TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH
SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN TÁO
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN
XUẤT RƯỢU DÂU TẰM

CBHD: PGS.TS.NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
SVTH: ĐẶNG THỊ XUÂN THÙY
MSSV: 60604406


TP HCM, 1/2011


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:
PGS. TS. Nguyễn Đức Lượng – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại
Học Bách Khoa TpHCM – đã gợi ý đề tài và hướng dẫn tận tình, động viên và giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những
kiến thức quý báu có liên quan đến đề tài.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM –
đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận
văn.

iii

2.1.3 Các phương pháp cố định vi sinh vật .............................................................4
2.1.4 Ưu nhược điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do ....................7
2.1.5 Chất mang táo .................................................................................................8
2.2 Công nghệ sản xuất rượu vang ............................................................................12
2.2.1 Dâu tằm ........................................................................................................12
2.2.2 Công nghệ sản xuất rượu vang .....................................................................14
2.3 Một số nghiên cứu có liên quan đến đề tài ..........................................................31
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................31
2.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...............................................................32
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .....................................................36
3.1 Vật liệu ................................................................................................................36
3.1.1 Dâu tằm ........................................................................................................36
3.1.2 Táo ................................................................................................................36
v


3.1.3 Giống vi sinh vật ..........................................................................................36
3.1.4 Môi trường nuôi cấy .....................................................................................36
3.1.5 Hóa chất- dụng cụ .........................................................................................36
3.2 Phương pháp thí nghiệm......................................................................................37
3.2.1 Sơ đồ thí nghiệm...........................................................................................37
3.2.2 Phương pháp thí nghiệm...............................................................................37
3.3 Phương pháp phân tích ........................................................................................40
3.3.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào cố định trên táo .................................40
3.3.2 Phương pháp xác định pH ............................................................................40
3.3.3 Phương pháp xác định độ Brix .....................................................................40
3.3.4 Xác định độ cồn ............................................................................................40
3.3.5 Phương pháp cảm quan ................................................................................41
Chương 4: Kết quả ......................................................................................................43
4.1 Khảo sát giống vi sinh vật ...................................................................................43

Bảng 4. 1 Kết quả lập đường chuẩn của nấm men S.cerevisiae ...................................44
Bảng 4. 2 Mật độ tế bào S.cerevisiae thay đổi theo thời gian .......................................45
Bảng 4. 3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng lên men rượu dâu tằm..................46
Bảng 4. 4 Ảnh hưởng của độ Brix đến khả năng lên men rượu dâu tằm ......................47
Bảng 4. 5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng lên men rượu dâu tằm .............................48
Bảng 4. 6 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng lên men rượu dâu tằm....................49
Bảng 4. 7 Mật độ tế bào nấm men cố định trên một số loại táo và cấu trúc của táo sau
cố định ...........................................................................................................................51
Bảng 4. 8 Ảnh hưởng của chế độ lắc đến mật độ tế bào cố định ..................................53
Bảng 4. 9 Kết quả lên men rượu bằng nấm men cố định và so sánh với lên men bằng
nấm men tự do ...............................................................................................................54
Bảng 4. 10 Kết quả đánh giá cảm quan.........................................................................57

viii


Danh mục hình
Hình 2. 2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang .....................5
Hình 2. 1 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào ...........................................................5
Hình 2. 3 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang ...............................6
Hình 2. 4 Phương pháp cố định bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật .............6
Hình 2. 5 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật không mang chất mang ...................7
Hình 2. 6 Một số loại dâu tằm ......................................................................................12
Hình 2. 7 Quá trình đường phân ...................................................................................19
Hình 2. 8 Quá trình lên men rượu .................................................................................20
Hình 2. 9 Sự tạo thành các sản phẩm phụ .....................................................................21
Hình 3. 1 Sơ đồ nghiên cứu ..........................................................................................37
Hình 4. 1 Khuẩn lạc S.cerevisiae ..................................................................................43
Hình 4. 2 Tế bào S.cerevisiae quan sát dưới kính hiển vi ............................................43
Hình 4. 3 Đường chuẩn S.cerevisiae ............................................................................44

tự nhiên và lên men nhờ các chủng nấm men thuần khiết. Theo tài liệu của tổ chức
quốc tế về nghề trồng nho và làm rượu vang, nhiều quốc gia trên thế giới như Pháp,
Italia, Mexico, Bồ Đào Nha,…chỉ dùng nấm men có sẵn trong nước quả để lên men.
Tuy nhiên phương pháp sử dụng nấm men thuần khiết để sản xuất rượu vang được
đánh giá có rất nhiều ưu điểm hơn: thời gian lên men nhanh, hàm lượng đường trong
dịch quả được lên men triệt để, nồng độ cồn thu được trong vang cao hơn lên men tự
nhiên từ 0,1 ÷1, vang sáng màu nhanh hơn, có thể cho hương vị thanh khiết hơn. Nấm
men thuần khiết được bổ sung vào lên rượu thường ở dạng tự do, nhưng hiện nay với
những ưu điểm về mặt kĩ thuật cũng như về mặt kinh tế, việc sử dụng nấm men cố
định đang rất được quan tâm. Đã có rất nhiều các nghiên cứu cố định nấm men thuần
khiết trên các loại chất mang khác nhau để ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất rượu
vang.
Phần lớn các nghiên cứu đã thực hiện theo hướng tìm ra một loại chất mang
thích hợp để cố định nấm men và có khả năng ứng dụng trong lên men rượu. Đã có
những chất mang được nghiên cứu như kissiris, các vật liệu polymer như
polysaccharide, alginate, cellulose, carregeenan, agar, v.v…. Chất mang thích hợp là
nguyên liệu vừa rẻ vừa cho mùi vị thơm ngon cho rượu vang, đồng thời kỹ thuật cố
định đơn giản. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng chất mang từ nguyên liệu trái cây
đáp ứng được các yêu cầu trên và rất có tiềm năng trong công nghiệp sản xuất rượu.
Trong đó táo vừa là nguyên liệu rẻ tiền, có sẵn trong tự nhiên, đã được sử dụng để làm
sản phẩm cider nổi tiếng cho hương vị thơm ngon. Do đó táo hoàn toàn có thể ứng
dụng làm chất mang cố định.
Ở nước ta, cây dâu tằm được trồng ở khu cực sông Hồng, sông Đáy, sông Thái
Bình, tỉnh Lâm Đồng. Sản lượng dâu tằm hằng năm khá lớn. Trái dâu tằm được xem là
1


Chương 1: Mở đầu

một trái cây quý, không chỉ có hương vị thơm ngon mà còn có tốt cho sức khỏe, chữa

bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên khi các tế bào có thể phát triển
trên bề mặt và bên trong các cấu trúc tự nhiên [39].
Cố định tế bào còn được định nghĩa là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất
mang không hòa tan trong nước, tế bào sau khi sử dụng có thể được tái sử dụng
nhiều lần, không bị lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong
muốn [2].
2.1.2 Chất mang trong kĩ thuật cố định tế bào vi sinh vật
2.1.2.1 Yêu cầu đối với chất mang
Chất mang dùng để cố định tế bào vi sinh vật phải đạt các yêu cầu
sau:
 Phải có diện tích bề mặt lớn và có các nhóm chức để vi sinh vật
bám vào.
 Dễ sử dụng và tái sử dụng nhiều lần.
 Khả năng sống của tế bào và họat tính sinh học của chế phẩm
cố định phải cao và duy trì trong một thời gian dài.
 Hoạt tính sinh học của các tế bào cố định không bị ảnh hưởng
bất lợi bởi quá trình cố định.
 Cấu trúc xốp của chất mang phải đồng nhất và dễ kiểm soát để
cơ chất, sản phẩm, dễ dàng trao đổi.
 Chất mang phải có tính bền về mặt vật liệu lý, hóa học và cơ
học, chịu nhiệt và ổn định sinh học. Không bị phá hủy một cách dễ
dàng bởi enzyme, dung môi, sự thay đổi áp suất.
 Chất mang có kĩ thuật cố định dễ dàng, chi phí thấp, có thể
nâng cấp lên qui mô lớn.
 Phải có độ an toàn thực phẩm cao, không ảnh hưởng đến chất
lượng sản phẩm và được sự chấp nhận của người tiêu dùng
[21,35].
3



Chương 2: Tổng quan tài liệu

Cố định tế bào vi sinh vật

Trên bề mặt chất

Trong lòng chất mang

Không mang chất
mang

Liên
kết

Hấp phụ

Nhốt
trong
cấu trúc
hệ sợi

Nhốt
trong cấu
trúc gel

Liên

Màng

kết


Hình 2. 3 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang [39].

2.1.3.3 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật không mang chất mang
a. Phương pháp cố định bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật (sự
kết bông):
Theo đó, các tế bào liên kết với nhau thành một khối tế bào. Sự
liên kết giữa các tế bào được xem như một phương pháp cố định tế bào
do sự kết tụ lại của các tế bào làm cho chúng có thể được sử dụng trong
các thiết bị phản ứng. Phương pháp này được xem xét là có thể xảy ra ở
các loại nấm men, nấm mốc và tế bào thực vật. Sự kết tụ của các tế bào
nấm men là một ứng dụng quan trọng trong ngành sản xuất rượu vang do
sự ảnh hưởng tới quá trình lên men và tách tế bào nấm men ra khỏi sản
phẩm [39].

Hình 2.4 Phương pháp cố định bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật
[39]

b. Phương pháp cố định bằng màng chắn membrane
Trong đó, tế bào được chứa trong một lớp màng lọc hoặc trong vi
bao. Kỹ thuật cố định vi sinh vật bằng vi bao đã được ứng dụng rộng rãi
đặc biệt là vào ngành sản xuất rượu, một ví dụ là sản phẩm “Milispark”,
được nâng cao từ “Milipore”. Nhược điểm của phương pháp cố định tế
bào bằng phương pháp vi bao là sự hạn chế của hoạt động trao đổi chất
và có thể bị tắc nghẽn do tế bào tăng sinh, cũng như tính chuyên biệt đối
với mỗi loại vi sinh vật [39].
6


Chương 2: Tổng quan tài liệu


Chương 2: Tổng quan tài liệu
2.1.4.2 Nhược điểm
Bên cạnh đó, các tế bào cố định cũng có những hạn chế như:
 Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do
 pH hoạt động tối ưu bị chuyển dịch sang kiềm hay acid so với
tế bào bình thường
 Cơ chất muốn vào trong tế bào để thực hiện trao đổi chất tạo
sản phẩm phải qua chất mang, thành tế bào, màng tế bào … chính chất
mang sẽ ảnh hưởng đến sự thẩm thấu vào ra của cơ chất và sản phẩm.
Vì thế phải lựa chọn chất mang phù hợp với kỹ thuật cố định tế bào để
giảm trở lực của quá trình thẩm thấu.
2.1.5 Chất mang táo
2.1.5.1 Giới thiệu
Trái táo, tên khoa học Malus domestica, là một loại trái cây khá phổ
biến, được trồng ở các vùng địa lý giữa vĩ độ 30 và 60 ở cả bắc bán câu và
nam bán cầu. Táo thuộc họ Rosacea. Chúng thích nghi tốt với khí hậu ôn đới,
những nơi mà có ít nhất 2 tháng khí hậu lạnh. Việc ra quả bắt đầu vào cuối
mùa xuân, khi cây bắt đầu ra hoa nhìn giống như bông hồng nhỏ. Hoa tạo
thành phấn hoa và mật hoa hấp hẫn ong và những loại côn trùng khác thụ
phấn cho hoa, trái chín trong khoảng 140-170 ngày. Một cây táo có thể cho
trái từ 6-8 năm [40]. Do những thuận lợi trong sản xuất, bảo quản, phát triển
sản phẩm, giá trị thương mại nên trái táo được sử dụng phổ biến vào công
nghiệp sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp sản xuất cider.
Mặc dù nhiều giống táo đều có thể được thu hoạch trong tháng 8 và
đầu tháng 9, nhưng phần lớn táo ở Mỹ đều được thu hoạch vào cuối tháng 9
và suốt tháng 10. Táo được bảo quản ở nhiệt độ 0oC hoặc -1oC với độ ẩm từ
92-95% thì giữ được trong một thời gian ngắn. Với điều kiện bảo quản thích
hợp, sau khi thu hoạch táo có thể để được 12 tháng.
Táo được trồng nhiều ở các nước ôn đới, khả năng thích nghi của

China

6.07

7.43

8.53

9.06

9.69

8.17

2

U.S.A.

24.72

27.92

25.86

26.92

25.37

23.54


31.77

5

Poland

12.72

10.69

9.71

8.78

14.63

12.77

6

Iran

14.17

12.31

14.81

14.54


4.31

3.91

4.14

9

Germany

24.57

25.51

25.20

44.81

27.55

22.86

10

India

5.88

5.80


25.39

31.42

22.49

32.35

30.00

13

Japan

21.32

19.32

20.80

18.21

21.53

21.51

14

Brazil


34.87

37.59

43.93

34.36

38.05

9.30

9.70

10.22

10.82

11.07

10.06

16 New Zealand
Thế giới
17
(Tổng cộng)

9




Lipids

0,17g

Photpho

11,0mg

Tro

0,19g

Kali

107mg

Carbohydrate

13,81g

Natri

1,0mg

Sucrose

10,39g

Kẽm


Calo

52,0Kcal

Calcium

6,00mg

Táo chứa khoảng 85% nước, 12-14% carbohydrate, khoảng 0,3%
protein, chất béo < 0,1%, chất khoáng và vitamin. Thành phần này còn thay
đổi tùy theo giống, vị trí trồng trọt, điều kiện khí hậu, thời điểm thu hoạch.
Mùi thơm và vị ngon của từng loại táo rất khác nhau, còn phụ thuộc
vào điều kiện khí hậu trồng trọt, các biến đổi, chuyển hóa trong quá trình
chín, bảo quản,…Các chất tạo mùi có trong trái táo chủ yếu là ethyl acetate,
ethyl propionate, propyl acetate , 2-methyl butyl acetate, butyl isomyl, hexyl
hexanoates,…
Táo là nguồn quan trọng cung cấp các flavonoid thực vật, hợp chất
thứ cấp có khả năng chống oxy hóa, chúng giúp chống lại sự lão hóa, các tế
bào ung thư, bệnh tim động mạch vành. Táo và các sản phẩm từ táo chứa các
flavonol, quercetin glucosides, catechins, và hydroxycinnamic acid. Các
Flavonol có nhiều trong vỏ hơn là trong thịt táo, trong khi đó các
10


Chương 2: Tổng quan tài liệu
hydroxycinnamic như chlorogenic acid thì lại hiện diện trong thịt nhiều hơn
trong vỏ. Hàm lượng flavonoid tùy thuộc vào từng loại táo [40].
2.5.1.3 Cấu tạo tế bào thịt quả
Trong các thành phần của trái táo đã kể trên thì carbohydrate đóng vai

1994–1995

Brix

11.8 ± 0.2

10.3 ± 0.3

Acid (% malic acid)

0.93 ± 0.7

1.0 ± 0.13

Cấu trúc (kg/cm2)

7.3 ± 0.4

7.8 ± 0.3

11


Chương 2: Tổng quan tài liệu
2.2 Công nghệ sản xuất rượu vang
2.2.1 Dâu tằm
Cây dâu tằm có tên chung là Mulberry, chúng có nhiều giống khác nhau
như: White Mulberry (Morus alba L.), Black Mulberry (Morus nigra L.),
American Mulberry, Red Mulberry (Morus rubra L.). Chúng có họ hàng gần với
giống Korean Mulberry (Morus australis), Himalayan Mulberry (Morus

b. Quá trình sinh trưởng và phát triển
Cây dâu tằm thuộc loại cây rụng lá theo mùa. Morus alba L. có thể
cao đến 30 ft, thường phát triển theo dạng hình chóp hoặc dạng tán.
Trong điều kiện đất đai màu mỡ thì Morus rubra L. có thể cao 70 ft.
Morus nigra L. là giống thấp nhất trong ba giống dâu tằm, chúng chỉ cao
khoảng 30 ft, chúng có khuynh hướng phát triển theo dạng bụi nếu không
được chăm sóc từ nhỏ. Các loại dâu tằm có tuổi thọ rất khác nhau, Morus
rubra L. có thể sống trên hơn 75 năm, trong khi Morus alba L. và Morus
nigra L. sống trên 100 năm.
c. Hình thái
Dâu tằm có quả không phải hoàn toàn giống quả mọng mà chỉ là
tập hợp bề ngoài tương tự quả mâm xôi. Khi hoa đã được thụ phấn chúng
bắt đầu phình to, cuối cùng chúng thay đổi hoàn toàn kết cấu, màu sắc và
trở nên mọng, nhiều nước hơn. Màu sắc của quả không đồng nhất hóa với
giống dâu, chẳng hạn Morus alba L. có thể cho quả màu trắng, xanh nhạt
hơi phai đỏ hoặc đen. Nhìn chung Morus alba L. thường cho quả ngọt
nhưng lại thiếu vị chua cần thiết. Morus rubra L. cho quả màu đỏ thẫm
gần như đen, dòng vô tính của loài này có thể cho quả có hương vị ngang
bằng với giống Morus nigra L., giống này cho quả lớn nhiều nước với sự
kết hợp hài hòa giữa vị ngọt và chua làm cho chúng có hương vị thơm
ngon nhất trong tất cả các loài dâu tằm.
2.1.1.3 Thành phần hóa học
Thành phần của quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, điều kiện
trồng trọt, thời tiết…dưới đây là thành phần trung bình của giống Morus alba
L. trong điều kiện trồng trọt bình thường:

13


Chương 2: Tổng quan tài liệu

1,4%

Fe

1,9mg

Ngoài ra trong quả dâu còn chứa một lượng vitamin tương đối lớn,
với thành phần như trong bảng 2.5
Bảng 2. 5 Thành phần vitamin trong quả dâu [3].

Vitamin

Hàm lượng

Vitamin

Hàm lượng

Vitamin A
Thiamine

174IU

Nicotinic acid
Ascorbic acid

0,8mg
13mg

Riboflavin

Trên thế giới việc sản xuất rượu vang đã có rất lâu đời nhưng mãi đến
đầu thế kỉ 19, ngành sản xuất rượu vang mới được phát triển mạnh và chuyển
sang sản xuất với quy mô công nghiệp. Ngày nay ngành sản xuất rượu vang
đã phát triển mạnh mẽ ở các nước trên thế giới như: Pháp là nước nổi tiếng
nhất về sản xuất rượu vang, kế đó là các nước Ý, Tây Ban Nha, Algeria,
Rumani, Argentina, Nga, Hungari, Hoa Kì, Đức,… và một số nước khác.
Phân loại rượu vang
 Phân loại theo độ ngọt: Rượu vang khô (dry wine), Rượu vang bán
ngọt (semi-dry wine), Rượu vang ngọt (sweet wine)
 Phân loại theo quá trình lên men:Rượu vang tự nhiên (Natural wine),
Rượu vang cao độ (Fortified wine)
 Phân loại theo lượng CO2:
- Rượu vang không có gas (table wine).
- Rượu vang có gas (sparkling wine): 2 loại
+ Rượu vang có gas tự nhiên: Champagne.
+ Rượu vang có gas nhân tạo: Carbonated wine
 Phân loại theo màu
- Rượu vang trắng (White wine): Chablis, Chardonnay, Pinot Blanc,
Rhine wine, Riesling.
- Rượu vang hồng (Rose wine): Rose, Vonorosso.
- Rượu vang đỏ (Red wine): Barbera, Cabernet Sauvignon, Claret,
Carnelian, Gamay, George.
 Phân loại theo nơi sản xuất
- Phân loại theo quốc gia:Rượu vang Pháp, Rượu vang Úc, Rượu vang
Tây Ban Nha. . .
- Phân loại theo vùng: Bordeaux, Burgandy, California, Chablis. . .
2.2.2.2 Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Trong sản xuất rượu vang, nho là một nguyên liệu truyền thống, rất
được ưa thích và có giá trị dinh dưỡng cao. Nho được trồng nhiều ở các nước
Châu Âu nhất là ở Pháp và ở Mỹ. Ở nước ta nho cũng đã được trồng ở một