Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
MỞ ĐẦU
Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh
học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung. Thế kỷ 21
được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử mà
con tầu vũ trụ mang tên “ công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm
cao mới.Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát
triển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn hợp chất tự
nhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà.
Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật đã
không ngừng phát triển và và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể. Trên thế
giới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất có
hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục vụ lợi ích của con
người. Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ở thực vật phát triển từ
những năm 1950. Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có
hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống. Những hợp chất này như các alkaloid,
terpenoid, phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất này
thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định như các tế bào rễ tơ, biểu mô,
hoa, lá…
Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều
hợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổng
hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt. Chẳng hạn, một số hỗn hợp
phức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được.
Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây
cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc
sức khoẻ con người. Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ
thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Mặc
dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
1
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng
trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư
buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân
có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác và nó được xem như là
chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư [11]. Tuy nhiên, sử dụng
taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây
thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối
lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg
taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol
khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm [11]. Do đó, cần có
những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng
trong y học.
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
3
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để
cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của [32]. Hiện nay, việc sản xuất
taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng
rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn.
Fett-Neto và cộng sự (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và
một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. Cuspidata [14].
Srinivasan và cộng sự (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế
bào của T. Baccata [34]. Lee và cộng sự (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng
nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở
độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn
gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào
môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng
200 mg taxol [21].
Tsay và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào
huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa
này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-
synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là
0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8
tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH
môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung
40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3
lần so với đối chứng [23].
Yeh và cộng sự (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào
huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một
cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập
bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
(2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng
diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khốilượng khô. Sản xuất
diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được
ứng dụng trên quy mô công nghiệp [44].
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
5
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan.
Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung
Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc [45].
Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi
Gentiana [29]. Chueh và cộng sự (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và
swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi
nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH
4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin
và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy
[10].
Miyasaka và cộng sự (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi
precursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin [40]. Smollny và cộng sự
(1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được
0.3% podophyllotoxin [33].
Việc sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học
thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết
ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình
chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương
mại [3].
Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y-dược ngày càng tăng nhưng
sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển
không ngừng của công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh. [3].
1.2 Vài nét về tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứu cấp chủ yếu gắn liền với
công nghệ nuôi cấy tế bào và chúng phát triển vào những năm 1970. Từ đó đến nay
đã đạt được nhiều thành công, đáng kể nhất chính là quy trình sản xuất sâm Ngọc
Linh do Học viện Quân y khai thác. Chỉ với một vài tế bào từ rễ củ sâm Ngọc Linh,
bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào, các nhà khoa học của Học viện Quân y đã có thể sản
xuất sâm Ngọc Linh với số lượng lớn trong vòng 10-20 ngày. Cụ thể là đã hoàn
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
7
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
chỉnh quy trình nuôi cấy tế bào, xây dựng được quy trình định tính và định lượng
các thành phần ginsenosid trong sinh khối sâm Ngọc Linh bằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao (HPLC), so sánh với sâm Ngọc Linh tự nhiên và chất chuẩn; đánh giá tính
an toàn và tác dụng dược lý của sâm Ngọc Linh, bào chế thành công được một số
chế phẩm từ hoạt chất chiết xuất từ sâm Ngọc Linh sinh khối như nước uống tăng
lực và viên nang mềm. Các công nghệ này đang được Công ty Nước khoáng Tiền
Hải (Thái Bình) đề xuất chuyển giao để sản xuất nước tăng lực. Phương pháp sản
xuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh được cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523
vào ngày 11/02/2009 tại Việt Nam [6].
Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm. Alkaloid là:
- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở
trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật.
- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh.
- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng.
- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng.
Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong
lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc
đáo.
2.2.2 Cấu tạo hóa học.
Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một
chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp
chí thông tin về hóa học. Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi
vì chúng có hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu.
Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ
yếu nằm trong vòng. Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin,
Hordenin, là các protoalkaloid. Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết
định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong
nghiên cứu alkaloid.
2.2.3 Phân loại.
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
9
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
Đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợp chất
alkaloid trong tự nhiên. Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước
đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) xét ra chưa đáp ứng nên ngày càng có xu hướng
chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin,
Strychnin, Echitamin. Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành các
nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin…
Bảng 1:Một số dạng cấu trúc nhóm Alkaloid
phần vạn, mười vạn. Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có
Alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% Alkaloid so với dược liệu khô.
Mối liên quan giữa Alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã được
nghiên cứu. Cây có chứa Alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
11
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
(Trelibs,1955) . Hiện tượng này đưa đến ý kiến cho rằng chức năng của 2 nhóm hợp
chất này đối với cây cỏ là giống nhau.
Một vài nhận xét khác là sự có mặt của axit amin thông thường và 1 vài loại
axit amin đặc biệt (tiền chất của Alkaloid) trong các loài với nồng độ song song với
nồng độ Alkaloid (Michels – Nyomorkay, 1970; Paris và Girre, 1969). Điều này
khẳng định thêm quá trình tổng hợp Alkaloid trong cây bắt nguồn từ các axit amin.
2.2.5. Sinh tổng hợp Alkaloid.
Có rất nhiều sách và tổng quan đề cập đến vấn đề sinh tổng hợp Alkaloid trong
cây ( Mothes và Schute, 1969; Robinson, 1968; Spenser, 1970).
Nói chung cho đến nay người ta thừa nhận rằng đại đa số Alkaloid là dẫn xuất
của Axit amin. Mối quan hệ giữa Alkaloid và các axit amin đã được biết đến từ đầu
thế kỷ 20 và đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp Alkaloid từ axit amin.
Có thể nói giai đoạn quan trọng đầu tiên trong sự chuyển hóa axit amin thành
Alkaloid là sự khử Cacboxyl thành một amin và tiếp đến là sự oxy hóa amin này
thành andehyt bởi men oxydaza amin. Việc ngưng tụ một nhóm amin bởi Andehyt
dẫn đến tạo các vòng đặc trưng cho Alkaloid
Mặc dù đại đa số Alkaloid dẫn xuất của axit amin nhưng một số Alkaloid khác
lại bắt nguồn từ một số tiền chất riêng. Bằng phương pháp dùng axit amin có
nguyên tố đồng đánh dấu người ta chứng minh rõ ràng về các tiền chất Alkaloid.
2.3. Tính chất của Alkaloid [1][26].
2.3.1. Tính bazơ.
Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N. Nhưng độ kiềm của
Alkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử N
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
Bazơ của Alkaloid có N – Bậc 4 và N – Oxit khác tan trong nước và trong
kiềm ít tan trong dung môi hữu cơ. Các muối của chúng có độ hòa tan khác nhau
tùy thuộc vào gốc axit tạo ra chúng. Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm
và kết tủa dưới dạng muối có độ hòa tan thấp nhất.
Đối với các Alkaloid N – Oxit thì dùng phản ứng khử. Oxy bằng bột kẽm trong
môi trường HCl để chúng chuyển thành Alkaloid dạng thường sau đó kết tủa bằng
kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ.
2.4. Cơ sở và nguyên tắc tách chiết Alkaloid [1][26]..
2.4.1 Cơ sở và nguyên tắc.
- Dựa vào những định luật chi phối của quá trình chiết xuất là khuếch tán, thẩm
thấu, thẩm tích, độ hòa tan.
- Dựa vào khă năng hòa tan của các Alkaloid trong các dung môi hữu cơ, vô cơ
và nước mà ta tiến hành tách chiết các Alkaloid ra khỏi nguyên luyện.
- Dựa vào các tính chất lý hóa của các Alkaloid mà ta tiến hành tác chiết và
tinh sạch chúng.
2.4.2. Một số đặc tính khác cần chú ý trong quá trình chiết xuất.
Trong cây, Alkaloid tồn tại dưới dạng muối của các axit hữu cơ nhưng một số
kết hợp với tanin (nhất là những cây có nhiều tanin) vì vậy đối với dược liệu có
nhiều tanin thì cần dùng dung môi có độ phân cực mạnh hơn hoặc chiết nóng để
tách Alkaloid ra khỏi tanin và hòa tan vào dung môi.
Một số loại Alkaloid là các este như Atropin, Cocain, Heliotrin có thể bị thủy
phân trong quá trình chiết xuất nên rất hạn chế sử dụng nhiệt độ cao. Ngược lại một
số Alkaloid tồn tại trong cây dưới dạng Glycozit (Glycoancaloit) như Solamacgin,
solasonin trong các loài Solanum. Để chiết các Alkaloid này cần có giai đoạn thủy
phân.
Nói chung, một số Alkaloid là một chất tương đối bền vững so với nhiều chất
tự nhiên khác. Nhưng một số hợp chất thuộc nhóm indol rất dễ bị thủy phân hoặc
biến chất bởi ánh sáng và các tác nhân oxy hóa – khử khác nên cần chú ý khống chế
các yếu tố có thể làm hỏng Alkaloid trong quá trình chiết xuất trong khí quyển nitơ.
NaOH; vôi) để yên 1 – 2 giờ.
- Cho bột dược liệu đã tẩm vào binh Soxhlet. Cho CHCl
-3
vào ngập bột dược liệu,
ngâm 1 – 2 giờ.
- Tiến hành chiết nóng. Với lượn dược liệu bé thường thì từ 3 – 6 giờ là đủ. Nếu
chiết trên 1 kg thì chiết bằng đun hồi lưu từ 6 – 10 giờ và chiết lại lần thứ 2 từ 2 – 4
giờ.
- Dịch chiết clorofoc, cất thu hồi dung môi còn khoảng độ 1/2 hoặc 1/3. Sau đó lắc
với dung dịch axit hữu cơ hoặc vô cơ 1 – 2 %. Các axit có thể dùng là : tactic,
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
15
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
axetic, sunfuric, HCl. Như đã nói ở trên, cần xem xét pKa của các Alkaloid định
chiết để cho đủ lượng axit cần thiết để chuyển Alkaloid bazơ trong dung dịch chiết
CHCl
3
thành muối hòa tan trong nước. Nếu không đủ axit Alkaloid sẽ nằm lại trong
lớp CHCl
-3
.
Lượng dung dịch axit mỗi lần chiết không cần nhiều nhưng cần chiết nhiều
lượt. Với 100 ml dung dịch CHCl
-3
thì lần đầu dùng 20 – 30 ml dung dịch axit và
các lần sau (5 – 7 lần) chỉ cần dùng 15 ml. Theo dõi bằng thuốc thử Alkaloid trong
quá trình tách chiết.
Chú ý kỹ thuật chiết rất quan trọng. Phải chiết kiệt nhưng đồng thời không để
dung dịch bị nhũ hóa. Thường mỗi lần chiết, lắc bình chiết qua lại 100 lần là đủ.
Nếu bị nhũ hóa không nhiều ta có thể xử lý bằng cách ly tâm hoặc lọc qua lớp giấy
hoặc 50 ml ete và lắc trong 15 phút ).
Nếu có điều kiện để dung dịch CHCl
-3
này vào bình hút ẩm qua đêm, sau đó
lọc và cất thu hồi dung môi, được Alkaloid.
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
16
Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh GVHD: TS. Đỗ Thị Tuyên
Bột dược liệu được tẩm
kiềm chiết nóng CHCl
3
Cất thu hồi CHCl
3
.
Hòa cắn vào nước
axit 1%
Dịch chiết axit lắc dung môi
hữu cơ loại tạp
Dung dịch axit kết
tủa bằng kiềm pH=
10 – 12
Dung dịch axit lần lượt
chiết CHCl
3
ở pH khác
nhau
Dịch chiết CHCl
3
cất dung
môi
- Stricnin nitrat có độ hòa tan trong nước ở 25
0
c là 2.3 %.
Như vậy để chiết Stricnin trong hạt mã tiền nên dùng axit sunfuric. Nồng độ
axit thường là 0.5 – 1 %.
Dung dịch nước axit là dung môi rẻ tiền và thích hợp cho sản xuất Alkaloid
hiện nay. Nhưng có một nhược điểm cơ bản là nước khó bốc hơi vì vậy khi cần cô
đặc dung dịch để kết tủa dung dịch Alkaloid dạng bazơ được triệt để thì vệc thực
hiện sẽ khó khăn nhất là trong điều kiện chưa có đủ trang thiết bị hệ thống cô bằng
áp suất giảm.
Vì vậy điều kiện cho phép thì thay nước axit bằng cồn axit. Cồn có thể dùng là
cồn metylic, etylic, hoặc propylic. Cồn axit có khả năng hòa tan Alkaloid mạnh hơn
nước axit đồng thời ít hòa tan tạp chất ( protein thực vật, hydratcarbon…) hơn nước.
Ưu điểm cơ bản của cồn là dễ bốc hơi nên dễ dàng cô đặc để kết tủa triệt để
Alkaloid vì vậy hiệu suất thu được bằng chiết cồn axit bao giờ cũng cao hơn chiết
bằng nước axit.
Phương pháp chiết tốt nhất đối với dung môi nước hoặc cồn axit là chiết ngâm
kiệt và áp dụng kỹ thuật chiết ngược dòng, lấy một phần dịch chiết đầu để riêng,
phần dịch chiết sau làm dung môi để chiết mẻ mới.
Dịch chiết thu được tiến hành các giai đoạn tiếp theo như sau:
- Nếu là dịch chiết nước : Để yên 1 – 3 ngày (có điều kiện nên để lạnh) để lắng tạp.
Sau đó gạn lọc, nếu hàm lượng Alkaloid trong dung dịch quá thấp, cần cô đặc thì
chuyển pH dung dịch bằng 7 – 8 trước khi cô đặc, vì môi trường axit Alkaloid dễ bị
hỏng bởi nhiệt độ hơn là môi trường trung tính hoặc kiềm.
- Nếu là dịch chiết cồn axit : trung hòa axit (pH =7) rồi cất thu hồi cồn. Sau đó hòa
cặn vào dung dịch axit 1%. Để yên 1 – 3 ngày như trên.
Sv: Vũ Xuân Tạo Chuyên ngành hóa sinh.
18
Copyright: Tài liệu đại học ©