BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA CÔNG NGHỆ
------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG
CÁM GẠO THỦY PHÂN TRONG NUÔI CẤY
NẤM MEN YARROWIA LIPOLYTICA PO1G

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. Hồ Quốc Phong

Ngô Tường Vi
MSSV: 2096802
Ngành: Công Nghệ Hóa Học - Khóa 35

Tháng 5/2013


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

KHOA CÔNG NGHỆ

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG THI & XÉT TỐT NGHIỆP


PHIẾU NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
-----..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................

..................................................................................................................................


LỜI CẢM ƠN
Luận văn tốt nghiệp đánh dấu kiến thức, kĩ năng của mỗi sinh viên trƣớc khi tốt
nghiệp. Chính vì tầm quan trọng của nó mà trong suốt quá trình làm luận văn tôi đã
gặp nhiều áp lực và trở ngại. Nhƣng bằng sự giúp đỡ, ủng hộ của thầy cô, gia đình, bạn
bè, tôi đã có thể hoàn thành đƣợc luận văn này.
Xin cảm ơn quí Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ,
Đại học Cần Thơ đã chỉ dạy, cũng nhƣ tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Hồ Quốc Phong, Phó Trƣởng Bộ môn
Công nghệ hóa học, Khoa Công nghệ, Đại học Cần Thơ. Thầy đã cho tôi cơ hội cùng
nghiên cứu khoa học, đặc biệt gợi ý đề tài luận văn cho tôi. Không những vậy, Thầy đã
nhiệt tình hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình làm luận
văn.
Xin cảm ơn TS. Huỳnh Liên Hƣơng, Trƣởng PTN Công nghệ Hóa học đã tận
tình giúp đỡ, hƣớng dẫn kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu.
Đồng gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Thị Vân, Trƣởng PTN Sinh Kỹ thuật môi
trƣờng, Khoa Môi trƣờng và Tài nguyên thiên đã chỉ dẫn, hỗ trợ thiết bị và hóa chất vi
sinh giúp tôi hoàn thành đề tài một cách thuận lợi.
Tôi cảm thấy rất vui mừng khi bên cạnh mình có những ngƣời bạn luôn quan
tâm, động viên những lúc tôi thất bại. Xin cảm ơn học viên Cao học: Lê Trang Nguyên
Thƣ, Trƣơng Thị Cẩm Tú,...cùng các bạn trong PTN Công nghệ Hóa học. Đặc biệt,
cảm ơn bạn Võ Trƣờng Giang đã chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức giúp tôi hoàn thành
tốt luận văn này.
Cảm ơn Cha Mẹ luôn ở bên con, cổ vũ, động viên những lúc con khó khăn nhất.
Xin cảm ơn tất cả mọi ngƣời!

Sinh viên

ii


MỤC LỤC

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ................................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ............................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THỊ..................................................................... vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... ix
CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và giới hạn của đề tài .......................................................................... 2
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
2.1 Cám gạo ............................................................................................................ 3
2.2 Tổng quan về lilpid............................................................................................ 6
2.2.1 Glyceride.................................................................................................... 6
2.2.2 Phospholipid .............................................................................................. 8
2.2.3 Steride và sterol .......................................................................................... 8
2.2.4 Sáp ........................................................................................................... 9
2.3 Vi sinh vật cho dầu .......................................................................................... 10
2.3.1 Vi tảo ....................................................................................................... 10
2.3.2 Nấm men .................................................................................................. 10
2.3.3 Nấm men Yarrowia lipolytica................................................................... 11
2.4 Phƣơng pháp thủy phân ................................................................................... 13
2.4.1 Thủy phân bằng acid loãng ....................................................................... 13
2.4.2 Thủy phân bằng enzyme ........................................................................... 14



SVTH: Ngô Tƣờng Vi

iv


MỤC LỤC
4.5 Ảnh hƣởng của các hợp chất ức chế đến nồng độ đƣờng ................................. 30
4.6 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trƣởng của Y. lipolytica ........... 32
4.7 Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng đến sự sinh trƣởng của Y. lipolytica ................ 32
4.8 Thành phần lipid tích lũy ................................................................................. 33
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .................................................................. 35
5.1 Kết luận ........................................................................................................... 35
5.2 Hạn chế ........................................................................................................... 35
5.3 Kiến nghị......................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 36

SVTH: Ngô Tƣờng Vi

v


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Một số loài vi sinh vật cho dầu .......................................................... 10
Bảng 2.2: Một số chủng nấm men có khả năng tích lũy dầu .............................. 11
Bảng 2.3: Hàm lƣợng và thành phần chất béo trong sinh khối của một số loại
nấm men .......................................................................................... 12
Bảng 4.1: Điều kiện tối ƣu cho giai đoạn thủy phân CGTB ............................... 30

Hình 4.3 Sản phẩm thủy phân CGTB ở những thời gian khảo sát ...................... 26
Hình 4.4 Sự ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng ............... 26

SVTH: Ngô Tƣờng Vi

vii


MỤC LỤC
Hình 4.5 Mẫu CGTB thủy phân với tỉ lệ DDA/CGTB khác nhau ...................... 26
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn sự tối ƣu về tỉ lệ DDA/CGTB, độ chuyển hóa thu
đƣợc (g đƣờng/g CGTB) .................................................................. 28
Hình 4.7 Sản phẩm thủy phân ở những nhiệt độ khảo sát .................................. 29
Hình 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến nồng độ đƣờng tổng .............. 30
Hình 4.9 Sản phẩm CGTB thủy phân trƣớc và sau khử độc ............................... 32
Hình 4.10 Ảnh hƣởng của chất ức chế đến nồng độ đƣờng tổng ........................ 31
Hình 4.11 Sự ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ................................................ 32
Hình 4.12 Sự ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng đến nồng độ sinh khối và hàm
lƣợng lipid tích lũy của Y. lipolytica ................................................. 33
Hình 4.13 Sắc kí đồ thành phần acid béo trong tế bào nấm Y. lipolytica đƣợc
nuôi cấy trong môi trƣờng thủy phân CGTB .................................... 34

SVTH: Ngô Tƣờng Vi

viii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SCO............................................... single cell oil (Dầu đơn bào)
HMF .............................................. hydroxymethyl furfural

hợp BD và một trong những nguyên liệu hứa hẹn là chất béo (dầu) từ vi sinh vật hay
dầu đơn bào (single cell oil, SCO). Nguồn nguyên liệu này đƣợc xem nhƣ là tìm năng
để sản xuất biodiesel, bởi thời gian sản xuất ngắn, dễ dàng áp dụng ở quy mô công
nghiệp, thành phần tƣơng tự nhƣ acid béo của dầu thực vật [6].
Nấm men Yarrowia lipolytica có khả năng tích lũy hàm lƣợng chất béo cao trong
nội bào từ sự trao đổi chất với nền carbon. Y. lipolytica thƣờng đƣợc tìm thấy trong
môi trƣờng giàu chất nền kỵ nƣớc nhƣ alkane và chất béo. Với cơ chế phức tạp và sự
đa dạng của hệ gen Y. lipolytica có khả năng tích lũy chất béo trên 50% trọng lƣợng
khô của tế bào. Vì vậy, Y. lipolytica đƣợc xem nhƣ là một chủng nấm men có khả năng
tích lũy chất béo [7]. Chất béo từ nấm men đƣợc nuôi trên nền carbon giá rẻ, chẳng
hạn nhƣ phụ phẩm nông nghiệp.
Nguồn lignocellulose từ phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, vỏ rấu, bã mía, cám
gạo…) có thể tận dụng làm nguồn carbon nuôi cấy vi sinh vật sản xuất chất béo. Đây
cũng là một cách để xử lí hiệu quả phế phẩm nông nghiệp vì nguồn này nếu không có
cách xử lí hiệu quả sẽ gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trƣờng. Trong đó cám gạo
đã tách béo có thể là phụ phẩm lignocellulose trong các nhà máy trích ly dầu. Sau trích
ly dầu, cám gạo tách béo (CGTB) có thể đƣợc xem là nguồn lignocellulose tiềm năng
dùng cho quá trình nuôi cấy nấm men sản xuất chất béo.

1


CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.2 Mục tiêu và giới hạn của đề tài
Mục tiêu của đề tài tìm ra qui trình sử dụng cám gạo đã tách béo làm môi
trƣờng nuôi cấy nấm men. Trong đó xác định đƣợc các thông số tối ƣu của quá trình
thủy phân cám gạo và nuôi cấy nấm men Y.lipolytica. Qua đó đánh giá khả năng sử
dụng cám gạo tách béo làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy nấm men sản xuất chất béo.
Nội dung đề tài gồm hai phần: (i) khảo sát quá trình thủy phân cám gạo tách

-

Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy

SVTH: Ngô Tƣờng Vi

2


CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN
2.1 Cám gạo

Hình 2.1 Cám gạo
Cám gạo là phụ phẩm chính thu đƣợc từ lúa sau khi xay xát và thƣờng chiếm
khoảng 10% trọng lƣợng lúa [8]. Cám gạo đƣợc hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm
phôi của hạt, cũng nhƣ một phần từ tấm (Hình 2.1). Cám gạo có màu sáng và mùi
thơm đặc trƣng. Tỷ lệ protein trong cám gạo mịn có thể đạt 12 – 14%. Lƣợng protein
thô ở cám gạo cao hơn so bắp hạt. Lƣợng chất béo trong cám gạo rất cao (15 – 22%),
thƣờng dùng chiết xuất dầu cám, chất đạm trên 12%, chất sắt trên 14% [9, 10].

Hình 2.2 Cấu tạo của hạt lúa

3


CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN

Cám gạo tách béo (CGTB) giàu tinh bột và cellulose polysaccharide. Thành phần
chủ yếu: tinh bột (46,7%), cellulose và hemicellulose (11,3%), chất béo (1,4%) [8]. Tinh

Ngoài ra trong CGTB còn có một số thành phần khác nhƣ lignin có cấu trúc
không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình. Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở.
Lignin là polymer, đƣợc cấu thành từ các đơn vị phenylpropene (Hình 2.5).

Hình 2.5 Các đơn vị phenylpropene
Tinh bột trong cám gạo là nguyên liệu đại diện cho một nguồn tài nguyên sinh
khối quan trọng đối với quá trình lên men vi sinh vật bởi nó rẻ tiền, phong phú, dễ
dàng lên men. Tinh bột không phải là một hợp chất đồng thể, mà gồm 2 polysaccaride
khác nhau: amilose và amilopectin. Amilose có cấu trúc mạch thẳng, gồm 2 phân tử
glucose liên kết bằng 1,4 glucoside. Amilopectin ở dang mạch thẳng, phân nhánh. Liên
kết giữa trên mạch thẳng là 1,4 glucoside; liên kết trên mạch nhánh là 1,6 glucoside.
Nhƣ đã đề cập, tinh bột chiếm 47.6% thành phần CGTB.

SVTH: Ngô Tƣờng Vi

5


CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN

Hình 2.6 Cấu trúc amylose và amilopectin

2.2 Tổng quan về lipid [11]
Các chất béo động vật (mỡ) và chất béo thực vật tự nhiên (dầu) là các glyceride
tức là ester của glycerol và các acid béo. Cơ thể sinh vật gồm có ba thành phần cơ
bản là protein, glucide và lipid. Lipid là nguồn cung cấp năng lƣợng cho các cơ
thể sống nhiều hơn cả protein và glucide. Lipid đƣợc chia thành các nhóm nhƣ
glyceride, phosphatide, steride và sterol, sáp.
2.2.1 Glyceride
Glyceride hay acylglycerol là ester của glycerol và các acid béo (no, không no,

-

Capric acid có trong dầu hạt cọ, dầu dừa.

-

Lauric acid có trong dầu hạt cọ, dầu dừa.

-

Myristic acid có trong dầu hạt cọ, dầu dừa.

Các acid béo có chứa 16 nguyên tử carbon:
-

Palmitic acid có trong mỡ động vật, dầu hạt cọ, dầu dừa.

-

Palmitoleic acid có trong mỡ động vật, dầu thực vật.

Một số acid béo chứa 18 nguyên tử carbon:
vật khác.

Oleic acid có trong mỡ lợn, dầu olive, dầu dừa và nhiều loại dầu thực

-

Stearic acid có trong mỡ động vật, ca cao.


ester của phosphoric acid.

Lecithin

Cephalin

Lecithin có trong đậu tƣơng, đậu nành, gấc, trứng, gan...
Cephalin có trong trứng, gan, não...
R1, R2 là gốc của acid béo no và chƣa no.
Lecithin hay choline phospholipid cũng là triglyceride nhƣng chỉ có hai nhóm
hydroxyl của glycerol tạo ester với hai acid béo phân tử lƣợng cao (R 1COOH và
R2COOH), còn nhóm hydroxyl thứ ba của glycerol tạo ester với phosphoric acid và
nhóm hydroxyl thứ hai của phosphoric acid lại tạo ester với choline (trong lecithin) hay
cholamine (trong cephalin) hoặc với serine (trong phosphatidylserine)
2.2.3 Steride và sterol
Sterol là alcol mạch vòng, còn steride là ester của acid béo và sterol. Cholesteride
là ester của acid béo phân tử lƣợng cao và cholesterol (một sterol).

Hình 2.7 Cấu trúc cholesterol
SVTH: Ngô Tƣờng Vi

8


CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN

Cholesterol có công thức phân tử C27H47O, là alcol mạch vòng bậc hai và ester
của nó là cholesteride.
Cholesteride có cấu tạo nhƣ sau:


alcol bậc nhất có mạch carbon C32 và C34.

2.3 Vi sinh vật cho dầu
Khả năng tích lũy chất béo của một số loài vi sinh vật đã đƣợc biết đến trong
nhiều năm qua [7]. Trong đó, một số loài vi sinh vật có thể tích lũy chất béo tƣơng
đƣơng 86% trọng lƣợng khô tế bào [12] (Bảng 2.1). Những loài vi sinh vật này chủ yếu
là vi tảo, nấm men, nấm, vi khuẩn.
Bảng 2.1: Một số loài vi sinh vật cho dầu [12]
Vi sinh vật

Hàm lƣợng dầu
(% trọng lƣợng khô)

Botryococcus braunii
Cylindrotheca sp
Vi tảo
Nitzschia sp
Schizochytrium sp
Arthrobacter sp
Acinetobactercalcoaceticus
Vi khuẩn
Rhodococcus opacus
Bacillus alcalophilus
Candida curvata
Cryptococcus albidus
Nấm men
Lipomyces starkeyi
Rhodotorula glutinis
Aspergillus oryzae
Mortierella isabellina


10


CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN

Thêm vào đó chất béo thu đƣợc từ vi tảo bị hạn chế trong việc dùng để tổng hợp BD
do có nhiều thành phần acid béo không bảo hòa làm chúng dễ bị oxy hóa.
2.3.2 Nấm men
Một số nấm men cho dầu đƣợc mô tả là có thể tích lũy chất béo lớn hơn 20%
trọng lƣợng khô của tế bào [15]. Trong đó các chủng nấm men cho dầu điển hình bao
gồm Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon,
và Lipomyces [16] (Bảng 2.2). Tuy nhiên, trong số 600 loài nấm men, chỉ có 30 loài đã
đƣợc mô tả là có thể tích lũy hơn 25% trọng lƣợng khô tế bào [7].
Bảng 2.2: Một số chủng nấm men có khả năng tích lũy dầu [16]
Tên loài
Cryptococcus curvatus
Cryptococcus terricola
Rhodosporidium toruloides
Starmerella bombicola
Lipomyces tetrasporus
Yarrowia lipolytica

Tên gọi khác
Apiotrichum curvatum
Candida curvata
Cryptococcus terricolus
Rhodotorula gracilis
Zygolipomyces lactosus
Endomycopsis lipolytica


Hình 2.9 Hình ảnh nấm men Yarrowia lipolytica dƣới kính hiển vi [17]
Este steryl hình thành và vận động cung cấp các sterol cần thiết cho sự tăng sinh
màng. Sự lƣu trữ các phân tử lipid trong một khoang của các tế bào đƣợc gọi là cơ
quan lipid. Khi nguồn nitrogen bị hạn chế, vi sinh vật tiếp tục đồng hóa nguồn carbon,
tế bào không tiếp tục phát triển vì nguồn nitrogen không đáp ứng đủ cho sự tổng hợp
protein và nucleic. Vào lúc này, nguồn carbon thừa đƣợc chuyển sang tổng hợp lipid,
kết quả là tạo thành các hợp chất triacylglycerols trong tế bào [7].
Bảng 2.3: Hàm lƣợng và thành phần chất béo trong sinh khối của một số loại
nấm men [7]
% chất
béo
tích lũy

C16:0

C16:1

58

25

0

10

65
42
63
72

Lipomyces starkeyi
Rhodotorula glutinis

SVTH: Ngô Tƣờng Vi

Thành phần acid béo tích lũy
C18:0 C18:1

C18:2

C18:3

57

7

0

3
8
5
3

73
31
51
47

12
9

65

15

0

2

57

24

1

36

11

6

1

28

51

1

12