ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN
BỀ MẶT CỦA TRYPANOSOMA EVANSI VÀ ỨNG DỤNG
KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ĐỂ SẢN XUẤT KÍT
CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Phan Thị Hồng Phúc
2. TS. Phạm Thị Tâm

Thái Nguyên, năm 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này
là của chúng tôi.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này chưa từng được công bố

Hoàng Thị Hồng Hạnh

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

iii

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

CATT

Card Agglutination Test for Trypanosomiasis

ADN

Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP

Deoxynucleotid triphotphat

EDTA

Ethylen Diamin Tetra Acetic

IFAT

Indirect Fluorescent Antibody Test


Trypanosoma evansi

VAT

Variant Antigen Tupe

VSG

Variant Surface Glucoprotein

v/p

Vòng/phút

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

iv

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của của đề tài ................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài. ................................................ 2
3.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................................. 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4
1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC ................ 4
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng ....................... 4

2.3.3. Phương pháp biểu hiện ........................................................................ 39
2.3.4. Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+.............. 39
2.3.5 Phương pháp điện di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) ................. 42
2.3.6 Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) .................... 42
2.3.7 Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002).......................... 43
2.3.8 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA ....................... 44
2.3.9 Xác định độ lặp lại của kết quả phản ứng ELISA ................................. 44
Chƣơng 3: KẾT

........................................................... 46

3.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL21/pET-RoTAT 1.2.................... 46
3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 ............................ 48
3.3. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT
1.2 trong E.coli............................................................................................... 50
3.3.1. Nghiên cứu xác định thời gian tăng sinh chủng biểu hiện............................. 50
3.3.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ tăng sinh chủng biểu hiện .............................. 51
3.3.3. Nghiên cứu xác định mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn và mức độ
biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 ........................................... 51
3.3.4. Nghiên cứu xác định độ pH phù hợp để sinh tổng hợp protein tái tổ hợp
RoTAT 1.2......................................................................................... 53
3.3.5. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp
kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 .................................................. 54
3.3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của IPTG đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ
hợp RoTAT 1.2 .................................................................................. 55
3.4. Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2............................ 56

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

Bảng 3.1. Xác định hiệu giá huyết thanh và nồng độ kháng nguyên tối ưu
cho phản ứng ELISA (S/N) ............................................................. 59
Bảng 3.2. Giá trị OD của phản ứng ELISA với các tác nhân block ............. 60
Bảng 3.3. Kết quả phản ứng ELISA để xác định độ nhạy và đặc hiệu .......... 63
Bảng 3.4. Kết quả xác định mức độ lặp lại kết quả phản ứng ELISA ........... 63
Bảng 3.5. Kết quả xác định trâu, bò nhiễm bệnh tiên mao trùng bằng
phương pháp ELISA và PCR .......................................................... 64

Số hóa bởi trung tâm học liệu

/>

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Kích thước các thang chuẩn .................................................................... 31
Hình 3.1 Trình tự gen và trình tự axit amin suy diễn của RoTAT 1.2..................... 46
Hình 3.2. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli BL21 ............................ 47
Hình 3.3 Kết quả điện di protein tổng số của trên gel SDS-PAGE ......................... 48
Hình 3.4 Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein tái tổ hợp RoTAT
1.2 với kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi ............................. 49
Hình 3.5. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng .................. 50
Hình 3.6. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nhiệt độ nuôi cấy .................. 51
Hình 3.7. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị OD khác nhau................. 52
Hình 3.8 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị pH khác nhau .............. 53
Hình 3.9. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh
ampicillin bổ sung vào môi trường ....................................................... 54
Hình 3.10. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ IPTG cảm
ứng .................................................................................................... 55

trùng còn là vấn đề rất mới. Các công trình nghiên cứu hầu như chỉ tập chung vào
xác định đặc điểm dịch tễ, hiệu quả chẩn đoán của một số phương pháp phát hiện
tiên mao trùng và phương pháp phát hiện kháng thể, chưa có công trình nào nghiên
cứu chế tạo Kít chẩn đoán bệnh.
Để sản xuất Kít chẩn đoán, cần phải có một lượng lớn kháng nguyên RoTAT
1.2, nguồn kháng nguyên này có thể được sản xuất bởi 2 phương pháp: tự nhiên và
tái tổ hợp.
Kháng nguyên tự nhiên được tách từ ký sinh trùng sau khi tăng sinh trên động
vật thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thời tạo ra một lượng
lớn kháng nguyên. Tuy nhiên, kháng nguyên này không tinh khiết, thành phần đa
dạng, vì vậy có khả năng gây phản ứng dương tính giả với các kháng thể khác.
Trong khi kháng nguyên tái tổ hợp có thể khắc phục được những hạn chế trên.


2

Theo nghiên cứu của Urakawa và cs (2001) [30], kháng nguyên tái tổ hợp
RoTAT 1.2 được sản xuất dựa trên chức năng biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên
vào tế bào côn trùng dòng Sf 9. Dòng tế bào tái tổ hợp có khả năng tổng hợp và tiết
kháng nguyên vào dịch nuôi cấy tế bào. Khi ứng dụng kháng nguyên RoTAT 1.2
vào sản xuất Kít chẩn đoán, kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy tương tự như với
kháng nguyên RoTAT 1.2 tự nhiên, nhưng có độ đặc hiệu cao hơn tương ứng là
99% và 89,3%. Kết quả này cho thấy khả năng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
phát hiện được kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi.
Như vậy, để chủ động nguồn kháng nguyên tinh khiết để sản xuất Kít chẩn
đoán nhanh và chính xác, từ đó có biện pháp điều trị kịp thời và hiệu quả bệnh tiên
mao trùng cho gia súc ở Việt Nam thì vấn đề nghiên cứu chế tạo kháng nguyên tái
tổ hợp sản xuất Kít phát hiện kí sinh trùng Trypanosoma evansi gây bệnh trên gia
súc và đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả là vấn đề cấp thiết.
Với mục tiêu sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trong


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC
Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam.
Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước.
Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Trâu, bò, ngựa mắc bệnh
dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản
xuất.
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
1.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật
nguyên sinh
Theo Levine và cs (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997 [5]), vị trí của
tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida
Bộ Kinetoplastorida
Phân bộ Trypanosomatorida
Họ Trypanosomatidae Donein, 1901
Giống Trypanosoma Gruby, 1843
Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (M) theileria
Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901
Loài Trypanosoma (H) leisi
Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909
Loài Trypanosoma (S) cruzi
Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918
Loài Trypanosoma (D) vivax
Loài Trvpanosoma (D) uniform


chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên
mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972 [26]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7];
Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).


6

- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh chất
có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng,
kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới
golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng.
Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về
phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN). Từ kinetoplast có một roi
chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của tiên
mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi ống ở
xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [26];
Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]).
1.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi
Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng
nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi
* Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)
Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi trong
quá trình sống ký sinh. Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết thanh thỏ tối
miễn dịch với T. evansi, Kageruka (1982) đã phát hiện tới 30 thành phần kháng
nguyên khác nhau. Có ba loại kháng nguyên không biến đổi ở màng nguyên sinh
chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và ISG 100. Do
cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa nước, các loại này không kết hợp với
kháng thể của vật chủ.
-

kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ. Tuy nhiên, Van
Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã
có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch
của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981), hiện tượng biến đổi kháng
nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm
miễn dịch. Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng
nguyên biến đổi của tiên mao trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng
nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất.
* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi
Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG),
làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá
của gen. Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng


8
các phân tử VSG mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước đã không còn tác dụng
đối với kháng nguyên mới này.
Theo Barry và Tumer (1991) [22], các VSG được mã hoá nhờ các gen
chuyên biệt. Từ kho chứa hàng nghìn đến khác nhau, một gen VSG được hoạt hoá
một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG. Mỗi bên VSG
mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ gen của tiên mao trùng tồn
tại một số lớn gen VSG, các gen này sử dụng nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do
vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở gia súc bị bệnh mãn tính. Cơ
chế biến đổi kháng nguyên theo 2 cách: cách thứ nhất là, sử dụng lần lượt các điểm
biểu hiện trên (expression side) khác nhau, không có sự sắp xếp của ADN. Các
điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn
đến sự thay đổi type kháng nguyên. Cơ chế này quan sát được chủ yếu ở giai đoạn
đầu của quá trình cảm nhiễm. Có lẽ ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch
của vật chủ đối với VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên
của các điểm biểu hiện gen này. Cách thứ hai là, tập hợp lại các đoạn ADN khác

(rừng thưa, độ cao không quá 500 mét so với mặt nước biển có 27 loài; vùng đồi
trọc chỉ có 9 - 11 loài; vùng rừng núi ven biển phát hiện chỉ có 8 loài. Những loài
mòng phổ biến ở tất cả các vùng là: Tabanus rubidus, T. striatus, Chrysops dispar,
Chrysozoma assamensis.
Phan Địch Lân (2004) [9] cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm thấy hai loài
mòng T. rubidus và T. striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ 15,2% và 14,0%; ruồi
hút máu Stomoxys calcitrans mang tiên mao trùng với tỷ lệ 12,5%. Ở những vùng
đang có bệnh tiên mao trùng, kiểm tra ruồi và mòng hút máu dễ dàng tìm thấy tiên
mao trùng. Sau khi theo máu vào vòi hút ruồi và mòng, tiên mao trùng vẫn sống đến
giờ thứ 53, thời gian hoạt động mạnh nhất là từ giờ thứ nhất đến giờ thứ 34, trung
bình là 24 giờ. Sự hoạt động của tiên mao trùng yếu dần từ giờ thứ 35 đến 42. Từ 46 53 giờ thì tiên mao trùng ngừng hoạt động.
Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian: từ 1 34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ: tiên mao trùng có hình dạng
thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53 giờ: tiên mao trùng trương to,
duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động.
Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau khi
xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: Thời gian từ giờ thứ 1 đến thứ 5,
tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tự như khi


11
truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7 chỉ còn 30%
số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và thời gian chết của
chuột cũng dài. Điều này có thể giải thích là do độc lực của tiên mao trùng giảm dần
và số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh cũng giảm dần sau khi chúng xâm
nhập vào mòng Tabanus rubidus.
1.1.2.3. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh
Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao trùng và
đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu, giảm sức đề
kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất.
Phan Địch Lân (2004) [9] đã tổng hợp kết quả điều tra 3.172 trâu ở các tỉnh

phát hiện thấy tiên mao trùng. Mỗi đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu
hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới,
quần thể này có thể tiếp tục sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất
hiện kháng thể đặc hiệu với chúng.
Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose và các chất đạm,
chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phương thức thẩm thấu qua bề mặt cơ
thể để duy trì hoạt động và sinh sản. Ở súc vật bị bệnh, trong 1 ml máu có thể có
10.000 - 30.000 tiên mao trùng. Với số lượng nhiều như vậy, tiên mao trùng chiếm
đoạt dinh dưỡng nhiều, làm cho súc vật bệnh gây còm, thiếu máu và mất dần khả năng
sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năng sinh sản và giảm sức đề kháng với các bệnh khác.
Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin, độc tố
này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quá trình sống và độc tố
do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau 15 - 30 ngày. Độc tố của tiên
mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ương làm rối loạn trung khu điều hoà thân
nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt, lúc hết sốt xen kẽ nhau). Khi sốt thường có rối
loạn về thần kinh (kêu rống, run rẩy, ngã vật xuống). Độc tố cũng phá huỷ hồng cầu, ức
chế cơ quan tạo máu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhược dần. Độc tố còn tác động
tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội chứng tiêu chảy
thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh.
Khi tăng lên với số lượng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắc các mao
mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo
vàng dưới da.


13
1.1.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa
* Ở trâu, bò:
Trâu, bò bị bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như sau:
- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 - 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyền tiên
0

Nếu gặp điều kiện bất lợi như thiếu ăn, rét mướt thì trâu, bò dễ chết. Trong thực tế,
có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làm việc bình thường khi được
chăm sóc nuôi dưỡng tốt.
Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T. evansi gây ra. Số lượng
hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng, thành phần bạch
cầu thay đổi: bạch cầu lymphô, bạch cầu ái toan tăng nhưng bạch cầu trung tính
giảm, protein tổng số và Albumin giảm rõ rệt.
* Ở ngựa
Sau khi ruồi, mòng hút máu và truyền T. evansi, ngựa phát bệnh sau 1 - 2
0

tuần. Triệu chứng rõ nhất là ngựa sốt 40 - 41 C, sốt gián đoạn, khi sốt có tiên mao
trùng ở máu ngoại vi. Khi bị bệnh nặng, ngựa thường sốt cao đột ngột, các triệu
chứng khác chưa kịp thể hiện thì con vật đã lăn lộn điên cuồng rồi chết. Thể bệnh
cấp tính diễn ra khoảng 1 - 3 tuần, thể mãn tính kéo dài 2 - 4 tháng (tuy nhiên, thể
mãn tính thường ít gặp).
Hiện tượng thuỷ thũng xuất hiện ở vùng thấp của cơ thể (ngực, bụng, âm hộ,
vú) sau 1 - 2 tuần kể từ khi phát bệnh. Ngựa đi đứng xiêu vẹo, gầy sút rất nhanh, ăn
kém, da khô, lông dựng, bốn chân run rẩy, hay nằm, dần dần liệt chân, nằm một chỗ
rồi chết.
1.1.3.3. Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng
Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những
biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích
nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng,
mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và có tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt
nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt; có những
đám keo nhầy vàng dưới vùng da thuỷ thũng.
1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
1.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Các biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa

trong 25 phút. Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô rồi soi dưới kính hiển
vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng, do đó
khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều loài tiên mao
trùng cùng một lúc.


16
+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng
la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2
phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS pH = 7,2).
Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại
10 x 100 hoặc 10 x 90).
Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái các
loài tiên mao trùng khác nhau.
+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)
là chất làm tan hồng cầu. Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng được phát
hiện trong máu. Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da và tránh hút bằng
pipet. Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trong nhiều tháng (Van
Meirvenne, 1989).
* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:
Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằng ống
Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose.
- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (WOO, 1971): cho
máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt kín bằng
chất dẻo matit, một đầu ống để hở. Ly âm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút.
Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị trí tiếp giáp giữa huyết tương
và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).
Phương pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phương pháp
xem tươi và nhuộm Giemsa. Song, tỷ lệ phát hiện chưa cao.