LỜI CÁM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn thạc sĩ tôi đã gặp nhiều khó khăn, trở ngại,
đôi lúc tưởng rằng không thể tiếp tục, nhưng may mắn có được sự động viên của ba
mẹ, sự quan tâm, dìu dắt của các anh chị, thầy cô và sự giúp đỡ của bạn bè, em nhỏ
đã cho tôi nguồn sức mạnh to lớn để tiếp tục hoàn thành đề tài của mình. Và sẽ
không có tôi ngày hôm nay nếu không có mọi người luôn bên cạnh, tôi xin gửi đến
tất cả lời cảm ơn chân thành.
Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin dành cho ba mẹ - người đã sinh ra và nuôi dạy tôi
nên người. Con cảm ơn ba mẹ vì trong bất kỳ hoàn cảnh nào ba mẹ luôn là chỗ dựa
vững chắc giúp con có đủ nghị lực và sức mạnh để vượt qua khó khăn, trở ngại.
Con xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS. Bùi Văn Lệ, cảm ơn thầy đã truyền
niềm đam mê, nhiệt huyết với khoa học đặc biệt là sinh hóa thực vật thông qua
những bài giảng cho con ở giảng đường đại học. Thầy đã tận tình hư ớng dẫn, tạo
điều kiện thuận lợi để con thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths. Quách Ngô Diễm Phương, chị là người
hướng dẫn, cung cấp những kiến thức, kỹ thuật sinh hóa thực vật, đưa ra ý tư ởng,
dẫn dắt và luôn đồng hành cùng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tiếp đến, tôi kính gửi lời cảm ơn đến cô Cung Hoàng Phi Phượng, thầy Kiều
Phương Nam, anh Bùi Xuân Sơn, anh Nguyễn Hữu Hoàng, em Nguyễn Hoài
Nguyên và các em 07CS chuyên ngành Nông nghiệp đã luôn hỗ trợ và chia sẽ với
tôi những lúc khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi cảm ơn các thành viên 05CS Nông nghiệp, cảm ơn FAMI, các
anh chị lớp Hóa Sinh K19 và những người bạn thân đã luôn đ ộng viên và hỗ trợ
Minh; chân thành cảm ơn các thành viên của bộ môn Sinh hóa, bộ môn Di truyền đã
luôn hỗ trợ.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2011
Hoàng Thị Thanh Minh
1

Mở đầu



Dựa trên những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu thu nhận hợp chất thuộc
nhóm stilbene có hoạt tính kháng oxi hóa từ rễ tơ cây đậu phộng (Arachis hypogaea
L.)” được tiến hành với mục đích nghiên cứu khả năng thu nhận hợp chất stilbene
từ rễ tơ nhằm chủ động cung cấp nguồn dược liệu cho việc sản xuất stilbene tại Việt
Nam. Đề tài thực hiện những nội dung chính như sau:
- Xây dựng quy trình nuôi cấy rễ tơ cây đậu phộng được cảm ứng bởi vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.
- Xác định hợp chất thuộc nhóm stilbene và khảo sát hoạt tính kháng oxi
hóa trong các phân đoạn cao được thu nhận từ rễ tơ.
- Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng hợp chất nhóm stilbene trong rễ tơ nuôi
cấy bằng phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứng.
PHẦN 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3


1.1.3. Đặc điểm hình thái
Đậu phộng là một loài cây thân thảo, sống hàng năm, thân cây khi mọc thẳng,
khi mọc bò sát, dài 0,30 – 0,50 m, có khi tới 0,60 – 0,80 m [1]. Thân phân nhánh từ
gốc có các cành tản ra, đâm rễ ở các mấu. Lá kép lông chim, có 4 lá chét hình trái
xoan ngược, gốc tù, đầu tròn hay lõm, mỏng như màng, đối diện từng đôi một. Hai
lá kèm làm thành bẹ bao quanh thân, hình dải nhọn. Cụm hoa chùm ở nách lá gồm 2
- 4 hoa nhỏ, màu vàng. Hoa tự thụ phấn, cuống hoa dài ra đưa hoa xuống đất và
hình thành quả trong đất. Quả không chia đốt hình trụ thuôn, thon lại giữa các hạt,
có vân mạng. Hạt hình trứng, có rãnh dọc; vỏ lụa màu đỏ, cánh sen hay vàng,
trắng.[7]
 Rễ
Hệ thống rễ sơ khởi sẽ được thay thế bằng các rễ mới 3 ngày sau khi nảy
mầm. Mặc dù chiều dài bộ rễ có thể lên đến 135 cm, chúng thường bị giới hạn trong
vùng 5 đến 35 cm bên dưới mặt đất. Rễ cây đậu phộng luôn cộng sinh với vi khuẩn
Bradyrhizobium trong tự nhiên.[
51]
 Thân
Ban đầu khi mới nảy mầm, thân cây đậu phộng có cấu trúc đặc, nhưng khi
cây tăng trưởng dần, chúng có xu hướng trở nên rỗng. Phần thân chính phát triển từ
chồi đỉnh của trục thượng diệp, chúng có thể mọc thẳng lên trên hay nằm bò trên
đất, có chiều dài từ 12 đến 65 cm.
5

Tổng quan tài liệu

 Lá
Lá mọc xen kẽ gồm những lá kép lông chim mang 2 đôi lá chét, dài 18 – 40
mm, rộng 15 – 25 mm. Lá của loài đậu phộng thân bò có nhiều lông tơ ở mặt dưới
[4].
 Hoa

dạng đồng phân cis- hay trans- của dẫn xuất có công thức gần giống với 3,4′,5-
trihydroxy-4-isopentenylstilbene. Trục hạ diệp cây đậu phộng bị nhiễm nấm cũng
chứa dạng đồng phân cis- và trans-3,4′,5-trihydroxystilbene (resveratrol).[13]
Những nghiên cứu gần đây cho thấy cây đậu phộng được trồng trong điều
kiện bình thư ờng, sạch bệnh (không chịu tác động bởi vi sinh vật) cũng sinh tổng
hợp stilbene như piceatannol và resveratrol. Nghiên cứu của Chen và cộng sự
(2001) chứng minh rằng ở rễ cây đậu phộng chứa resveratrol với hàm lượng cao và
đánh giá rễ đậu phộng như là một nguồn nguyên liệu để thu nhận resveratrol. [13]
Cây đậu phộng được trồng chủ yếu để lấy hạt [7]. Thành phần chủ yếu trong
nhân đậu phộng là 40 – 50% chất béo (dầu đậu phộng - Oleum arachidis). Dầu đậu
phộng gồm các glyceride của nhiều acid béo no và không no, với tỷ lệ thay đổi rất
nhiều tùy theo loại đậu phộng: oleic acid (51 – 79%), linoleic acid (7,4 – 26%),
palmitic acid (8,5%), stearic acid (4,5 – 6,2%), hexaconic acid (0,1 – 0,4%), hai
acid thấy trong dầu đậu phộng: có trọng lượng phân tử lớn hơn là arachidic acid
(C
20
) và lignoceric acid (C
24
1
). Hai acid này còn thấy trong bơ cacao, bơ sữa bò.
Trong phần không xà phòng hóa đư ợc ta thấy các sterol và vết vitamin D. Ngoài
những thành phần trên người ta còn thấy trong hạt đậu phộng một chất cầm máu có
tác dụng tốt đối với người máu khó đông. Chất này tan trong nước, có tác dụng trên
trương lực cơ và tác dụng làm có thắt các động mạch. [ ]
7

Tổng quan tài liệu

1.2. Nuôi cấy rễ tơ và phương pháp tăng sinh hợp chất thứ cấp
1.2.1. Giới thiệu về rễ tơ

Mikimopine và cucumopine là các stereo-isomer, nhưng không tìm th ấy sự tương
đồng giữa các gen sinh tổng hợp opine tại mức độ nucleotide. Trong số các chủng
A. rhizogenes được biết đến, K47, K599, và HRI là các dạng độc tính cao có thể
xâm nhiễm vào một phạm vi rộng các loại thực vật khác nhau. [55]
1.2.3. Ứng dụng của nuôi cấy rễ tơ
Nuôi cấy rễ tơ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất hợp chất thứ
cấp, tạo giống cây trồng mới, mô hình nghiên cứu phytoremediation, tìm hiểu con
đường sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học, nghiên cứu sinh lý của rễ và
sản xuất protein tái tổ hợp. Trong đó, sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ tơ được tập
trung nghiên cứu nhiều nhất. [42]

Hình 1.2. Một số ứng dụng của rễ tơ [42]
9

Tổng quan tài liệu

1.2.4. Biện pháp tăng sinh hàm lượng hợp chất thứ cấp
1.2.4.1. Bổ sung tiền chất
Dựa trên kiến thức về con đường sinh tổng hợp, vài hợp chất hữu cơ được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự tổng hợp hợp chất thứ cấp nhằm tăng
hàm lượng [40]. Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng
những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con
đường sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp. Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
tiền chất thích hợp hoặc các hợp chất có liên quan kích thích sự sản xuất các hợp
chất thứ cấp [3]. Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp các hợp chất
thứ cấp mong muốn vào môi trường nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất của
tế bào trong một số trường hợp xác định. Phương pháp này có giá trị cao khi giá
thành của các tiền chất không quá đắt. Các yếu tố như nồng độ và thời gian bổ sung
tiền chất có ảnh hưởng lớn đến việc tăng hàm lượng trong huyền phù tế bào. Bổ
sung loganin, tryptophan và tryptamine đã c ảm ứng sự tổng hợp secologanin và

Furanocoumarin là hợp chất phytoalexin có giá trị y dược và công nghiệp, nó
chỉ tồn tại trong 4 họ: Leguminosae, Apiaceae, Umbelliferae và Rutaceae.
Furanocoumarin được tổng hợp từ cây Citrus bergamia nhưng sản lượng không đáp
ứng đủ nhu cầu ngày càng tăng cao của xã hội. Đáp ứng với tác nhân cảm ứng đã
chứng minh rõ ràng trong nuôi cấy tế bào Ruta graveolens khi được bổ sung dịch
môi trường của Rhodoturula rubra đã vô trùng. Sự tích lũy hợp chất này tăng lên là
do sự cảm ứng của những enzyme chuyên biệt trong quá trình sinh tổng hợp nó như
phenylalanine ammonia lyase (PAL), cinnamate-4-hydroxylase (C4H), 4-
coumarate: CoA ligase (4CL), S-adenosyl-L-methionine: bergaptol-O-
methyltransferase (BMT), và S-adenosyl-L-methionine: xanthtoxol-O-
methyltransferase (XMT). [
41]
Tác nhân cảm ứng là tác nhân hóa học hay sinh học hay vật lý, dẫn đến tế
bào đáp ứng về mặt sinh lý, hình thái và tích lũy phytoalexin. Do đó, tác nhân c ảm
11

Tổng quan tài liệu

ứng được sử dụng như một công cụ để tăng sản lượng hợp chất thứ cấp. Về mặt
phân loại, tác nhân cảm ứng được phân chia thành 2 loại: tác nhận cảm ứng sinh
học và tác nhân cảm ứng phi sinh học. Những năm gần đây, khuynh hướng sử dụng
tác nhân cảm ứng phi sinh học ngày càng phổ biến do giá thành thấp hơn tác nhân
cảm ứng sinh học. [61]
1.3. Stilbene và resveratrol
1.3.1. Giới thiệu về hợp chất nhóm stilbene
Stilbene có khung cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng thơm, n ối với nhau bởi cầu
nối ethylene (C6-C2-C6) thuộc nhóm hợp chất polyphenol [18,56]. Stilbene gồm
có dạng monomer, oligomer và polimer [56]. Stilbene monomer có khối lượng
phân tử nhỏ (210 – 270 g/mol). Stilbene tồn tại ở dạng đồng phân cis-(E) và trans-
(Z). Stilbene trong tự nhiên đa phần tồn tại ở dạng trans- và nhiều nghiên cứu cho Sơ đồ 1.1: Con đường sinh tổng hợp stilbene [20]
Con đường sinh tổng hợp stilbene trên chỉ hình thành cấu trúc stilbene cơ
bản. Ngoài ra, còn có một số enzyme khác liên quan với stilbene synthase xúc tác
sự methyl hóa, đường hóa, đồng phân hóa, oligo hóa khung stilbene cơ bản để hình
thành các hợp chất có cấu trúc phức tạp hơn.[16]

Stilbene thực vật có nguồn gốc từ con
đường phenylpropanoid (Sơ đồ 1.1). Tất cả
thực vật bậc cao đều có thể tổng hợp
malonyl-CoA và CoA-ester của dẫn xuất
cinnammic, nhưng chỉ vài loài thực vật có
thể tổng hợp stilbene. Một số enzyme đầu
của con đường phenylpropanoid như
phenylalanine ammonia lyase (PAL),
cinnamate-4-hydroxylase (C4H) và 4-
coumarate: CoA ligase (4CL). Stilbene
synthase (STS) là đặc trưng của thực vật
tổng hợp stilbene và xúc tác sinh tổng hợp
khung stilbene từ ba malonyl-CoA và một
CoA-ester của dẫn xuất cinnamic acid (hầu
hết là cinnamoyl-CoA hay p-coumaroyl-
CoA).


H OH
trans-
pterostilbene
Vitis,
Vaccinium
OCH OCH
3

H
3OH

Astringin Picea OGlu OH OH OH
Rhapontin Rheum OGlu OH OH
OCH

3

14

Tổng quan tài liệu

1.3.2. Resveratrol
1.3.2.1. Lịch sử nghiên cứu
Resveratrol được xác định lần đầu tiên năm 1940 trong rễ cây Veratrum
grandilorum O. Loes. Đến năm 1963, resveratrol được tìm thấy trong rễ khô của
cây Polygonum cuspidatum (trong tiếng Nhật là Ko-jo-kon) là một loại cây thuốc
cổ truyền chữa viêm da, nhiễm trùng da, mưng mủ, bệnh nấm ngoài da, bệnh tăng

hexapetallum); giống Picea (cây khuynh diệp, vân sam), giống Pinus (thông), giống
Poaceae (các loài cỏ như Festuca, Hordeum, Poa, Stipa), giống Trifolium, giống
Nothofagus, giống Artocarpus, giống Gnetum, Pleuropterus ciliinervis; Bauhinia
racemosa; Paeonia lactiflora; Scilla nervosa; và Tetrastigma hypoglaucum. (hình
1.3) [10]

Hình 1.3. Nguồn resveratrol ở các loài thực vật khác nhau [10]
16

Tổng quan tài liệu

1.3.2.3. Tính chất hóa lý của resveratrol
Resveratrol (3,4’,5-trihydroxystilbene) ở dạng bột màu trắng nhạt, nhiệt độ
nóng chảy 253 – 255
o
C, công thức phân tử là C
14
H
12
O
3
9
và trọng lượng phân tử
228,25 g/mol [ ]. Resveratrol không tan trong nước nhưng tan trong ethanol và
dimethylsulphoxide. Trị số R
f
45
lần lượt là 0,68 trên sắc ký bản mỏng với hệ dung
môi hệ dung môi giải ly chloroform:ethyl acetate:formic acid (5:4:1); 0,11 với hệ
dung môi toluene:methanol (9:1) [ ]; 0,24 với hệ dung môi chloroform:acetic acid

sự, 2006; Hurst và cộng sự, 2008).[34]
Trans-resveratrol có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh, nó làm thay đổi sự oxi
hóa của lipid (Frankel và Waterhouse, 1993; Leighton và cộng sự, 1999). Do hoạt
tính kháng oxi hóa, trans-resveratrol được giả thuyết đóng vai trò quan tr ọng trong
việc ngăn ngừa các bệnh về tim mạch (Bradamante và cộng sự, 2004) và cũng
kháng một số loại ung thư (Aggawal và cộng sự, 2004; Kundu và Surh, 2008). Khả
năng kháng ung thư của trans-resveratrol được tìm ra đ ầu tiên năm 1997 (Jang và
cộng sự, 1997); từ đó rất nhiều công bố về khả năng kháng ung thư của trans-
resveratrol liên quan đến ảnh hưởng nó lên cơ chế tế bào như điều hòa sự phát triển
và tăng sinh tế bào (Roemer và Mahyar-Roemer, 2002; Pervaiz, 2003; Aggarwal và
cộng sự, 2004). Tác động kháng ung thư của trans-resveratrol thể hiện qua khả
năng ức chế sự tăng sinh tế bào và có tác động gây độc tế bào trực tiếp lên khối u.
Hơn thế nữa, trans-resveratrol còn có tác dụng trong điều trị đái tháo đường và
những bệnh suy giảm thần kinh như Alzheimer thông qua sự cảm ứng gen Sirtuin 1.
Ngoài ra, resveratrol cũng góp phần kéo dài tuổi thọ. [34]
- Ứng dụng của trans-resveratrol trong nông nghiệp
Sự ảnh hưởng của trans-resveratrol lên sinh lý thực vật cũng có nhiều ứng
dụng đặc biệt trong nông nghiệp. Trans-resveratrol thể hiện hoạt tính kháng nấm
mốc ((Jeandet và cộng sự, 2002; Adrian và Jeandet, 2006); nó hoạt động như
phytoalexin được tạo ra khi đáp ứng với stress như sự tấn công của tác nhân gây
bệnh, bị thương (Langcake và Pryce, 1976). Trong gỗ, trans-resveratrol được tạo ra
18

Tổng quan tài liệu

và hoạt động như một phytoanticipin (Van Etten và cộng sự, 1994). Bên cạnh đó,
một số thực vật được biến đổi di truyền bằng cách chuyển gen stilbene synthase hay
resveratrol synthase (STS) để tạo trans-resveratrol nhằm đánh giá vai trò c ủa
resveratrol trong việc điều hòa bệnh và tăng cường sức khỏe một số loài thực vật
như thuốc lá, cà chua, khoai tây (Giorcelli và cộng sự, 2004; Halls và Yu, 2008;

Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi như là sinh vật mô hình để sản suất nhiều
hợp chất có giá trị. Những gen cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp resveratrol
không có trong vi sinh vật. Vì vậy, để sản xuất trans-resveratrol sử dụng vi sinh vật
thì cần phải chuyển những gen cần thiết vào vi khuẩn hoặc nấm mốc và phải bổ
sung coumaric acid, tiền chất của resveratrol vào môi trường nuôi cấy. Hiệu quả của
vi sinh vật tái tổ hợp trong sinh tổng hợp trans-resveratrol phụ thuộc nhiều tác nhân
như loài, chủng và nguồn gốc của gen chuyển, cũng như các thông số như plasmid,
tiền chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, resveratrol tổng hợp từ
phương pháp này vẫn thấp hơn 10 lần so với phương pháp nuôi cấy huyền phù tế
bào Vitis spp. [20]
Phương pháp nuôi cấy rễ tơ được nghiên cứu để sản xuất nhiều hợp chất có
hoạt tính sinh học. Gần đây, các nhà khoa học Mỹ và Hàn Quốc đã sử dụng nuôi
cấy rễ tơ cây đậu phộng cho mục tiêu thu nhận resveratrol. Hàm lượng resveratrol
phụ thuộc vào chủng A. rhizogenes cảm ứng tạo rễ tơ, các tác nhân cảm ứng. Những
kết quả nghiên cứu đó cho thấy nuôi cấy rễ tơ đậu phộng là phương pháp đầy hứa
hẹn để sản xuất resveratrol ở quy mô lớn.
PHẦN 2
VẬT LIỆU - PHƯƠNG
PHÁP
20


2.1.3. Hóa chất sử dụng
2.1.3.1. Hóa chất sử dụng trong thử hoạt tính kháng oxi hóa
- Phương pháp Yen và Duh: Vitamine E (α-tocopherol), Potassium ferricyanide
(K
3
(Fe(CN)
6
)), acid tricloroacetic, NaH
2
PO
4
. 2H
2
O, Na
2
HPO
4
.12H
2
O,
FeCl
- Phương pháp DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
3

2.1.3.2. Hóa chất PCR (Polymerase chain reaction)
- Các hóa chất: Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq buffer (Fermentas),
dNTPs 2mM (Fermentas), nước siêu sạch.
- Mồi sử dụng:
• Mồi khuếch đại gen rolB
Gen rolB được khuếch đại với cặp mồi rolBF và rolBR. Sản phẩm khuếch