ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH

THU NHẬN HP CHẤT TỰ NHIÊN BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY RỄ TƠ

GVHD: TS. Lê Thò Thủy Tiên
SVTH: Trần Tú Bửu
MSSV: 60700186

Tp HCM, Tháng 6/2011


LỜI CẢM ƠN
Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa
Tp. HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em, giúp em có được những kiến thức cần
thiết hỗ trợ cho việc thực hiện đồ án.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Thủy Tiên đã rất nhiệt tình hướng dẫn
và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án của mình.

i


MỤC LỤC
Đề mục
Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i

2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTN ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ ...... 32
2.4.1. Sự lựa chọn dòng ...................................................................................... 33
2.4.2. Hình thái của rễ tơ sau khi đã chuyển gene ................................................ 33
2.4.3. Mối quan hệ giữa sự tổng hợp HCTN với các giai đoạn phát triển của rễ tơ
(phase) trong quá trình nuôi cấy .............................................................................. 35
2.4.4. Thành phần của môi trường....................................................................... 35
2.4.5. Hàm lượng khí .......................................................................................... 36
2.4.6. Chất cảm ứng ............................................................................................ 37
2.4.7. Ánh sáng ................................................................................................... 38
2.4.8. Các yếu tố khác ......................................................................................... 39
2.5. Lưu trữ và bảo quản rễ tơ ........................................................................................ 40
Chương 3. Một số kết quả nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy rễ tơ để thu nhận
HCTN ........................................................................................................................... 42
3.1. Thu nhận resveratrol bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của cây đậu phộng ............. 42
3.1. Thu nhận plumbagin bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ Plumbago indica ................ 43
3.2. Thu nhận ginsenoside bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của Panax ginseng ........... 45
3.3. Thu nhận betalain bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của Beta vulgaris ................... 48
Chương 4. KẾT LUẬN............................................................................................ 51
Tài liệu tham khảo ..................................................................................................... 53

iii


Danh mục bảng
Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman và Hall, 1998) .............................................. 3
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của các chủng A. rhizogenes khác nhau lên sự cảm ứng rễ tơ từ mẫu
lá của A. hypogaea. ......................................................................................................... 33
Bảng 2.2: Sự tăng hàm lượng HCTN ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ bằng cách sử dụng các
chất cảm ứng khác nhau. ................................................................................................. 38


Hình 3.8: Giá trị ORAC của chất chiết từ rễ bình thường và hệ thống nuôi cấy rễ tơ B.
vulgaris cv. Detroit Dark Red. ........................................................................................ 49
Hình 3.9: Các bioreactor sử dụng để nuôi rễ tơ Beta vulgaris cv. Detroit Dark Red. ....... 50

Danh mục ảnh
Hình 1.4: Lông rễ được cảm ứng bởi A. rhizogenes và mô sẹo được cảm ứng bởi A.
tumefaciens. ...................................................................................................................... 9
Hình 1.9: Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar ......................................... 14
Hình 1.10: Rễ tơ Harpagophytum procumbens trong bioreactor ..................................... 14
Hình 1.11: Rễ tơ G. glabra nuôi trong môi trường lỏng .................................................. 14
Hình 1.12: Rễ tơ của cây đậu phộng ............................................................................... 14
Hình 2.10: Rễ tơ phát triển trong thiết bị dạng phun sương ............................................. 32
Hình 2.11: Rễ tơ Panax ginseng được nuôi trên môi trường SH sau 4 tuần, biểu hiện ra ba
kiểu hình thái khác nhau.. ............................................................................................... 34
Hình 2.13: Hình thái của rễ tơ M. lanceolata trước và sau khi lưu trữ.. ........................... 41
Hình 3.2: Rễ tơ Arachis hypogaea L nuôi cấy trong erlen để sản xuất resveratrol. .......... 43
Hình 3.4: Sự sản xuất ginsenoside từ rễ tơ của nhân sâm trong các bioreactor (5 ÷ 20 l) ở
quy mô phòng thí nghiệm ............................................................................................... 47
Hình 3.5: Hệ thống bioreactor (10,000 l) sử dụng nuôi cấy rễ tơ P. ginseng .................... 47

v


LỜI MỞ ĐẦU
Các nghiên cứu về hợp chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật đã và đang phát triển rất
mạnh từ 50 năm trở lại đây. Ngoài việc đóng vai trò lớn trong hệ thống tự vệ của thực vật,
các hợp chất biến dưỡng thứ cấp còn mang lại rất nhiều lợi ích cho con người. Rất nhiều
các sản phẩm phục vụ trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm có nguồn
gốc từ các hợp chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật. Việc tổng hợp các hợp chất này đã
được nghiên cứu rất nhiều trên các hệ thống nuôi cấy in vitro như các hệ thống nuôi cấy

tục trong suốt quá trình tồn tại của thực vật. Còn ở quá trình biến dưỡng thứ cấp thì thực
vật chỉ tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp để bảo vệ thực vật khỏi các yếu tố tác động bên
ngoài (stress, tia UV, sự tấn công của vi sinh vật, …) , chúng không có vai trò trong sự
tăng trưởng và phát triển của thực vật. Các hợp chất thứ cấp không được tổng hợp thường
xuyên mà chỉ được tạo ra khi có các tín hiệu về sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh đến
thực vật.
Thực vật sản xuất ra một số lượng phong phú các HCTN. Cơ sở dữ liệu của
NAPRALERT vào năm 1988 đã thống kê được khoảng 88.000 hợp chất, hầu hết chúng
có nguồn gốc từ thực vật. Mỗi năm có khoảng 4000 hợp chất mới được phát hiện ra. Năm
1998, từ điển về các sản phẩm tự nhiên (Dictionary of Natural Products) theo Chapman
và Hall đã đưa ra bảng số liệu chứa khoảng 85.000 danh mục về hợp chất thứ cấp. Số liệu
này được trình bày trong bảng 1 [26].

2


Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman và Hall, 1998)
Tổng số lượng danh mục

85,058

Trong đó bao gồm:
aliphatics

5200

polyketides

2442



27,463

3921
15,765

hemimonosesquiditri-

56
1946
8650
7834
5582

tetrapolysteroids

352
51
4600

indole
isoquinoline
steroidal

3693
3498
873

Phân loại


Steroid và triterpene: 30C



Tetraterpene (carotenoid): 40C



Polyterpeneoid: [C5].n với n >8

Hợp chất tiêu biểu của nhóm terpene được quan tâm đến nhiều là saponin.
1.1.2.2.

Nhóm hợp chất phenol:

Là hợp chất có chứa nhân phenol, các hợp chất này thường được tổng hợp từ các đơn
vị cấu trúc cơ bản là phenolalanine hoặc tyrosine (9C).
Các hợp chất tiêu biểu thuộc nhóm này là lignin, tanin, flavonoid,…
1.1.2.3.

Hợp chất chứa nitơ:

Là các hợp chất có chứa N trong cấu trúc, hầu hết chúng được tổng hợp từ các acid
amin, gồm 2 nhóm được quan tâm đến nhiều nhất là alkaloid (Vinca alkaloid, Taxol, …)
và cyanogenic glycoside.
1.1.3.

Con đường sinh tổng hợp các HCTN

Trong quá trình trao đổi chất của thực vật, các HCTN được tổng hợp theo 4 con đường


Aliphatic
amino acid

Shikimic acid
Con đường
Mevalonic acid

Amino acid
chứa vòng

Terpenes
(vd: gossypol)
Các hợp chất thứ
cấp chứa nitơ
(vd: alkaloid,…)
Các hợp chất thứ
cấp chứa phenol
(Vd: lignin, flavonoid, tannin,…)

Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp HCTN ở thực vật.
Con đường acid shikimic: là con đường tổng hợp ra các amino acid là tyrosine,
phenylalanine, tryptophan làm tiền chất cho việc tổng hợp nên các hợp chất có chứa nhân
phenol và 1 số hợp chất alkaloid có chứa nhân thơm.
5


Hình 1.2: Con đường acid shikimic
Con đường acid malonic: đi từ tiền chất là Acetyl-CoA và tổng hợp ra các hợp chất
thuộc nhóm hợp chất phenol.

 Ngăn cản sự tăng trưởng của các thực vật cạnh tranh: ức chế sự nảy mầm của hột,
ngăn cản sự tăng trưởng chồi và rễ của các thực vật cạnh tranh (phenylpropanoid, dẫn
xuất từ acid benzoic): hiện tượng cảm nhiễm.


Giúp chống chịu về mặt cơ học: lignin, …



Hấp dẫn các tác nhân thụ phấn cho hoa, phát tán trái và hạt: các hợp chất tạo màu

và hương thơm như flavonoid, anthocyanin, …
Đối với con người, các HCTN có vai trò trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp,
thực phẩm, mỹ phẩm, …
 Trong y học, các HCTN có sự đóng góp rất lớn và vẫn đang được nhiều nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu để phát triển mạnh các hợp chất có chức năng chữa bệnh như
các hợp chất có khả năng chống bệnh ung (Taxol từ cây thông đỏ, Vinca alkaloid,…), các
hợp chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh (glucosinolate có khả năng ức chế các vi khuẩn
gây loét dạ dày).
 Trong nông nghiệp thì các HCTN được ứng dụng như các “ thuốc trừ sâu, thuốc
diệt cỏ tự nhiên” không gây ô nhiễm môi trường.
 Trong thực phẩm và mỹ phẩm, HCTN được ứng dụng chủ yếu là các chất tạo màu,
tạo mùi thơm. Chúng có đặc điểm là không gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe như các chất
phụ gia hóa học, tuy nhiên chúng có nhược điểm là không bền và khó bảo quản hơn so
với các chất hóa học.
HCTN có ý nghĩa rất lớn đối với con người, việc sản xuất các HCTN cần được phát
triển với quy mô công nghiệp để tăng sản lượng cũng như giảm giá thành sản phẩm. Do
đó việc nghiên cứu và phát triển các hệ thống nuôi cấy in vitro cho năng suất tổng hợp các
HCTN cao nhất là một vấn đề rất cấp thiết.
1.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Khi các vi khuẩn A.rhizogenes nhiễm vào vết thương của thực vật thì chúng sẽ chuyển
gene của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó. Các gene được chuyển từ
A.rhizogenes vào trong bộ gene của tế bào thực vật được gọi tên là T-DNA (transfer
9


DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ được gắn ổn định vào bộ gene của thực vật. Tuy
các gene mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều
tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện được trong tế bào thực vật. Đoạn gene T-DNA này
nằm trong 1 plasmid lớn (khoảng 200 kbp) của A.rhizogenes và plasmid này được đặt tên
là Ri- plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ bất
định [26]. Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine and mannopine, vi khuẩn
A. rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ yếu cho quá trình
chuyển gene vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ. Ri-plasmid được chia thành nhiều
vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir), vùng chuyển gene (T-DNA), vùng ori, vùng
phiên mã,..Chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được chuyển vào bộ gene của thực vật
và việc chuyển gene này thông qua sự hỗ trợ bởi các đoạn gene trong vùng vir của Riplasmid. Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri-plasmid và mã hóa sáu locus phiên mã
(vir A, B, C, D, E, G), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gene. Sự phiên mã
của vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenol, điển hình là
acetosyringone. Acetosyringone và các hợp chất liên quan được xác định là có vai trò làm
tăng tần số của quá trình chuyển gene thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật.
Nhiều loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để cảm
ứng sự biểu hiện của gene vir ở mức độ cao.
T-DNA của Ri-plasmid được quy thành hai phần là phải (TR-DNA) và trái (TL-DNA).
Phần TR-DNA mang gene aux và gene ags. Gene ags mã hóa các enzyme cần cho quá
trình tổng hợp ra các hợp chất opine (dẫn xuất của các amino acid và nhóm đường). Gene
aux (aux1 và aux2) mã hóa ra các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ra chất
điều hòa sinh trưởng thực vật là IAA (indole-3-acetic acid). Trong đó, gene aux1 tạo ra
enzyme là tryptophan monooxygenase để chuyển hóa tryptophan thành indole-3acetamide (IAM), sau đó IAM sẽ được chuyển thành IAA nhờ vào hoạt động xúc tác của
enzyme indoleacetamide hydrolase, sản phẩm của gene aux2. Phần TL-DNA mang gene

các HCTN là khá phức tạp và dược tính của các chất tổng hợp hóa học đã được xem xét là
kém hiệu quả hơn so với các HCTN tương ứng. Từ những hạn chế của các phương pháp
trên mà các nhà khoa học và các nhà công nghệ sinh học đã không ngừng nghiên cứu và
phát triển các hệ thống nuôi cấy in vitro như là một phương pháp thay thế để sản xuất
HCTN. Các hệ thống nuôi cấy in vitro được ứng dụng trong sản xuất HCTN bao gồm hệ
thống nuôi cấy tế bào, nuôi cấy mô và cơ quan thực vật.
Hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật được sử dụng phổ biến để sản xuất ra các HCTN.
Các bằng chứng về việc dịch treo tế bào có thể sản xuất được HCTN được biết đến rất
muộn trong kĩ thuật nuôi cấy in vitro. Bởi lẽ có một khoảng thời gian dài trước đây các
nhà khoa học đã cho rằng các tế bào không phân hóa như mô sẹo và dịch treo tế bào sẽ
không có khả năng tổng hợp được HCTN như các tế bào đã phân hóa và các mô chuyên
biệt. Zenk và các cộng sự sau đó đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng các luận điểm
trên là sai với việc tổng hợp được 2.5 g anthraquinone trên một lít môi trường nuôi cấy tế
bào không phân hóa Morinda citrifolia [5]. Từ đó mở một cánh cửa rộng lớn cho các nhà
khoa học phát triển việc sử dụng hệ thống tế bào thực vật in vitro để sản xuất ra các
HCTN được quan tâm nhiều trong công nghiệp (đặc biệt là các HCTN sử dụng trong
ngành dược và ngành sản xuất thuốc nhuộm).
Bên cạnh các hệ thống nuôi cấy tế bào không phân hóa thì hệ thống nuôi cấy mô và cơ
quan cũng được quan tâm rất nhiều trong sản xuất HCTN. Do có nhiều HCTN không thể
tổng hợp được từ các tế bào không phân hóa đồng thời các mô và cơ quan phân hóa có
khả năng tổng hợp được HCTN ổn định hơn hệ thống tế bào không phân hóa nên đây là
một hướng có tiềm năng lớn trong việc nâng cao hàm lượng HCTN. Trong đó, hai hệ
thống được quan tâm nhiều nhất là hệ thống nuôi cấy rễ tơ và hệ thống nuôi cấy chồi bất
định [5]. Hai hệ thống này được mở rộng nghiên cứu dựa trên sự phát triển của các kĩ
thuật gene với sự hiểu biết khá tường tận về bộ gene của vi khuẩn Agrobacterium.
Kĩ thuật nuôi cấy tế bào và nuôi cấy mô, cơ quan để thu nhận HCTN có thể được tóm
tắt theo 2 sơ đồ như sau [5]:

12



14


Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh và ổn
định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật
(CĐHSTTV). Bên cạnh đó, khả năng tổng hợp ra các HCTN của hệ thống rễ tơ cũng cao
hơn rất nhiều so với thực vật nguyên vẹn cũng như là so với hệ thống dịch treo tế bào ở
nhiều loài thực vật. Với sự chuyển gene của A. rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng
tổng hợp ra nhiều loại HCTN với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ
bất định không chuyển gene không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không
đáng kể. Rễ tơ được xem như là một nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các
HCTN có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm. Vào
năm 2002, Seven đã tổng kết lại những hợp chất alkaloid quan trọng nhất trong ngành
dược được sản xuất bởi các hệ thống rễ tơ, bao gồm Atropa belladonna L., Catharanthus
tricophyllus L., và Datura candida L [43].
Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng
hợp một số lượng lớn HCTN, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất
các HCTN thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc
sản xuất các sản phẩm HCTN trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí
trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm.
Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A. rhizogenes vào tế bào thì ta còn có thể chuyển
các gene ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gene đó vào trong đoạn
T-DNA của A. rhizogenes. Các gene này có thể là gene biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu
hay có thể là các gene mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp ra
HCTN mong muốn. Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá
trình sinh tổng hợp HCTN ở rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp chất tự nhiên với hàm
lượng cao. Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lượng anthraquinone
và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L. tăng cao khi gắn đoạn
gene mã hóa ra enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee

Anisodus luridus

Tropane alkaloid

Armoracia laphthifolia

Peroxidase, Isoperoxidase,Fusicoccin

Artemisia absinthum

Tinh dầu

Artemisia annua

Artemisinin

Astragalus mongholicus

Cycloartane saponin

Atropa belladonna

Atropine

Azadirachta indica A. Juss.

Azadirachtin

Beta vulgaris



Catharanthus tricophyllus

Indole alkaloid

Centranthus ruber

Valepotriate
16


Tên thực vật

HCTN

Chaenatis douglasis

Thiarubrin

Cinchona ledgeriana

Quinine

Coleus forskohlii

Forskolin

Coreopsis

Polyacetylene


Benzophenanthridine
Furoquinoline alanine

Fagopyrum

Flavanol

Fragaria

Polyphenol

Geranium thubergee

Tannin

Glycyrrhiza glabra

Flavonoid

Gynostemma pentaphyllum

Saponin

Hyoscyamus albus

Tropane alkaloid, Phytoalexin

Hyoscyamus muticus


Lithospermum erythrorhizon

Shikonin, Benzoquinone

Lobelia cardinalis

Polyacetylene glucoside

Lobelia inflata

Lobeline, Polyacetylene

Lotus corniculatus

Condensed tannin

Nicotiana hesperis

Nicotine, Anatabine

Nicotiana rustica

Nicotine, Anatabine

Nicotiana tabacum

Nicotine, Anatabine

Panax ginseng



Rubia tinctorum

Anthroquinone

Rudbeckia sp.

Polyacetylene and thiophene

Salvia miltiorhiza

Diterpenoid

Scopolia japanica

Hyoscyamine

18


Tên thực vật

HCTN

Scutellaria baicalensis

Flavonoids and phenylethnoid

Serratula tinctoria


Tanacetum parthenium

Sesquiterpene coumarin ether

Tricosanthes kirilowii maxim var
japonicum

Defense related protein

Trigonella foenum graecum

Diosgenin

Valeriana officinalis L.

Valepotriate

Vinca minor

Indole alkaloid (vincamine)

Withania somnifera

Withanoloide

19