GVHD: TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN
HVTH: NGUYỄN THỤY HAI: 12310729
THI PHỐI PHỐI : 12310746
VŨ NGỌC LINH : 12310737


• Cây đậu phộng
Chi : Arachis
Loài : Arachis hypogaea L.
Tên tiếng Anh: peanut, groundnut.
• Vỏ đậu phộng chứa flavonoid.
• Hạt đang nảy mầm hay thân cây dưới tác động của vi sinh vật
đều sinh tổng hợp stilbene (đồng phần cis-, trans-).
• rễ cây đậu phộng chứa resveratrol với hàm lượng cao (Chen và
cs, 2001).


Stilbene
- Stilbene là phytoalexin
- Stilbene là một nhóm nhỏ của hợp
chất nhóm phenylpropanoid được
đặc trưng bởi khung 1,2diphenylethylene.
- Stilbene có khung cấu trúc cơ bản
gồm 2 vòng thơm, nối với nhau bởi
cầu nối ethylene (C6-C2-C6) thuộc
nhóm hợp chất polyphenol
- có dạng monomer, oligomer và
polimer .


Resveratrol

giấy bạc và đưa vào tủ cấy vô trùng.
• Thao tác trong tủ cấy vô trùng: lắc với cồn
70o /30s- 1ph -> dung dịch sodium
hypochlorite (NaOCl) 1,5% - ngâm và lắc hạt
/7ph -> rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần > cấy lên môi trường MS có bổ sung
saccharose (30 g/l) và agar (7,5 g/l) -> chiếu
sáng 16h/5 ngày ->hạt nãy mầm (cường độ
ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28oC).


• Cảm ứng tạo rễ tơ, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
tạo rễ tơ như:
- Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
- Thời gian đồng nuôi cấy
- Thời gian ngâm mẫu


Loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
Mẫu
(trụ thượng diệp, tử diệp,
trụ hạ diệp, lá, cuống lá)

Agrobacterium
rhizogenes

đồng nuôi cấy trong tối, 72h
Mẫu đối chứng
không gây
nhiễm vi khuẩn



+ Arachis hypogaea L. khá nhạy cảm với
Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834
+ Sự cảm ứng tạo rễ tơ từ mẫu lá cao hơn so với từ
mẫu trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, cuống lá, tử
diệp; từ đó có thể kết luận quá trình biến nạp của
vi khuẩn vào tế bào cây đậu phộng ở lá dễ dàng
hơn hơn so với các mẫu còn lại.

 mẫu lá và mẫu trụ hạ diệp được chọn làm
nguồn vật liệu đầu để xâm nhiễm, cảm ứng tạo rễ
tơ cho các thí nghiệm tiếp theo


Thời gian đồng nuôi cấy
Mẫu (trụ hạ diệp, lá)
15p

Agrobacterium
rhizogenes

Đồng nuôi cấy MT MS rắn
(24, 48, 72, 96, 120h)
loại VK bằng MT MS lỏng có cefotaxime
nuôi cấy trên MT MS rắn
(bổ sung cefotaxime 250 mg/ml)

 kiểm tra số mẫu tạo rễ tơ sau 3 tuần nuôi cấy




- 5p
- 10p
- 15p
- 20p
- 25p
- 30p

Đồng nuôi cấy MT MS rắn, 96h
(bổ sung saccharose 30 mg/l, agar 7,5 mg/l,
không chất điều hòa tăng trưởng)
96h

nuôi cấy trên MT MS rắn như trên
(bổ sung cefotaxime 250 mg/l)
 kiểm tra số mẫu tạo rễ tơ sau 3 tuần nuôi cấy

Loại
VK


Sự hình thành rễ tơ
có thể được chia
thành 4 bước:
 hoạt hóa
 biến đổi
 chuyển T-DNA từ
vi khuẩn vào tế bào
thực vật
 cảm ứng sự hình

• cặp mồi rolBF và
rolBR khuếch đại
gen rolB (423 bp)

Kết luận:
gen rolB và gen
rolC từ Ri
plasmid của A.
rhizogenes ATCC
15834 đã sáp
nhập vào bộ gen
của rễ tơ Arachis
hypogaea L..


Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR của cặp mồi rolBF và rolBR (A);
cặp mồi rolCF và rolCR (B).
Giếng 1, 1’: Thang 100 bp
Giếng 2, 2’: Sản phẩm PCR của plasmid Ri 15834
Giếng 3,3’: Sản phẩm PCR của DNA bộ gen của rễ in vitro
Giếng 4, 5, 6, 7, 8: Sản phẩm PCR của DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ lá, trụ
hạ diệp, trụ thượng diệp, tử diệp và cuống lá với cặp mồi rolBF và rolBR.
Giếng 4’, 5’, 6’, 7’, 8’: Sản phẩm PCR của DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ lá,
trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, tử diệp và cuống lá với cặp mồi rolCF và rolCR.
Giếng 9, 9’: Sản phẩm PCR của mẫu nước


Xây dựng đường cong tăng trưởng của
rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc
Rễ tơ được cảm



- rễ tơ phát triển chậm trong 6 ngày đầu

- pha tăng trưởng từ ngày nuôi cấy lỏng lắc thứ 7 đến 21
- phát triển ổn định từ ngày thứ 22 đến 30
(Trong pha tăng trưởng, rễ tơ tăng sinh khối nhanh và đáng
kể từ ngày thứ 9 đến ngày 15)
 Dựa vào kết quả này có thể chọn thời gian nuôi cấy từ
ngày 9 đến ngày 21 để bổ sung các tác nhân cảm ứng vào
môi trường nuôi cấy rễ tơ, thu nhận sinh khối để tách chiết
hợp chất stilbene khi rễ tơ 21 – 30 ngày tuổi.