TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM
KHOA HÓA
BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ

______
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

CÔ LẬP VÀ NHẬN DANH
CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO
ETHYL ACETATE CỦA ĐỊA Y
ROCCELLA SINENSIS (NYL.) HALE
THU HÁI Ở BÌNH THUẬN
Người hướng dẫn
Sinh viên thực hiện
Mã số sinh viên

: ThS. Hồ Xuân Đậu
: Trần Minh Dũng
: 35106006

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013


LỜI CẢM ƠN
---------Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền
với những sự hổ trợ,giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay
gián tiếp của người khác.
Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi
lời cảm ơn đến:
 Thầy Hồ Xuân Đậu, người mà đã truyền đạt cho em

Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp
chất tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung
thư, kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4] , …
Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm. Nhờ dạng
sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây,... trong những điều
kiện khác nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm
thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa
dạng. Để góp phần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn
loại địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale thuộc chi Rocellaceae thu hái ở tỉnh Bình
Thuận, Việt Nam để nghiên cứu.


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
MỤC LỤC .......................................................................................................................2
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................3
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỀU ................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................5
1.1. KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y ..........................................................................................5
1.1.1. Định nghĩa và phân loại địa y ............................................................................5
1.1.2. Vai trò của các hợp chất tự nhiên trong địa y [9]................................................5
1.1.3. Một số ứng dụng của địa y ................................................................................6
1.2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y ..................................................6
1.2.1. Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[5].................................................6
1.2.2. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[5] ................................7
1.2.3. Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[5] ...............7
1.2.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5] .......................8
1.2.5. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[5] ...................................8
1.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VỀ CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG ĐỊA Y ................9
1.4. MÔ TẢ THỰC VẬT ROCCELLA SINESIS (NYL.) HALE..................................10


Mũi đôi (Doublet)

t

Mũi ba (Triplet)

m

Mũi đa (Multiplet)

brs

Mũi đơn rộng

m/z

Mass to charge ratio Transfer

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coherence


ED

Ether dầu

EA

Ethyl acetate

C

Chloroform

Me

Methanol

Ac

Acid Acetic

C-NMR


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỀU
Hình ảnh
Hình 1 Ba dạng chính của địa y...................................................................................5
Hình 2 Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y ..........................................................9
Hình 3 Địa y Roccella sinensis ...................................................................................10
Hình 4 Tương quan trong hợp chất RS-A3 ................................................................20


Hình 1: Ba dạng chính của địa y
1.1.2. Vai trò của các hợp chất tự nhiên trong địa y [9]
− Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao.
− Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại.
− Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được
các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate).
− Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng.


1.1.3. Một số ứng dụng của địa y
Địa y đã được sử dụng làm thực phẩm, làm phẩm nhuộm, nguyên liệu thô trong
sản xuất nước hoa và trong y học cổ truyền.
1.2. HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y
Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh
học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự
nhiên. Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì
các địa y phát triển rất chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y
trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy
thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất
có trong cùng loại địa y tự nhiên

[5]

. Lê Hoàng Duy

[6]

đã nghiên cứu nuôi cấy thành



1.2.2. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao[5]
Địa y hoặc các hợp chất của địa y

Hoạt tính

Barbatic acid, 4-Odemethylbarbatic acid, diffractaic
acid, evernic acid, lecanoric acid, βorcinolcarboxylic acid, orsellinic
acid

Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

Ergochrome AA (secalonic acid A)

Gây độc cho thực vật

Evernic acid

Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau
bina

Lecanoric acid

Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây
Allium cepa

Các hợp chất phenol đơn vòng

Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật


Naphthazarin

Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa

Scabrosin ester và dẫn xuất,
Euplectin

Gây độc chống lại tế bào murine P815
mastocytoma và các dòng tế bào khác

Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic
acid

Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan
chuột

Psoromic acid, Chrysophanol,
Emodin và dẫn xuất

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu


1.2.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5]
Hợp chất

Vi khuẩn

Usnic acid và các dẫn xuất

Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,


Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase

Baeomycesis acid

5-Lipoxygenase

Bis-(2,4-dihydroxy-6-npropylphenyl)methane, Divarinol,
cao chiết từ Cetraria juniperina,
Hypogymnia physodes và Letharia
vulpina

Tyrosinase

Chrysophanol

Glutathione reductase

Confluentic acid, 2β-OMethylperlatolic acid

Monoaminoxidase B

4-O-Methylcryptochlorophaeic acid

Prostataglandinsynthetase

(+)-Protolichesterinic acid

5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV)


mảnh, có màu xanh xám.

Hình 3: Địa y Roccella sinensis
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC TRONG CHI ROCCELLA
1.5.1. Các acid béo
Năm 1967, Huneck S. và các cộng sự đã cô lập được roccellaric acid (1) từ
Roccella mollis[12].
Năm 1994, Huneck đã cô lập được roccellic acid (2) từ Roccella phycopis[13].
1.5.2. Các hợp chất aliphatic vòng
Năm 1970, Ferguson G., Mackey I. R. tìm ra acetylportentol (3) từ Roccella
fuciformis[14]; cũng trong năm đó Aberhart D. J.,Overton K. H., Huneck S., đã phân
lập được prortentol (4) từ Roccella galapagones[15].
1.5.3. Các carbohydrat
Năm 1969, C. F. Culberson đã cô lập được hợp chất meso-erythitol (5) từ
Roccella phycopis[16] và D-tagatose (6) từ Roccella fuciformis[16].
Năm 1945, Anker R. M., Cook A. H. đã cô lập được ethyl orsellinate (7) từ
Roccella fuciformis[17]. Sau đó hợp chất này cũng được tìm ra bởi Dyke H. J., Elix J.
A., Marcuccio S. M.,Whitton A. A. (1987); Gavin J., Tabacchi R. (1975); Hase T. A.,
Suokas E,, McCoy K. (1978).


Năm 1969, C.F Culberson và các cộng sự đã cô lập được (+)-montagnetol (8) từ
Roccella montagnei[16].
1.5.4. Các hợp chất carotenoid
Năm 1988, Czeczuga đã cô lập được các β-carotene (9) từ Roccella fuciformis[18]
và γ-carotene (10) từ Roccella montagnei Bell[18].
1.5.5. Các hợp chất Chromane và Chromone
Năm 1969, Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S. đã cô lập lepraric acid (11)
từ Roccella fuciformis[19].
Năm 1972, Hucneck S., Follmann G. đã tìm được lobodirin (12) từ Roccella


Roccellaric acid (1)
O

O
CH3

H 3C

CH
O 3
CH 3

O

O
H 3C C

O

H 3C
CH3

O

Portentol (4)

Acetylportentol (3)

OH

OH HO

OH
H
CH 2OH

(+)- Montagnetol (8)
Me

Me
Me

Me

Me

Me

Me

β-Carotene (9)

Me
Me
Me
Me
γ- Carotene (10)

Me


O

OH

OH

OH
H

COOC2H 5

Me

H
OH

CH2OH

Me

Me

O

H

H

CH3


OAc

Lobodirin (12)

Me


OH

O
OH

OH

HOH 2C

O
H3CO

O

O

Me

HO HO

Me

OAc


Me

O

Me

O

O

O

O

Me

OAc

Galapagin (16)

Roccellin (15)
Me

Me

OH

COO


O

HO

N
HN

NH

or
O

OMe

Me
Picrorocellin (20)

N
O

OMe
O

Me

OMe

COOMe
O


2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm ether
dầu hỏa (60-90oC), ether dầu hỏa thắp sáng (40-60oC), ethyl acetate, acid acetic,
chloroform, acetone, methanol điều là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được
làm khan bằng Na 2 SO 4 nếu sử dụng lại và nước cất.
Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung
dịch acid sulfuric 30%, vanillin/H 2 SO 4 , soi UV.
Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ.
2.1.2. Thiết bị
− Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng).
− Máy cô quay chân không kèm bếp cách thủy .
− Cột sắc ký: cột cổ điển.
− Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F 254 Merck.
− Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR,

13

C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90: Ghi

trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và
125 MHz cho phổ 13C-NMR.
Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa học Tự
nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí
Minh.
2.2. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU
Tên khoa học: Roccella sinensis (Nyl.) Hale.
Họ: Rocellaceae.
Địa y mọc trên thân cây chín tầng ở chùa Hang, ở độ cao 300 mét so với mực
nước biển, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận.

sắc kí lớp mỏng với hỗn hợp dung môi C:Me:AcOH ( 9:1:0,12 ),xuất hiện hai vết xanh
tím và đỏ.Tiến hành sắc kí lớp mỏng điều chế với hỗn hợp dung môi C:Me:AcOH
( 9:1:0,12 ), tách được hai chất RS-A3 và RS-A4.
Tất cả cấu trúc của hợp chất được xác định bằng phổ MS, NMR và so sánh với
các dữ liệu đã được công bố.

Sơ đồ 2: Quy trình sắc kí cột trên cao etyl acetat EA3


CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Cao EA3 (30g) thực hiện sắc kí cột phân thành 4 phân đoạn kí hiệu từ EA3.1 đến
EA3.4. Chọn khảo sát trên phân đoạn EA3.1 (21 g), thực hiện sắc kí cột thu được hợp
chất C 0 A.Tiếp tục chọn khảo sát trên phân đoạn EA3.2 (3.55g), thực hiện sắc kí cột
và sắc lớp mỏng điều chế thu được hai hợp chất RS-A3 và RS-A4. Cấu trúc hóa học
của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như phổ
NMR, HSQC,….
3.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất C0A
8

CH3 O
5 1
3

HO

7 O

CH 3
8'



7' OH

OH

OH

Hợp chấy RS-A4 được cô lập từ phân đoạn EA3.2 (0.55g)
Trạng thái:chất rắn màu trắng
Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, acetone-d 6 ) phụ lục 6, trình bày trong bảng 1


 Biện luận cấu trúc phổ RS-A4
Phổ

1

H-NMR cho thấy có 2 tín hiệu của 2 nhóm metyl gắn vòng thơm

[δ H 2.58 (3H, s), δ H 2.62 (3H, s)], 4 proton vòng thơm [δ H 6.29 (1H, d) J=2.5Hz,
δ H 6.38 (1H,br), δ H 6.74 (1H, br), δ H 6.77 (1H, d) J=2.5Hz], 1 tín hiệu của nhóm
hydroxy kiềm nối [δ H 11.11 (1H,s)].Giá trị cùa 2 proton ở [δ H 6.74 (1H, s), δ H 6.77
(1H, s)] dịch về vùng trường thấp chứng tỏ nó thuộc nhân thơm B. Ta khẳng định
được RS-A4 là 2 đơn vị orcinol.
Từ dữ liệu phổ và tài liệu tham khảo[29], ta xác định RS-A4 là lecanoric acid.
Hợp chất RS-A4

Hợp chất C 0 A

δ H, J(Hz)

6
7

9.10 (s)

4-OH
1’
2’
3’

6.77 (d, J=2.5Hz)

4’
5’

6.74 (br)

6’
7’
8’

2.62 (s)

Bảng 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RS-A4 và C 0 A


3.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất RS-A3
8'

CH 3

Phổ HMBC trình bày ở phụ lục 5
 Biện luận cấu trúc phổ RS-A3
Phổ 1H-NMR cho thấy có 2 nhóm metyl gắn vòng thơm [δ H 2.59 (3H,s), δ H 2.29
(3H,s)], 5 proton vòng thơm [δ H 6.63 (1H,br), δ H 6.57 (2H,br), δ H 6.37 (1H,m),
J=2.5Hz, δ H 6.29 (1H,d), J=2.5Hz], 1 tín hiệu của nhóm hydroxyl kiềm nối [δ H 11.30
(1H,s)].
Phổ 13C-NMR khẳng định hợp chất RS-A3 có 15 carbon: 2 nhóm metyl gắn ở vòng
thơm (δ 24.4, δ 21.4),1 nhóm carboxyl (δ 174.4), 12 carbon vòng thơm (δ 101.9,
δ 107.4, δ 112.9, δ 114.8, δ 114.5, δ 117.8, δ 141.3, δ 144.7, δ 152.0, δ154.5, δ 159.1,
δ 164.2)
Dựa vào phổ HSQC cho thấy proton H-8 (ở δ H 2.29) tương quan một nối với carbon
δ 21.4, proton H-8’ (ở δ H 2.59 ) tương quan một nối với carbon δ 24.4. Nhân thơm A,
các proton ở δ H 6.29 tương quan một nối với carbon δ 101.9 và proton ở δ H 6.37 tương
quan một nối với carbon δ 112.9. Nhân thơm B, các proton ở δ H 6.57 tương quan một
nối với carbon δ 114.6 và proton ở δ H 6.63 tương ứng với carbon δ 117.8.
Trên nhân thơm A, phổ HMBC cho thấy proton của nhóm metyl (δ H 2.59) cho tương
quan với các carbon C-6 (δ 144.7), C-1 (δ 107.4) và C-5 (δ 112.9). Proton của nhóm
hydroxy (δ H 11.30) cho tương quan với các carbon C-2 (δ 164.2) và C-3 (δ 101.9). Phổ
HSQC giúp ta khẳng định proton ở δ H 6.29 gắn vào C-3 (δ 101.9) và proton ở δ H 6.37
gắn vào C-4 (δ 112.9).Từ đó,ta khẳng định được cấu trúc của nhân thơm A.


Trên nhân thơm B, phổ HMBC cho thấy proton của nhóm metyl (δ H 2.29) ở vị trí
C-6’cho tương quan với các carbon C-6’(δ 141.1), C-5’ và C-1’ trùng nhau ở (δ 114.8,
δ 114.5). Phổ HSQC giúp ta khẳng định proton ở δ H 6.63 ở vị trí C-5’(δ 114.8) và
proton ở δ H 6.57 ở vị trí C-1’(δ 114.5). Từ đó, ta khẳng định được cấu trúc gần đối
xứng của nhân thơm B.
Hợp chất RS-A3 (Aceton)
Vị trí
δ H , J (Hz)


11.30 (s)

1’

6.57 (br)

24.4
114.7
154.5

6.63 (br)

107.4

4’
5’

152.0
6.57 (br)

114.5

6’
8’

1, 5, 6
1, 2, 3

2’


HO

5 1
3

O

5' '
1
3'

OH

OH

Hình 4 Tương quan trong hợp chất RS-A3


CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN
Từ mẫu địa y Roccella sinensis (Nyl.) Hale, họ Rocellaceae, thu hái trên thân cây
chín tầng ở chùa Hang, huyện Liên Hương, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam. Sau khi làm
sạch, phơi khô, xay nhuyễn thu được 1.7 kg mẫu. Tiến hành điều chế cao metanol thô
(400 g). Tiến hành sắc kí cột silica gel trên cao metanol thô, giải ly lần lượt bằng các
đơn vị dung môi với độ phân cực tăng dần: hexan, etyl acetate và metanol thu được
các loại cao như: cao H, cao EA và cao Me.
Tiến hành sắc kí cột trên cao EA thu được 4 phân đoạn ký hiệu từ EA1 đến EA4.
Chọn khảo sát trên phân đoạn EA3 (30 g) thu được 3 hợp chất ký hiệu là C 0 A, RS-A3
và RS-A4.
Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại và so sánh với tài liệu tham khảo,

CH3 O

5 1
3

7 O
OH

Lecanorin

5' 1'
3'

8 CH 3 O

OH

5 1
3

HO

7 O

OH

5' 1'
3'

7' OH

776-784 (2008).
[4]

Muhammad I. Choudhary, Azizuddin Saima Jalil, Atta-ur-Rahman, “Bioactive

phenolic compounds from a medicinal lichen, Usnea longissima”, Phytochemistry, 66,
2346-2350 (2005)
[5]

Yit Heng Choi, Generic potential of lichen-forming fungi in polyketide

biosynthesis, A thesis for Doctor of Philosophy, RMIT University, 10-15, 2008.
[6]

Le Hoang Duy, Chemical study of common lichens in the south of Vienam, A

thesis for Doctor of Philosophy, Kobe Pharmaceutical University, 2-8, 2012.
[7]

E. J. W. Barrington, Arthur J.Willis, The biology of lichens: Contemporary

biology, 2nd edition, Edward Arnold, London, 1974.
[8]

Siegfried Huneck, Isao Yoshimura, Identification of lichen substances,

Springer, Berlin, 155-311, 1997.
[9]

Culberson C., Improved conditions and new data from the identification of

[16]

Anker R. M., Cook A. H., A new synthesis of olivetol. J Chem Soc:311-

313,1945.
[17]

Alberhart D. J., Overton K. H., Huneck S., Studies on lichen sunstance. Part

LXII. Aromatic constituents of the lichen Roccella fuciformis DC. A recised structure
for lepraric acid. J Chem Soc:704-707, 1969.
[18]

Hucneck S., Follmann G. Mitteilungen ober Flechterninhaltssoffe. LXXIV. Zur

Phytochemie und Chemotaxonomie der Lecanoraceengattung Haematomma. J Hattorl
Bot Lab 35:319-324,1972.
[19]

Hucneck S.,

6-hydroxymethyleugenitin, ein neues Chromon aus Roccella

fuciformis. Phytochemistry 11:489-1490, 1972a.
[20]

Devlin J. P., Falshaw C. P., Olllis WD,Wheeler R Phytomechical examination of

the lichen, Lecanora rupicola(L). zahlbr. J Chem 29:1069-1077, 1971.
[21]

Tetrahedron Lett: 1445-1448, 1983.
[27]

Bohman-Lindgren G., Chemical studies of lichens .XXXIII , Roccanin, a new

cyclic tetrapeptit from Roccella canarlensist .Tetrahedron 28:4625-4630,1972.
[28] Huneck S., Jackupovic J., Follmann G., 9-methylpannarate from the lichen
Roccella capesis. Z Nature forsch 46b:969-970,1991b.