9
tịX i-X Ỷ
/=1
«-1
n: Số lượng phép thử
Xị. giá trị phép thử i
b. Cách tính độ tin cậy t ( trị sô' Student) theo urbrach :
Tính t để so sánh 2 giá trị trung bình
t =
ị r , - r , ị
V «1 + n 2
ẳ (x » - r J + Ễ (ỵ 2, - X*)
;• = !
________________
ị = Ị
____________
nx + n 2 - 2
c. Đối chiếu với bảng t-Student rồi phân tích kết quả:
• Nếu t lớn hơn giá trị tương ứng với p = 0,05 thì độ tin cậy đạt trên 95%
• Nếu t lớn hơn giá trị tương ứng với p = 0,01 thì độ tin cậy đạt trên 99%
• Nếu t lớn hơn giá trị tương ứng với p = 0,001 thì độ tin cậy đạt trên 99,9%
20