Kết quả - Biện luận

CHƢƠNG III.
KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN

- 56 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

3.1 Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
3.1.1. Thu nhận gen fgf2 bằng phản ứng PCR
Gen fgf2 đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp PCR với khuôn là plasmid pIDT-fgf2.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn,
kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.1.

Hình 3.1. Sản phẩm PCR thu nhận gen fgf2; giếng 1, thang DNA 1kb plus;
giếng 2, sản phẩm PCR đoạn gene fgf2 với cặp mồi FGF2-F và FGF2-R
Trong hình 3.1, ở giếng 2 xuất hiện một vạch DNA có kích thƣớc khoảng 450bp
khi so sánh với thang chuẩn 1kb plus (giếng 1), bằng với kích thƣớc dự đoán của gen
fgf2. Nhƣ vậy, chúng tôi có thể đã khuếch đại đƣợc đúng đoạn gen mục tiêu cần dùng.
Sau đó, đoạn gen fgf2 thu đƣợc từ phản ứng PCR sẽ đƣợc xử lý với cặp enzyme BamHI
và NdeI để chuẩn bị cho phản ứng nối với plasmid pET-His đã cắt mở vòng để tạo
plasmid tái tổ hợp.

- 57 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


chúng tôi thực hiện phản ứng nối trực tiếp plasmid này với gen fgf2. Hỗn hợp sản
phẩm nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả nạp E. coli DH5α. Thực hiện đối chứng âm là
tế bào DH5α không đƣợc biến nạp sản phẩm nối. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.3.

Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α
1, Đĩa đối chứng;2, Đĩa biến nạp
Ở đĩa đối chứng, các tế bào E. coli DH5α không đƣợc biến nạp sản phẩm nối
pET-fgf2 nên không mang gen kháng kháng sinh. Do đó, các tế bào này không tăng
trƣởng đƣợc trên đĩa môi trƣờng LB-Amp100.
Ở đĩa biến nạp, các tế bào E. coli DH5α đƣợc biến nạp với hỗn hợp sản phẩm nối
chứa pET-fgf2 có mang gen kháng kháng sinh. Do đó, các tế bào này tăng trƣởng đƣợc
trên đĩa môi trƣờng LB Amp100. Các khuẩn lạc mọc đƣợc trên môi trƣờng LBAmp100 sẽ đƣợc tiếp tục kiểm tra để chọn lọc dòng mang vector tái tổ hợp.
- 59 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

3.1.4. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
Để khẳng định các thể biến nạp thu đƣợc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2, chúng
tôi tiến hành sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc các thể biến nạp bằng cặp mồi đặc hiệu
FGF2-F/FGF2-R và cặp mồi T7 promoter/T7 terminator. Kết quả đƣợc trình bày ở
hình 3.4.

Hình 3.4. Kết quả sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5α bằng PCR khuẩn lạc
giếng 1, thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi
FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pIDT-fgf2 bằng cặp mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 5,
PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator; giếng 6,7,
PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator.

hợp pET-fgf2 đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R, cặp mồi T7promoter/T7terminator và bằng enzyme cắt hạn chế. Kết quả
kiểm tra đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Ở giếng thứ 3 (hình 3.5), xuất hiện một vạch có kích thƣớc nằm giữa hai vạch
thang 250bp và 500bp, tƣơng ứng với kích thƣớc gen fgf-2 đƣợc khuếch đại bằng mồi
đặc hiệu (438bp). Bên cạnh đó, sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp bằng cặp mồi
- 61 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

T7promoter/T7terminator cho một vạch có kích thƣớc nằm giữa khoảng 500-700bp
tƣơng ứng với tổng kích thƣớc của gen fgf-2 (438bp) và một phần trình tự giữa hai mồi
trên plasmid (giếng 5).

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp
PCR và cắt hạn chế; giếng 1, Thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His
với cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pET-fgf2 bằng mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi MCS
T7promoter/T7terminator; giếng 5, PCR plasmid pET-fgf2 bằng cặp mồi
T7promoter/T7terminator; giếng 6, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2; giếng 7, Plasmid
tái tổ hợp pET-fgf2 cắt bằng enzyme EcoRI; giếng 8, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2
cắt bằng hai enzyme BamHI và NdeI.
Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi đƣợc cắt bằng EcoRI cho một vạch có
kích thƣớc ngang với vạch thang 5000bp của thang chuẩn, chứng tỏ plasmid này đã
đƣợc chèn thêm một đoạn gen. Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi đƣợc cắt bằng BamHI

- 62 -

Luận văn thạc sĩ sinh học



Kết quả - Biện luận

Hình 3.6. Kết quả biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3)
1, Đĩa đối chứng; 2, Đĩa biến nạp
Trên đĩa đối chứng (1), chúng tôi tiến hành trải những tế bào không mang
plasmid tái tổ hợp pET-fgf2. Những tế bào này không có khả năng kháng kháng sinh,
nên không phát triển đƣợc trên môi trƣờng LB-Amp, vì vậy không thấy xuất hiện
khuẩn lạc trên đĩa (1). Ngƣợc lại, trên đĩa biến nạp (2), những thể biến nạp có mang
plasmid tái tổ hợp nên có khả năng kháng kháng sinh, phát triển và tạo khuẩn lạc.
Sau đó, các khuẩn lạc này đƣợc kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R để sàng lọc những thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp mong muốn.
3.2.2. Sàng lọc thể biến nạp bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc
Các khuẩn lạc mọc đƣợc trên môi trƣờng LB-Amp100 đƣợc chọn thực hiện kiểm
tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R.

- 64 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Hình 3.7. Kết quả PCR khuẩn lạc tế bào E. coli BL21(DE3) bằng cặp mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 1, thang chuẩn 1kb; giếng 2, sản phẩm PCR plasmid pET-His; giếng
3, sản phẩm PCR plasmid pIDT-fgf2; giếng 4, sản phẩm PCR khuẩn lạc E. coli
BL21(DE3).
Kết quả điện di cho thấy ở giếng 2 không thấy xuất hiện vạch khuếch đại do
khuôn mẫu sử dụng là vector không mang gen fgf2, còn ở giếng 4 xuất hiện một vạch
DNA có kích thƣớc bằng với kích thƣớc của mẫu chứng dƣơng (giếng 3). Nhƣ vậy,
chúng tôi đã biến nạp thành công pET-fgf2 vào chủng E. coli BL21(DE3). Những

tan từ dòng tế bào E. coli BL21(DE3).

- 66 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

3.4. Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein
FGF-2 tái tổ hợp dạng tan
3.4.1. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng
Quá trình lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc tiến hành bằng hệ thống lên men tự động trong vòng 24
giờ với chất cảm ứng là IPTG bổ sung ở giờ thứ 8. Sự tăng trƣởng của chủng trong
suốt quá trình lên men đƣợc theo dõi thông qua việc phân tích trọng lƣợng khô tế bào
sau mỗi 2 giờ lên men. Kết quả phân tích trọng lƣợng khô tế bào đƣợc trình bày trong
hình 3.9.

Hình 3.9. Kết quả phân tích trọng lượng khô tế bào trong quá trình lên men. Hình đại
diện cho ba lần thí nghiệm lặp lại
Dựa vào đồ thị cho thấy trọng lƣợng khô của tế bào tăng dần trong suốt quá trình
lên men và ổn định ở những giờ cuối. Điều này phù hợp với đặc trƣng tăng trƣởng của
chủng, chứng tỏ sự xuất hiện của vector tái tổ hợp không làm thay đổi đặc tính sinh lý
của chủng. Theo kết quả phân tích trọng lƣợng khô tế bào, lƣợng tế bào khô thu nhận

- 67 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


suốt quá trình lên men. Tỉ lệ này đạt cao nhất ở giờ thứ 24, lƣợng FGF-2 chiếm 10,9%
lƣợng protein tổng. Tuy nhiên, kết quả cho thấy chủng biểu hiện không ổn định, lƣợng
protein mục tiêu không tăng đều theo thời gian. Do đó, cần phải có những khảo sát mở
rộng nhằm đánh giá thời điểm dừng lên men để mang lại sản lƣợng cao nhất và chi phí
sản xuất thấp nhất.
Bảng 3.1. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 trong pha
tan (%) sau mỗi 2 giờ lên men
Thời gian lên

Thời gian sau cảm

Tỉ lệ FGF-2

men (giờ)

ứng (giờ)

trong pha tan (%)

10

2

5,8

12

4

7,5


24

16

10,9

3.4.3. Khảo sát chu kì phá tế bào bằng áp suất cao
Sau 24 giờ lên men, toàn bộ dịch lên men đƣợc ly tâm thu nhận sinh khối E. coli.
Sinh khối đƣợc phá tế bào bằng phƣơng pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao. Nhằm
đảm bảo lƣợng FGF-2 dạng tan có thể thu nhận đƣợc sau quá trình phá tế bào là cao
nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát số chu kỳ phá mẫu. Mẫu protein thể vùi và thể tan

- 69 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

sau mỗi chu kì phá mẫu đƣợc tiến hành điện di SDS-PAGE nhằm xác định lƣợng FGF2 thu đƣợc sau mỗi chu kỳ. Kết quả điện di này đƣợc trình bày trong hình 3.3.
Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE các mẫu phá tế bào theo chu kì cho thấy dịch
sinh khối tế bào phần lớn đƣợc phá ngay chu kì đầu tiên và protein mục tiêu nằm trong
phân đoạn dịch tan của tế bào. Để xác đinh chu kì phá tế bào tối ƣu, chúng tôi sử dụng
phần mềm Quantitive One để xác định phần trăm lƣợng protein mục tiêu thu đƣợc
trong dịch tan sau mỗi chu kì phá tế bào. Từ số liệu có đƣợc, chúng tôi sẽ xác định
đƣợc chu kì phá mẫu tối ƣu để thu nhận lƣợng protein mục tiêu là cao nhất.

Hình 3.11. Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein sau các chu kì phá tế bào
bằng phương pháp đồng nhất hóa dựa vào áp suất cao. 1, Thang protein phân tử

3

12,6

Dịch nổi thu nhận sau khi ly tâm đƣợc định lƣợng Bradford nhằm đánh giá hiệu quả
của quá trình lên men. Kết quả sau xử lý đƣợc trình bày ở bảng 3.
Bảng 3.3. Hiệu quả thu nhận FGF-2 ở chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF sau quá
trình lên men
Sinh khối khô (g/l) (X)

5,20 ± 0,53

Lƣợng protein tổng thu đƣợc trong 1
lít dịch lên men (g) (Y)
% FGF-2 trong pha tan (Z)

2,11 ± 0,29
10,9

Lƣợng FGF-2 (g/l) (T)

0,23 ± 0,03

Hiệu quả thu nhận FGF-2 (E%)

4,42 ± 0,97

Kết quả ghi nhận đƣợc ở bảng 3.3 cho thấy quá trình lên men chủng
BL21(DE3)/pET-FGF thu đƣợc 0,23 ± 0,03 g protein FGF-2 dạng tan trong một lít
dịch lên men với tỉ lệ FGF-2 trong pha tan là 10,9%, đạt hiệu quả thu nhận FGF-2 là


Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

thấp; 2, mẫu protein trước khi qua cột; 3, phân đoạn protein không gắn lên cột; 4-8
lần lượt là phân đoạn 20%, 40%, 60%, 80%, 100% dung dịch dung ly B.
Kết quả điện di SDS-PAGE đƣợc trình bày ở hình 3.12 cho thấy ở phân đoạn 20%
dung dịch B xuất hiện một vạch protein nằm giữa 2 vạch có kích thƣớc 14,4kDa và
20,1kDa trên thang chuẩn, phù hợp với khối lƣợng của FGF-2 (18kDa) và cho tín hiệu
dƣơng tính khi lai với kháng thể kháng FGF-2. Do vậy, chúng tôi kết luận đây chính là
vạch FGF-2 mục tiêu. Ở những phân đoạn dung ly tiếp theo, chúng tôi không thấy xuất
hiện vạch protein mục tiêu. Nhƣ vậy protein mục tiêu đã đƣợc dung ly hoàn toàn ở
20% dung dịch B. Protein ở phân đoạn 20% đƣợc thu nhận, đánh giá độ tinh sạch cũng
nhƣ hiệu suất thu hồi và tiếp tục đƣợc tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin tiếp theo
nhằm thu nhận FGF-2 tinh sạch trên 95%.
Hiệu quả của quá trình tinh chế sắc ký trao đổi cation đƣợc đánh giá bằng phần
mềm Quantity One (phụ lục 5) và phƣơng pháp Bradford. Kết quả tính toán cho thấy
với cột trao đổi cation SP FF 5ml, chúng tôi đã thu nhận protein tái tổ hợp FGF-2 có độ
tinh sạch 78,5% với hiệu suất thu hồi là 60,06% (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Hiệu suất của quá trình tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation
Nồng độ

Tổng

protein

protein


(ml)

Trƣớc
Sau
Hiệu suất

Độ tinh
sạch (%)

Lƣợng
FGF-2
(mg)

60,06%

3.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực với heparin
Do FGF-2 có thể tƣơng tác đặc hiệu với heparin, nên trong thí nghiệm này sử dụng
cột sắc ký Heparin để tinh chế bƣớc hai nhằm tăng độ tinh sạch của sản phẩm protein
tái tổ hợp FGF-2 lên trên 95%.

- 73 -

Luận văn thạc sĩ sinh học


Kết quả - Biện luận

Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế bằng sắc kí ái lực heparin cho thấy,
ở giếng 4 (hình 3.13) tƣơng ứng với phân đoạn dung ly 60% dung dịch B xuất hiện
một vạch duy nhất khoảng 18kDa, ngang với vạch FGF-2 trƣớc tinh chế. Đồng thời,


protein (mg)

sạch (%)

FGF-2

chế

(ml)

Trƣớc

30

0,34

10,20

78,50

7,65

Sau

11

0,55

6,05


Độ tinh
sạch (%)

Hiệu suất
riêng của
bƣớc (%)

Hiệu suất
thu hồi (%)

230,33

6,90

100

100

138,34

78,50

60,06

60,06

106,15

97,10