Số hóa bởi Trung tâm Học liệu NGUYỄN THỊ HUYỀN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ
ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A
CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ
ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A
CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã Số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. PHÍ QUYẾT TIẾN
Thái Nguyên - 2013
ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên đã truyền đạt cho tôi những
kiến thức quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, dìu dắt tận tình, động viên, chỉ bảo trong suốt quá trình tôi học
tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tại Phòng Công nghệ lên men, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Đồng thời tôi cũng cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo, ThS. Nguyễn Thị
Hồng Liên cùng các cán bộ phòng công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh
học, những người đã động viên, giúp đỡ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè,
đồng nghiệp những người đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh
thần để tôi có thể hoàn thành bản Luận văn này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quí
báu đó!
Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013
Học viên
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 24
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 25
CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
2.1. Vật liệu 29
29
2.1.2. Hóa chất sử dụng 29
29
2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1. Phương pháp giữ giống 30
2.2.2. Nhân giống xạ khuẩn 30
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 31
2.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa 32
2.2.5. Phương pháp thu hồi dịch validamycin A thô 34
2.2.6. Xác định hoạt tính validamycin A 34
2.2.7. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp validamycin
A 35
2.2.8. Xác định điều kiện lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn trong
bình tam giác 35
2.2.9. Xác định ảnh hưởng của thời gian lên men sinh tổng hợp validamycin
A 35
2.2.10. Nghiên cứu đặc tính và độ bền của validamycin A 36
2.2.11. Xác định khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch validamycin
A thô 36
2.2.12. Phương pháp xử lý số liệu 36
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC 65
vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
Tên đầy đủ
ADN
Acide deoxyribonucleic
ARN
Acide ribonucleic
BVTV
Bảo vệ thực vật
CKS
Chất kháng sinh
Đ
VVK
Đường kính vòng vô khuẩn
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
IU
International Unit
KTCC
Khuẩn ty cơ chất
KTKS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của val-A 9
Hình 1.2. Cơ chế tác động của val-A đến quá trình chuyển hóa năng lượng ở
vi nấm 11
Hình 1.3. Hình ảnh minh họa sự nảy mầm và phát triển của xạ khuẩn. 17
Hình 1.4. Mối quan hệ giữa các pha sinh trưởng của xạ khuẩn 18
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc của hai chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405
và S. hygroscopicus CNLM khi nuôi cấy trên môi trường thạch ISP2 38
Hình 3.2. Khả năng sinh tổng hợp ba loại enzyme ngoại bào của chủng S.
hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B) 40
Hình 3.3. Phổ sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của val-A chuẩn (A) và val-A có
trong dịch lên men của chủng S. hygroscopicus 11405 (B) và chủng S.
hygroscopicus CNLM (C) 42
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa kết quả sàng lọc tự nhiên về hoạt tính kháng
nấm chủng S. hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B) 43
Hình 3.5. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani của
chủng S. hygroscopicus 11405 44
Hình 3.6. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani của
chủng S. hygroscopicus CNLM 45
Hình 3.7. Hình ảnh minh họa hình dạng khuẩn lạc chủng S. hygroscopicus
11405 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 47
Hình 3.8. Cuống sinh bào tử của chủng S. hygroscopicus 11405 chụp bằng
kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 10.000 lần) 48
Hình 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng
hợp val-A 50
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng
hợp val-A 51
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh val-A 52
tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế và hạn chế dần nguy cơ độc hại do
sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng đến sức khỏe con người
và gây ô nhiễm môi trường.
Tại Việt Nam, một trong các loại thuốc bảo vệ thực vật an toàn, có
nguồn gốc sinh học được sử dụng hiệu quả để phòng trừ các loại nấm gây
bệnh cho cây trồng là validamycin, trong đó hiệu quả nhất là validamycin
dạng đồng phân A. Validamycin A (val-A) là một kháng sinh nhóm
aminoglycoside có hoạt tính kháng nấm được sinh tổng hợp chủ yếu bởi
Streptomyces hygroscopicus var. limoneus [25] và S. hygroscopicus subsp.
jinggangensis 5008 [39]. Nhờ hiệu quả phòng trừ nấm cao cũng như an toàn
cho con người và động vật, val-A trở thành một trong những kháng sinh quan
trọng nhất và được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để trừ bệnh đốm vằn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
2
hại lúa, bệnh thối nụ, thối rễ ở cây khoai tây, bông, cà chua, nấm hồng trên
cây cao su,… do nấm Rhizoctonia solani, R. oryzae và Sclerotium oryzae-
sativa gây nên. Val-A đang sử dụng ở nước ta chủ yếu được nhập khẩu từ
Trung Quốc dưới các tên thương mại Anlicin, Damycine, Duo xiao meisu,
Haifangmeisu, Iing gang meisu, Romycin, Vacinmeisu, Vacocin, Validacin,
Valitigi, Varison, Vida, Vigangmycin Trong khi việc nghiên cứu và sản
xuất validamycin đã diễn ra ở rất nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc,
Nhật Bản, Hàn Quốc… thì ở Việt Nam vấn đề này mới chỉ được quan tâm
nghiên cứu ở khả năng ứng dụng của validamycin.
Xuất phát từ tính cấp thiết và nhu cầu thực tiễn của việc sử dụng val-A,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số điều
kiện lên men sinh tổng hợp validamycin A của xạ khuẩn Streptomyces
hygroscopicus 11045“.
sinh khác đã được phát hiện như gramicidin, tyrocidine, streptomycin,
cloramphenicol, cephalosporin, chlortetracyline
Thuật ngữ “antibiotic” được A. Waskman đưa ra năm 1940 (anti- theo
tiếng Hi lạp là kháng lại, bios là sự sống) [42]. Antibiotic (chất kháng sinh-
CKS) là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của một loại VSV hoặc một cơ thể bậc
cao có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt tế bào sinh vật khác (vi khuẩn, protozoa,
tế bào ung thư ) một cách chọn lọc, ngay cả ở nồng độ thấp. Một chất được
xem là CKS nếu:
- Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất
- Là các sản phẩm có cấu trúc tương tự như các CKS tự nhiên
- Ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một hoặc vài VSV
- Có hiệu lực ở nồng độ thấp
Ngày nay, thuật ngữ kháng sinh được hiểu theo nghĩa rộng hơn:
“Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
4
ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV gây bệnh, đồng thời không có
tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật [2].
Trong nghiên cứu, kiểm nghiệm và thu hồi kháng sinh người ta thường
dùng đơn vị kháng sinh (IU, International Unit) để biểu thị hoạt lực tác dụng
của kháng sinh. Một đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu (chế
phẩm tinh khiết ở dạng axit, kiềm hoặc muối tương ứng) có khả năng ức chế
sự phát triển hoặc kìm hãm sự sinh trưởng của một chủng VSV kiểm định
chuẩn trong môi trường lỏng. Ví dụ 1 đơn vị kháng sinh penicilin bằng 0,6
mg benzyl penicillin tinh khiết là lượng kháng sinh tối thiểu kìm hãm sự phát
triển của chủng Staphylococcus aureus 209 trong 50 ml môi trường nước thịt.
Đa số các kháng sinh có 1,0 đơn vị tác dụng bằng 1 mg chế phẩm tinh khiết ở
kháng sinh đã biết các nhà nghiên cứu đã điều chế được hàng ngàn dẫn chất
mới là các kháng sinh bán tổng hợp và trong số này khoảng 50 chất cũng đã
được đưa vào sử dụng. Đồng thời có hai kháng sinh được sản xuất hoàn toàn
bằng tổng hợp hóa học là cloramphenicol và pyrrolnitrin [10], [13], [41].
1.1.2. Một số cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật
Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên
những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của VSV. Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất
kháng sinh và cấu trúc của tế bào. Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì
thường có cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần
giống nhau thì có phổ kháng VSV tương tự như nhau.
1.1.2.1. Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi sinh vật
Các nhóm CKS có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp thành tế bào
của VSV gồm có: penicillin, bacitracin, vancomycin.
Quá trình tổng hợp thành tế bào của VSV là một chuỗi các phản ứng
sinh hóa trải qua khá nhiều giai đoạn với sự tham gia của nhiều loại enzyme
khác nhau. Các enzyme này chính là mục tiêu tấn công của các nhóm CKS
trên. Ví dụ: CKS penicillin và cephalosporin tác động đồng thời cả hai loại
enzyme transpeptidase và cacboxipeptidase. Do cấu hình không gian của CKS Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
6
và một tiền chất cần thiết cho tổng hợp thành tế bào rất giống nhau nên CKS
ức chế cạnh tranh đối với enzyme xúc tác chuyển hóa tiền chất; kết quả là các
enzyme bị mất hoạt tính, các tiền chất tích lũy ngày càng nhiều ở bào tương
tạo ra áp suất thẩm thấu lớn làm vỡ tế bào vi khuẩn.
1.1.2.2. Ức chế các chức năng của màng tế bào vi sinh vật
Các nhóm CKS có tác dụng ức chế các chức năng của thành tế bào
các ion Mg
2+
cần cho sự hoạt động của các enzyme [38].
1.1.2.4. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic
Một số CKS cản trở quá trình sao chép và phiên mã ở VSV. Các CKS
này có thể ảnh hưởng đến quá trình sao chép của acid nucleic bằng cách ức
chế tổng hợp các nucleotide, ức chế sao chép hoặc làm ngừng phiên mã. Do
không tổng hợp được vật chất di truyền nên kết quả là các VSV gây bệnh
không thể sinh sản và duy trì nòi giống được. Hiện nay người ta đã biết rõ
khoảng 20 chất ức chế trao đổi hoặc tổng hợp ADN:
- Nhóm refampin gắn với ARN polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo
thành ARN thông tin (mARN).
- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của DNA gyrase làm cho hai mạch đơn
của ADN không thể duỗi xoắn, ngăn cản quá trình tự sao chép của ADN.
- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống p-aminobenzonic acid (PABA) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleotide.
- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
1.1.2.5. Ức chế cạnh tranh
Một số CKS có cấu trúc khá giống với cơ chất của các loại enzyme và
do đó chúng sẽ tranh chấp trung tâm hoạt động của enzyme với các chất trao
đổi bình thường. Điều này khiến cho sinh trưởng và phát triển của VSV bị ức
chế hoặc hạn chế hoàn toàn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
8
Ngoài các cơ chế chủ yếu trên thì CKS còn có thể tác động đến tế bào
VSV qua một số cơ chế khác như: tác động lên tính thấm của tế bào, tác động
9
ức chế được vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây
trồng [8].
Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực
nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ
khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum
gây bệnh thối rễ ở thực vật. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo
vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng
một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.
Ngoài ra, các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất
các chế phẩm sinh học của người nông dân. Do đó, cần có sự phối hợp thống
nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc
truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả
cao trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả
kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường, sức khỏe con người.
1.1.4. Validamycin A
1.1.4.1. Cấu trúc hóa học của validamycin A
Cấu trúc hóa học của val-A được Horii và Kameda và cộng sự xác
định: 1L-(1,3,4/2,6)-2,3-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(1S,4R,5S,6S)-
4,5,6-trihydroxy methylcyclohex-2-enylamino] cyclohexyl -D-
glucopyranoside. Hình ảnh val-A [32].
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của val-A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
10
Công thức phân tử: C
20
Độ bền: Val-A bền trong môi trường kiềm hay acid và bền dưới ánh
sáng mặt trời nhưng bị VSV đất phân hủy nhanh, thời gian bán hủy < 2 giờ.
P. denitrificans phân hủy val-A thành D-glucose và validoxylamine, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
11
validoxylamine tiếp tục bị phân hủy để tạo ra valienamine, validamine và các
hợp chất khác [25], [26].
1.1.4.3. Hoạt tính sinh học của val-A
Theo Nioh và Mizushima, val-A không gây ức chế sự sinh trưởng của
nấm và không làm thay đổi hàm lượng protein, nucleic acid và thành phần của
thành tế bào nhưng gây thay đổi hình thái của nấm R. solani bằng cách ức chế
quá trình sinh tổng hợp myo-inositol và làm giảm độc tính của nấm [32].
Validamycin A cũng ức chế trehalase của R. solani cũng như ở nhiều
loài sinh vật khác như chuột, thỏ, lợn, nấm men và côn trùng với IC
50
= 10
-8
-
10
-6
M. Trehalase được phân bố rộng rãi ở nhiều loài sinh vật, đóng vai trò
quan trọng trong việc điều hòa, cung cấp năng lượng (D-glucose) cho hệ cơ ở
cánh của côn trùng, cho quá trình nảy mầm của bào tử…Trong tế bào nấm
bệnh, trehalase xúc tác chuyển hóa trehalose thành đường glucose - nguồn
năng lượng cho nấm phát triển. Do đó, dưới tác động của val-A, tế bào nấm
sẽ tạo nhánh bất thường, bị khô dần và chết do không có khả năng tổng hợp
glucose để sinh trưởng [16], [34], [35].
thân lúa, bắp do R. solani, R. oryzae và Sclerotium oryzae-sativa gây nên.
Ngoài ra val-A còn trừ bệnh thối củ, thối rễ khoai tây, bông, cà chua và nhiều
loại rau do nấm R. solani gây nên [20], [43], [44]. Có thể phun dung dịch val-
A lên cây hay nhúng rễ cây, xử lý cây con và củ (khoai tây, cây giống rau).
Đối với lúa, phun khi lúa có đòng vào lúc 5-10 ngày trước khi trổ bông để trừ
bệnh khô vằn cổ bông, hoặc phun thuốc sau khi lúa trổ bông 5-7 ngày. Val-A
cũng có ảnh hưởng tới một số hoạt tính enzyme trong đất, ví dụ với hàm
lượng 240 mg/ml validamycin sẽ làm giảm 14% hoạt tính của catalase, gây ức
chế 67,3 % hoạt tính của urease và làm tăng hoạt tính của enzym axit
phosphatase 29,7%. Tuy nhiên, validamycin dễ dàng được các VSV đất sử
dụng làm nguồn carbon và năng lượng cho sinh trưởng. Vì vậy, sử dụng
validamycin sẽ không gây ảnh hưởng đến môi trường đất [46]. Voglibose,
một dẫn xuất valiolamine từ validamycin cũng được sử dụng rộng rãi để điều
trị bệnh tiểu đường [17], [48]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
13
Trên thế giới, một số nước như Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc đã sản
xuất validamycin ở qui mô công nghiệp bằng con đường sinh tổng hợp từ
VSV. Ngày nay, để sản xuất validamycin công nghiệp, người ta vẫn sử dụng
quá trình lên men bằng các chủng S. hygroscopicus subsp. jinggangensis [40],
[43]. Ngoài việc lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp, người
ta còn sử dụng các phương pháp gây đột biến nhằm tạo chủng có hoạt tính
cao [16], [45], [46]. Hầu hết các chủng được tuyển chọn bằng đột biến có
định hướng có thể làm tăng lượng validamycin thu được lên 54,4% so với
chủng gốc [45]; xử lý đột biến chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus subsp.
jinggangensis Yen KN-16 bằng UV có thể làm tăng 33,5% hiệu suất thu hồi
val-A so với chủng gốc [46]. Bên cạnh đó, bằng công nghệ đột biến bằng
khuẩn không phát triển hoặc phát triển kém. Các chủng xạ khuẩn phát triển
được ở nồng độ muối 3-5% (w/v), còn ở nồng độ cao hơn có thể bị ức chế
hoặc bị tiêu diệt [8], [9], [11]. Xạ khuẩn (actinomycet) là nhóm VSV đơn bào
hay vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước ao
hồ, nước biển, một phần trong bùn, lớp trầm tích và trong các chất hữu cơ
khác [25]. Một vài loài có thể gây bệnh cho động thực vật. Phần lớn xạ khuẩn
là các tế bào Gram (+), hoại sinh, có cấu tạo sợi phân nhánh. Xạ khuẩn được
nghiên cứu sâu vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên: tích cực tham
gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, trong nước, xạ
khuẩn có vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất của tự nhiên.
Chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng khác nên đã được
dùng để sản xuất nhiều loại enzyme như: protease, amylase, cellulase,
glucoizomerase, vitamin và các axit hữu cơ. Tuy nhiên đặc điểm quan trọng
nhất của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh, trong đó 60 - 70% xạ
khuẩn phân lập được từ đất có khả năng này [29]. Trong khoảng 8000 chất
kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn
sinh tổng hợp. Đây là kết quả của quá trình đối kháng giữa các VSV và thúc
đẩy quá trình tiến hóa của xạ khuẩn.
Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ
thể đơn bào, không có nhân thực và có kích thước giống vi khuẩn. Khuẩn lạc
xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong tương
Copyright: Tài liệu đại học ©