TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
**********

ĐẶNG THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
ÁP SUẤT THẨM THẤU ĐẾN MỘT SỐ
CHỈ TIÊU SINH LÝ, SINH HÓA CỦA
ĐẬU TƯƠNG DT02 VÀ DT84

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. NGUYỄN VĂN MÃ

Hà Nội - 2011


LỜI CẢM ƠN

Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS, TS. Nguyễn Văn Mã đã
tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô tại Trung tâm Hỗ trợ và nghiên
cứu khoa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và các thầy cô phòng thực
hành sinh lý thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ cho tôi hoàn thành công việc của
mình.

Xuân Hòa, ngày 10 tháng 5 năm 2011

3 – dimethylsunfulfonio propionate

ĐC:

đối chứng

NXB:

nhà xuất bản

Ptt:

áp suất thẩm thấu

P5CS:

delta 1 – pyrrolin – 5 – cacboxylat synthetaza

PDH:

prolin dehydrogennaza

STT:

số thứ tự

TN:

thí nghiệm


v


Hình 3.15. Hoạt độ α - enzyme amylaza ở mầm đậu tương DT02 và DT84
dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 5)
Bảng 3.16. Hoạt độ enzyme proteaza ở hai giống đậu tương DT02 và DT84
Hình 3.17. Hoạt độ enzyme proteaza ở đậu tương DT02 và DT84
dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 2)
Hình 3.18. Hoạt độ enzyme proteaza ở đậu tương DT02 và DT84
dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 4)
Hình 3.19. Hoạt độ enzyme proteaza ở đậu tương DT02 và DT84
dưới tác động của áp suất thẩm thấu ( ngày 6)
Bảng 3.20. Hoạt độ enzyme lipaza của đậu tương DT02 và DT84 ở các
áp suất thẩm thấu
Hình 3.21. Hoạt độ enzyme lipaza của đậu tương DT02 và DT84
dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 1)
Hình 3.22. Hoạt độ enzyme lipaza của đậu tương DT02 và DT84
dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 3)
Hình 3.23. Hoạt độ enzyme lipaza của đậu tương DT02 và DT84
dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 5)

vi


MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài……………………………………………………...2

3.1.

Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự nảy mầm của đậu tương DT02
và DT84………………………………………………………………..22

3.2.

Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hàm lượng prolin trong
mầm đậu tương DT02 và DT84………………………………………28

3.3.

Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số enzyme trong mầm
đậu tương DT02 và DT84…………………………………………. ..30

KẾT LUẬN………………………………………………………….………40
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………….……..41

1


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tương là giống cây trồng phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Ở nước
ta đậu tương là cây lương thực được sử dụng phổ biến cho cả người và vật
nuôi. Có rất nhiều giống đậu tương là giống có năng suất cao được sử dụng
phổ biến trên cả nước như: DT84, DT96, DT99 [3].
Thành phần dinh dưỡng của đậu tương rất phong phú, hàm lượng protein
cao nên đậu tương được dùng chế biến thực phẩm giàu dinh dưỡng và đáp
ứng nhu cầu của con người như: bột ngũ cốc, bột đậu, tương, giá đỗ... Cây

kiện gây hạn…Áp suất thẩm thấu chính là nguyên nhân gây sự chênh lệch
giữa nồng độ trong và ngoài rễ cây làm cho cây không thể hút được muối
khoáng và nước để nuôi cây.
Cùng với sự ấm dần lên của trái đất, cây trồng cũng phải thích nghi với
điều kiện môi trường. Cây trồng có sức chống chịu tốt mới có thể tồn tại và
nâng cao năng suất. Quỹ Nghiên cứu M.S. Swaminathan, đã bắt đầu công
việc bảo tồn sự đa dạng nguồn gen giống cây trồng nông nghiệp nhằm đảm
bảo nguồn cung lương thực bền vững bằng cách thành lập những ngân hàng
hạt giống cộng đồng. Dự án đã khuyến khích trồng những loài cây thuốc đang
bị khai thác quá mức tại các khu vườn cộng đồng, nhằm làm giảm sự phụ
thuộc và phá huỷ rừng tự nhiên [35]. Đậu tương cũng là một trong những
giống cây trồng được quan tâm đến vì tính ứng dụng rộng rãi và giá trị mà nó
đem lại. Ngày nay sự biến đổi khí hậu ngày càng sâu sắc, việc nghiên cứu khả
năng chống chịu của cây trồng cũng ngày càng trở nên cấp thiết. Chúng tôi
nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến đậu tương cũng chính là
nghiên cứu khả năng chống chịu của hai giống đậu tương này. Dung dịch
đường được sử dụng làm môi trường với các áp suất khác nhau.

3


Mục tiêu nghiên cứu nhằm tìm hiểu tác động của áp suất thẩm thấu tới sự
phát triển của đậu tương và đối với sự biến đổi hàm lượng axit amin prolin, sự
biến đổi các chất dự trữ trong mầm như protein, lipit, tinh bột.
Từ nhu cầu thực tế nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh
lý, sinh hóa của đậu tương DT02 và DT84” nhằm tìm hiểu sự biến đổi sâu
sắc hơn về sinh lý, sinh hóa của đậu tương khi gặp điều kiện áp suất thẩm
thấu khác nhau, kết quả này có thể làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn
vùng sinh thái thích hợp để gieo trồng đậu tương. Trên thực tế giống đậu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về cây đậu tương
1.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển của đậu tương
Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill thuộc chi Glycine
(L) họ Fabaceae bộ Fabales. Bộ Fabales là một trong những cây trồng cổ
nhất của nhân loại, có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc) xuất phát từ một
loài đậu nành dại thân mảnh, dạng dây leo có tên khoa học là Glycine soja
Sieb và Zucc. Từ Trung Quốc cây đậu nành lan truyền dần ra khắp thế giới.
Theo các nhà khoa học Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên đậu
nành được đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật. Đến giữa thế
kỷ XVII đậu nành mới được các nhà thực vật người Đức Engelbert
Caemopfer đua về Châu Âu và đến năm 1954 đậu nành được du nhập vào
Hoa Kỳ [1], [4], [16]và tới ngày nay chúng đã trở thành loài cây trồng phổ
biến, là nguồn thức ăn của cả loài người và động vật.
1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng và vai trò của đậu tương
Đậu tương là cây trồng phổ biến, là cây nông nghiệp ngắn ngày điển
hình, chúng rất nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho
đậu tương sinh trưởng là 20 – 300C, độ ẩm không khí là 81 – 85% và có các
phản ứng đặc trưng khi gặp cường độ ánh sáng mạnh. Đậu tương có bộ rễ đặc
biệt có khả năng hình thành các nốt sần để cố định đạm do có sự cộng sinh
với các vi khuẩn Rhizobium có khả năng cố định nitơ từ không khí. Lá gồm lá
đơn và lá kép, các chồi ở nách lá từ mặt thứ năm trở lên phát triển thành chồi
hoa rồi chùm hoa. Quả sẽ phát triển sau một tuần từ khi hoa bắt đầu nở trên
cây, rễ đậu tương là loại rễ chùm.
Cây đậu tương sinh trưởng được trên nhiều loại đất khác nhau như: đất
sét, đất thịt, thịt pha cát… và có khả năng cải tạo đất rất tốt.

6



các loại phụ phẩm của đậu tương có thể tận dụng cho chăn nuôi: thân, lá tươi
cho trâu bò, bột nghiền từ thân,lá khô, vỏ quả, hạt lép và khô được dùng làm
thức ăn cho gia súc.
Trong y học cây đậu tương có ý nghĩa rất quan trọng chữa được một số
bệnh như: tim mạch, chống ung thư, ngăn ngừa bệnh loãng xương của tuổi già
[4], [1], [16].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương
Tình hình sản xuất cuẩ đậu tương trên thế giới đã tăng một cách đáng kể
do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng. Mỗi năm sản lượng đậu tương lại tăng
lên. Hiện nay Mỹ vẫn là quốc gia có sản lượng đậu tương cao nhất trên thế
giới, theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ sản lượng đậu tương của nước này
niên vụ 2010/2011 ước tính đạt 93,44 triệu tấn.
Bảng 1. Sản lượng đậu tương trên thế giới năm 2010
% so với tổng
Stt

Tên nước

Sản lượng (triệu

sản lượng toàn

tấn)

thế giới

1

Mỹ


Ấn Độ

8,8

3,5

6

Paraguay

6,5

2,6

7

Canada

3,9

1,5

8

Các nước khác

11,4

4,5



1,238

173,7

2002

158,6

1,327

205,6

2003

165,6

1,342

219,7

2004

183,8

1,338

245,9

2005


2009

146,2

1,461

213,6

Nguốn Tổng cục thống kê [18].
1.2 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu môi trường đến sự sinh trưởng
của thực vật
Thẩm thấu là quá trình vận chuyển dung môi qua một màng ngăn cách hai
dung dịch có thành phần khác nhau khi không chịu tác động của các lực ngoài
như là lực điện từ, lực pittông. Động lực của quá trình thẩm thấu là áp suất
thẩm thấu.
Áp suất thẩm thấu là sức hút của dung dịch hay lực hút nước, khả năng
hút nước ở nhiệt độ không đổi phụ thuộc vào số lượng các hạt ở mỗi đơn vị

9


thể tích dung dịch. Áp suất cần thiết để làm ngừng quá trình thẩm thấu là áp
suất thẩm thấu (gọi tắt từ tiếng Anh: OP - osmotic pressure). Dung dịch có
nồng độ càng cao thì áp suất thẩm thấu càng lớn [36].
Áp suất thẩm thấu của một dung dịch là giá trị để chỉ lượng nước có xu
hướng đi vào trong dung dịch bởi sự thẩm thấu. Do đó dưới một điều kiện
nhiệt độ và áp suất nhất định, nước sẽ di chuyển từ dung dịch có áp suất thẩm
thấu thấp sang dung dịch có áp suất thẩm thấu cao. Mỗi dung dịch đều có một
năng lượng tự do nhất định, dưới một điều kiện nhiệt độ và áp suất nhất định,

đậu tương cần rất nhiều nước, trong cả vụ nhu cầu nước của đậu tương dao
động từ 330 – 766 mm nước. Nước trong cây không chỉ ảnh hưởng đến các
phản ứng sinh hóa, các biến đổi chất trong tế bào mà còn có ảnh hưởng đến
bộ máy quang hợp do nó là nguồn nguyên liệu và là điều kiện đặc biệt quan
trọng trong quá trình sinh tổng hợp các chất hữu cơ cần thiết cho cơ thể thực
vật. Nhu cầu nước của đậu tương phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng của cây,
tốc độ phát triển của cây trước khi phủ kín đất và lượng nước có sẵn trong đất.
Khả năng năng chịu hạn của các giống đậu tương là không giống nhau do
chúng có các kiểu gen khác nhau. Khả năng này của các giống có liên quan
đến sự phát triển nhanh của bộ rễ với tính chín sớm cũng như bản chất di
truyền về khả năng sử dụng nước một cách tiết kiệm trong quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây.
Cơ chế sinh học: áp suất thẩm thấu tăng cao gây hiện tượng mất nước
được coi là môi trường hạn hán. Những giống đậu tương có khả năng chịu
hạn tốt chống lại hoạc hạn chế sự mất nước bằng những biến đổi về hình thái
hay những phản ứng hóa sinh phù hợp:
Hình thái: bộ rễ khỏe là một điều kiện tăng tính chịu hạn của cây, các rễ
phụ với bề mặt hút phát triển mạnh có khả năng giữ ẩm cho cây lâu hơn. Diện

11


tích lá của đậu tương giảm khi gặp hạn là phản ứng nhằm giảm thiểu sự thoát
hơi nước ở lá [27], [29]. Phản ứng đóng khí khổng khi gặp điều kiện hạn hán
giúp ngăn chặn sự thoát hơi nước ra ngoài, sự đóng mở khí khổng liên quan
đến rất nhiều quá trình như quang hợp, hô hấp, trao đổi ion, hấp thu dinh
dưỡng…
Phản ứng sinh hóa; các thay đổi hoá sinh thường liên quan đến cơ chế
chịu mất nước nhằm sinh tổng hợp ra các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại
lượng nước đã mất. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua sự tích

thành do sự kết hợp của nhóm amin bậc 1 với cacbon ở mạch bên. Prolin
được tổng hợp từ glutamine. Quá trình này được kích thích bởi axit Absisic và
stress [32]. Hiện nay con đường tổng hợp prolin đã được mô tả khá đầy đủ,
nhưng sự phân giải prolin mới chỉ được hiểu biết rất ít [23]. Tỷ lệ prolin trong
cây được điều khiển bởi enzyme P5CS (delta 1 – pyrrolin – 5 – cacboxylat
synthetaza) và enzyme phân giải PDH (prolin dehydrogennaza) [16].
Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu, chúng có khối lượng
phân tử nhỏ. Ngoài ra còn có nhóm hợp chất các amon bậc 4 (glyxinebetain,
prolinbetain, beta – alaninbetain và choline – oxy – sunfat) và nhóm hợp chất
3 – dimethylsunfulfonio propionate (DMSP) cũng là nhóm có khả năng tạo áp
suất thẩm thấu cao [12]. Nhóm hợp chất amin bậc 4 và DMSP đều là dẫn xuất
của các tiền chất là axit amin. Các hợp chất trên cùng có chung tính chất
không tích điện ở pH trung tính (như các ion vô cơ) và có khả năng tan tốt
trong nước, không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc
các đại phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh hưởng làm biến tính
của sự tập trung muối cao và các chất hòa tan khác có hại cho tế bào [30]. Sự
tích lũy các chất đó có ý nghĩa rất quan trọng, bởi vì chúng đóng vai trò nòng

13


cốt trong việc duy trì sức trương của tế bào và hấp thụ nước ngược gradient
nồng độ dưới tác động của stress.
Như vậy, vai trò của prolin chống chịu stress ở thực vật thể hiện: prolin
tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào và tham gia cấu trúc bảo vệ
màng và protein.
Khi nghiên cứu chức năng của prolin, biểu hiện hình thái và chống chịu
áp suất thẩm thấu, Nanjo và cộng sự đã phát hiện: những cây bị đột biến về
hình dạng (có sự bất thường về biểu bì, tế bào mô mềm và hệ mạch) có hàm
lượng P5CS thấp, rất mẫn cảm với áp lực thẩm thấu. Nhưng những sự biến

độ 250C, phần trăm Natri trao đổi kém hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 (US
Salinity Laboratory Staff 1954).
Các nghiên cứu cho thấy nhu cầu sử dụng nước của đậu tương cao, để
tổng hợp 1kg chất khô cần khoảng 500 – 530 kg nước; để hạt nảy mầm hạt
đậu tương phải có độ ẩm khoảng 50% [16]. Nhưng cây đủ nước vẫn có khả
năng bị hạn nếu áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy quá lớn.
Whitsitt và cộng sự (1997) đã nhận thấy rằng khi đậu tương bị mất nước
trên 60% thì không thể phục hồi được. Mất nước thường kèm theo sự điều
chỉnh áp suất thẩm thấu và tăng lượng mARN của gen dehydrin Mat 1. Đây là
trường hợp dehydrin đặc biệt vì nó không cảm ứng với ABA, các gen cảm
ứng với ABA được gọi là RAB (responsive to adscisic acid) hiện đang là
nhóm gen được quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều nghiên
cứu khẳng định có mối quan hệ giữa tích lũy ABA với sự tăng hàm lượng các
chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu khiu gặp hạn các chất này (thường là các
protein hoặc axit amin ) được tổng hợp bởi các gen RBA. Bên cạnh đó, một
số chất có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu không liên quan đến sự tích
lũy ABA, sự tăng hàm lượng của chúng độc lập với sự tích lũy ABA.
1.3.2.2. Ở Việt Nam

15


Trong những năm qua có nhiều nghiên cứu về tính chống chịu của thực
vật. Chẳng hạn: nghiên cứu đặc điểm di truyền và khả năng chịu hạn ở con lai
đậu tương F1 [7], nghiên cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn với thành phần
điện di protein của hạt đậu tương [9] nghiên cứu khả năng cộng sinh cố định
đạm của một số dòng vi khuẩn ở đậu tương [8], khả năng chịu mặn và di
truyền protein dự trữ của một số giống lúa trồng ven biển Đồng bằng Sông
Cửu Long[19], cơ sở di truyền tính chống chịu với thiệt hại môi trường của
một số cây lúa [2]. Kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất và

– 160g. Năng suất trung bình đạt 13 – 18 tạ/ha. Thời gian sinh trưởng 85 – 95
ngày. Giống có khả năng chịu hạn khá.
Đậu tương rau DT02: Là loại giống cây trồng thích ứng rộng, phù hợp
với mọi chân đất, trồng được 3 vụ/năm. Thời gian trồng đến khi thu hoạch từ
82-100 ngày, năng suất hạt tươi 8-10 tấn/ha hạt khô 18-28 tạ/ha. Đậu tương
DT02 có quả và hạt to gấp đôi so với đậu tương thường, là loại cây chịu nhiệt,
chống chịu sâu bệnh tốt, có thể thu hạt non (Sử dụng tươi như rau), thu hạt
khô làm giống hoặc chế biến các món đậu nành…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học
và Chuyển giao Công nghệ - Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2
Chọn các hạt mẫu to, đều, có khả năng nảy mầm cao. Cần khoảng 500
hạt mỗi loại.
Sử dụng buồng khí hậu nhân tạo, buồng vô trùng, khay đựng hạt
giống…
Tiến hành thí nghiệm gieo hạt trong dung dịch theo phương pháp của
Volcova [32].

17


Khử trùng khay đựng, bình, ống nghiệm... bằng cồn 96. Giấy lọc được
sấy ở 1300C trong một giờ, khử trùng hạt bằng dung dịch KMnO4 5% trong 5
phút. Dung dịch đường được pha bằng nước cất và đường saccarozo nguyên
chất, có bổ sung kháng sinh nistatin 1 viên cho 1 lít dung dịch.
Pha dịch đường ban đầu từ 1 atm – 13 atm, cứ cách 1 atm trồng thử
nghiệm để xác định khoảng áp suất để nghiên cứu áp suất từ 1 atm – 9 atm.
Sắp xếp mỗi giống vào 5 khay, mỗi khay chia 3 lô, mỗi lô 20 hạt, các
khay sử dụng dịch đường ở các áp suất khác nhau.

1%, dịch lọc foocmaldehit, dung dịch NaOH 0,2N.
Tiến hành: Lấy hai bình nón, cho vào mỗi bình 2g hạt đã nảy mầm
nghiền nát, và 10ml KH2PO4 0,1N. Lắc nhẹ để tạo môi trường pH thích hợp
với hoạt độ của proteaza có trong hạt đã nảy mầm. Thêm vào bình 1 (bình
đối chứng) 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzyme.
Cho vào mỗi bình 2ml dung dịch protein 5%. Đặt hai bình trong tủ ấm 370C,
thời gian 1 giờ. Sau đó thêm vào bình 2 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm
hãm hoạt động của enzyme, kết thúc quá trình thuỷ phân protein. Dùng ống
đong đo dung dịch mẫu (V), lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích
dịch lọc, chuyển sang các bình tương ứng và thí nghiệm (bình2), và bình đối
chứng (bình1). Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc 10ml foocmaldehit và 5 giọt
tymolphtalein để làm chất chỉ thị màu. Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N
đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long là được.
Tính kết quả:
X

(V2  V1 ).2,82.V . f
V3 .g

X: hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg), V1: số ml NaOH
0,2N chuẩn độ ở bình đối chứng, V2: số ml NaOH 0,2N chuẩn độ ở bình thí
nghiệm, V3: số ml dung dịch lọc đem chuẩn độ, V: số ml dung dịch mẫu, g:
khối lượng mẫu đem phân tích, f: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,2N
b) Hoạt độ enzyme lipaza [13]
Hoá chất: Đệm axetat pH=4,7, cồn 96%, toluen, dung dịch NaOH
0,1N, Thuốc chỉ thị màu tymolphtalein hoặc phenolphtalein 1%.
Tiến hành: Cân 5g hạt nghiền nhỏ thành dạng đồng thể chuyển vào
bình nón 100ml cho thêm 10ml nước cất lắc đều. Cho thêm 1ml dầu lạc làm

19