BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CÂY NHỤC TỬ GẦN
(Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CÂY NHỤC TỬ GẦN
(Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH : DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN
Hoàng Xuân Huyền Trang
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ ............................................. 3
1.1.1. Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae) .......................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Sarcosperma Hook.f................. 5
1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Sarcosperma affinis Gagnep. .. 7
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................................... 8
1.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC .................................................................... 13
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................. 16
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................. 16
2.1.2. Các chủng vi sinh vật thử nghiệm ................................................. 16
2.1.3. Thuốc thử, dung môi, hóa chất ...................................................... 17
2.1.4. Máy móc - thiết bị ......................................................................... 17
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 18
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật.................................................................. 18
2.2.2. Nghiên cứu về hóa học .................................................................. 19
2.2.3. Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn ........................................... 21
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 24
3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ..................................................................... 24
3.1.1. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 24
3.1.2. Đặc điểm vi học ............................................................................. 25
3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................................. 32
3.2.1. Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có trong cây ....................... 32
3.2.2. Quá trình chiết xuất ....................................................................... 33
TIẾNG VIỆT
Carbon nuclear magnetic resonance Phổ cộng hƣởng từ carbon
13
1
H-NMR
Proton nuclear magnetic resonance
Phổ cộng hƣởng từ proton
1
A549
Human
C
H
adenocarcinoma Tế bào ung thƣ biểu mô phế
lung
epithelial cell
nang ngƣời
protein Z
nhiệt độ
Promyelocytic cell
Tế bào bạch cầu tiền tủy
bào
HMBC
Heteronuclear
bond Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
multiple
correlation
2 chiều HMBC
HONE-1
Ppithelial tumor cell
Tế bào khối u biểu mô
HR-EI-MS
High-resolution
Interleukin
KB
Oral cancer cell
Tế bào ung thƣ vòm họng
LPS
Lipopolysaccharide
Lipopolysaccharide
MCF7
Human breast adenocarcinoma cell Tế bào ung thƣ vú ngƣời
line
MIC
Minimum inhibitory concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu
NMR
Nuclear magnetic resonance
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ của SAC9 và hợp chất tham khảo ............................. 43
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ của SAC18 và hợp chất tham khảo ........................... 46
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ của SAC22 và hợp chất tham khảo ........................... 48
Bảng 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết toàn phần và các phân đoạn
đối với Staphylococcus aureus........................................................................ 49
Bảng 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết toàn phần và các phân đoạn
đối với Escherichia coli .................................................................................. 50
Bảng 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết toàn phần và các phân đoạn
đối với Pseudomonas aeruginosa ................................................................... 50
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Staphylococcus aureus .................................................................................... 52
Bảng 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Bacillus subtilis ............................................................................................... 52
Bảng 3.11. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Escherichia coli ............................................................................................... 53
Bảng 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh khiết trên chủng
Pseudomonas aeruginosa................................................................................ 53
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc một số triterpen thƣờng gặp ở họ Sapotaceae .................. 11
Hình 1.2. Cấu trúc một số flavonoid thƣờng gặp ở họ Sapotaceae ................ 13
Hình 2.1. Ảnh cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae)
......................................................................................................................... 16
Hình 2.2. Phân bố các mẫu thử trên đĩa thạch dinh dƣỡng ............................. 23
Hình 3.1. Ảnh cây Nhục tử gần....................................................................... 24
Hình 3.2. Ảnh một số đặc điểm hình thái cây Nhục tử gần ............................ 25
Hình 3.3. Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 10) ....................... 26
Hình 3.4. Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát ở vật kính 40) ....................... 27
Vì vậy, nghiên cứu phát triển kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên vẫn là một
hƣớng đi đầy hứa hẹn.
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên có
nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở
nƣớc ta hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao, khoảng 800 loài rêu,
600 loài nấm và hơn 2.000 loài tảo [9]. Trong đó, Thừa Thiên Huế thuộc khu
vực thực vật nhiệt đới vùng đệm có sự giao lƣu giữa hệ thực vật phía Bắc và
hệ thực vật phía Nam, đa dạng về thành phần, chủng loại và hệ sinh thái.
Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae) là một loài đặc hữu
của Việt Nam đã đƣợc tìm thấy ở Vƣờn Quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế
[7]. Kết quả sàng lọc ban đầu của nhóm nghiên cứu cho thấy loài này có hoạt
tính kháng khuẩn mạnh, tuy nhiên cho đến nay vẫn chƣa có công bố nào về
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam cũng nhƣ
trên thế giới. Nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn, chuẩn hóa nguyên liệu
1
cũng nhƣ làm sáng tỏ thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây
Nhục từ gần, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng
khuẩn của cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep. - Sapotaceae)”
đƣợc tiến hành với các mục tiêu:
1. Mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của cây.
2. Chiết xuất, phân lập 4-5 chất tinh khiết trong cây và xác định cấu trúc hóa
học các chất đã phân lập được.
3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết toàn phần, dịch chiết các
phân đoạn và các chất tinh khiết phân lập được từ cây.
2
hạch. Hạt có nội nhũ hoặc không. Nội nhũ chứa dầu. Phôi phân biệt rõ, có 2 lá
mầm (lớn, mỏng, phẳng). Phôi không chứa diệp lục [42].
Họ Sapotaceae gồm 53 chi với 1200 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt
đới ẩm và cận nhiệt đới, một vài chi có thể tìm thấy ở vùng bán khô hạn và
khô hạn. Ở Việt Nam có 16 chi, trên 40 loài. Đây là một trong những họ phổ
biến nhất của vùng rừng thấp, phân bố từ những vùng gần biển lên độ cao
4000 m [46]. Các chi thuộc họ Sapotaceae ở Việt Nam gồm có: Aesandra,
Bumelia, Chrysophyllum, Donella, Eberhardtia, Madhuca, Manilkara,
Mastichodendron, Mimusops, Palaquium, Payena, Planchonella, Pouteria,
Sarcosperma, Sinosideroxylon, Xantolis [5].
Khóa phân loại các chi trong họ Sapotaceae [5]
1a - Đài do 2 luân sinh 3−4 lá đài
2a - Cánh hoa có phụ bộ ở lƣng, tiểu nhụy bằng số cánh hoa, có tiểu
nhụy lép
3a - Lá đài 6, cánh hoa 6, sẹo hạt dẹp, dài ...................... Manikara
3b - Lá đài 8, cánh hoa 8, sẹo hạt tròn ............................ Mimusops
2b - Cánh hoa không có phụ bộ, tiểu nhụy bằng 2−3 số cánh hoa,
không có tiểu nhụy lép
3a - Lá đài 6, tiểu nhụy 12, noãn sào 6 buồng ............. Palaquirum
3b - Lá đài 4
4a - cánh hoa 12, tiểu nhụy 24, noãn sào 12 buồng ...............
............................................................................. Aesandra
4b - cánh hoa 5−18, noãn sào (6) 8 (10) buồng
5a - Có phôi nhũ, tiểu nhụy 16 .......................... Payena
5b - Phôi nhũ vắng hay gần nhƣ vắng ............. Madhuca
1b - Đài do 1 luân sinh lá đài, hoa 5 phân
2a - cánh hoa có phụ bộ ở lƣng, có tiểu nhụy lép
3a - quả không tự khai, sẹo hạt tròn ở đáy......................... Bumelia
4
Kết luận này càng đƣợc củng cố khi tác giả thu hẹp phạm vi nghiên cứu, chỉ
phân tích những dữ liệu gen của các loài trong họ Sapotaceae. Do đó, hiện
nay chi Sarcosperma đƣợc thống nhất xếp vào họ Sapotaceae [10].
Theo hệ thống phân loại của Pennington [41], Takhtajan [50], chi
Sarcosperma có vị trí phân loại nhƣ sau:
Giới Thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ Đỗ quyên (Ericales)
Họ Hồng Xiêm (Sapotaceae)
Tông Sideroxyleae
Chi Sarcosperma
1.1.2.2. Đặc điểm thực vật chi Sarcosperma Hook.f.
Cây gỗ hay cây bụi. Lá kèm nhỏ rụng sớm và để lại vết sẹo trên cuống
lá, phiến lá thon. Lá mọc đối hay mọc cách, hiếm khi mọc xoắn ốc, có lỗ tiết
gần gân bên. Gân bên nhỏ dần và biến mất khi gần tới mép lá. Cuống lá
thƣờng có cặp lá kèm. Cụm hoa chùm hay chùy mọc ra từ nách lá. Lá bắc
nhỏ, hình tam giác. Hoa lƣỡng tính, đài hoa 5, tròn, xếp chồng lên nhau.
Tràng hoa rộng hình chuông. Cánh hoa 5, nhị 5 nằm trong ống tràng, đối diện
với cánh hoa và có 5 nhị lép xen kẽ. Bộ nhụy gồm 2−3 lá noãn. Quả hạch, có
1 hoặc 2 hạt, vỏ quả rất mỏng. Hạt hình elip hoặc hình trứng, không dẹp hai
bên, không có nội nhũ [46].
1.1.2.3. Phân bố chi Sarcosperma Hook.f.
Chi Sarcosperma gồm khoảng 11 loài, phân bố ở Ấn Độ, Indonesia,
Malaysia, Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc và Philipin. Chi này xuất hiện rải
rác ở những dạng rừng khác nhau từ mặt nƣớc biển lên đến độ cao 1300 m. Ở
Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ [5] có 5 loài thuộc chi Sarcosperma.
- Sarcosperma affinis Gagnep. - Nhục tử gần, Sến nạc nhỏ.
ngách gân trên. Cuống 1,5−2,5 cm, không lá bẹ. Hoa nhỏ, mọc thành chùm ở
7
nách lá, dài 5 cm, không lông. Lá dài 1,6 cm, vành cao 2,5 mm. Tiểu nhụy
không chỉ, tiểu nhụy lép 5, nhọn. Noãn không lông, 2−3 buồng 1 noãn [5].
Loài Sarcosperma affinis phân bố ở các tỉnh miền Trung Việt Nam nhƣ
Quảng Nam, Thừa Thiên Huế. Theo tài liệu của tác giả Phan Kế Lộc
Sarcosperma affinis là loài đặc hữu của tiểu vùng địa lý thực vật Trung
Trƣờng Sơn - Việt Nam [7].
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Họ Sapotaceae trên thế giới có khoảng 1200 loài, ở Việt Nam có hơn
40 loài. Tuy nhiên các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc
họ này vẫn còn rất hạn chế, mới chỉ tập trung vào một số loài nhƣ
Chrysophyllum cainito, Manilkara zapota, Madhuca lonigfolia, các loài
trong chi Pouteria v.v.. Hiện nay, vẫn chƣa có công bố nào về thành phần
hóa học của các loài thuộc chi Sarcosperma. Thông thƣờng, những loài có
mối quan hệ tiến hóa với nhau thƣờng có một số nét tƣơng đồng về thành
phần hóa học.
Triterpen và flavonoid là hai nhóm hợp chất đƣợc phân lập nhiều nhất
từ họ Sapotaceae. Đây cũng là hai nhóm hợp chất đƣợc tập trung nghiên
cứu về hoạt tính sinh học sau khi phân lập. Các triterpen tồn tại ở dạng
aglycon hoặc glycosid, trong đó phần aglycon chủ yếu thuộc về khung lupan,
olean và ursan. Một số triterpen phân lập từ các loài thuộc họ Sapotaceae
đƣợc trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số triterpen phổ biến trong họ Sapotaceae
Khung cấu trúc
Olean
Khung cấu trúc
Tên chất
Loài
Mimusops manilkara
TLTK
[34]
Pouteria caimito
Pouteria gardnerii
Pouteria tomentosa
[15]
Pouteria torta
Taraxerol (3)
Mimusops elengi
[22]
Mimusops manilkara
[35]
Pouteria caimito
Mimusops manilkara
[34]
Pouteria gardnerii
[15]
Argania spinosa
[13]
Chrysophyllum boivinianum
[31]
Chrysophyllum cainito
[49]
Pouteria caimito
Pouteria gardnerii
[15]
Pouteria torta
Lupan
Acid betulinic (7)
Tên chất
Loài
TLTK
Pouteria torta
Acid ursolic (8)
Ursan
Chrysophyllum cainito
[49]
Mimusops elengi
[43]
Mimusops hexandra
[21]
Mimusops manilkara
[21]
Palaquium canaliculatum
[21]
Pouteria venosa
[15]
Argania spinosa
[13]
Madhuca fulva
[21]
Madhuca neriifolia
[21]
Mimusops elengi
[22]
Mimusops manilkara
[34]
Palaquium canaliculatum
[21]
Pouteria caimito
Pouteria venosa
Loài
TLTK
Pouteria caimito
[15]
Khung olean
R
H
H
H
R1
Me
H
H
R2
H
Me
Me
R3
Me
α-Amyrin (1)
Me
β-Amyrin (2)
β – Sitosterol (11)
Spinasterol (10)
Hình 1.1. Cấu trúc một số triterpen thƣờng gặp ở họ Sapotaceae
11
Flavonoid cũng là một nhóm chất phổ biến trong họ Sapotaceae. Nó có
mặt trong hầu hết các loài thuộc họ Sapotaceae đã đƣợc nghiên cứu. Bảng 1.2.
thống kê một số flavonoid đã phân lập đƣợc từ các loài thuộc họ Sapotaceae
Bảng 1.2. Một số flavonoid đƣợc phân lập từ họ Sapotaceae
Khung cấu trúc
Tên chất
Loài
Chrysophyllum cainito
Gallocatechin (12)
TLTK
[53]
Pouteria campechiana
Pouteria sapota
[15]
[38]
Argania spinosa
[13]
Manilkara zapota
[52]
Pouteria campechiana
[14]
Pouteria sapota
Pouteria torta
Flavonol
[15]
Pouteria viridis
Quercitrin (17)
Chrysophyllum cainito
[53]
Isoquercitrin (18)
Madhuca lonigfolia
[45]
Mimusops elengi
[19]
Pouteria campechiana
[14]
Argania spinosa
[13]
Khung flaval-3-ol
R
OH
H
H
R1
β - OH
β - OH
α - OH
TLTK
Quercitol (19)
Quercetin (20)
Rutin (21)
Hình 1.2. Cấu trúc một số flavonoid thƣờng gặp ở họ Sapotaceae
Ngoài ra, ngƣời ta đã phân lập đƣợc một số ít các alkaloid thuộc nhóm
hydroxymethylpyrrolizidine từ các loài thuộc chi Planchonella nhƣ benzoyl
laburnine (Planchonella thyrsoidea, P. anteridifera), isoretronecanol (P.
equestris), isoretronecyl tiglate (Planchonella sp.) [47].
1.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC
Các loài trong họ Sapotaceae có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị nhƣ
hạ đƣờng huyết, chống ung thƣ, tăng cƣờng miễn dịch, giảm đau, hạ sốt. Đặc
biệt trong những năm gần đây, hoạt tính kháng khuẩn của các loài trong họ
Sapotaceae rất đƣợc chú ý. Nhiều nghiên cứu sàng lọc đã đƣợc tiến hành và
kết quả cho thấy rất nhiều loài trong họ này có hoạt tính kháng khuẩn mạnh
[40]. Các nghiên cứu cho thấy Madhuca indica có hoạt tính kháng khuẩn đối
13
với các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa với đƣờng kính vòng vô khuẩn ở nồng độ 50
mg/mL tƣơng ứng là 9, 7, 10 mm [24]. Manilkara zapota có hoạt tính đối với
các chủng Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
với đƣờng kính vòng vô khuẩn tƣơng ứng là 29,0, 28,5, 28,0 mm [44]. Dịch
chiết methanol của Vitellaria paradoxa có hoạt tính ức chế các dòng vi khuẩn
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E.coli ở nồng độ ức chế tối
thiểu (70 mg/mL) tƣơng ứng là 16, 15, 15 mm [36].
Bảng 1.3. Một số loài có hoạt tính kháng khuẩn thuộc họ Sapotaceae [25]
STT
sanguinolentuni
4
Eccliiiusa guianensis
15
Pouteria cayemensis
5
Madhuca indica
16
Pouteria deliciosa
6
Madhuca lonigfolia
17
Pouteria guianensis
7
Manilkara bidentata
22
Tridesmostemon
omphalocarpoides
Vitellaria paradoxa
Đối với chi Sarcosperma mới chỉ có duy nhất loài Nhục tử Cachin
(Sarcosperma kachinense Exell.) đƣợc nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn.
Theo báo cáo của Yang và cộng sự (2012), dịch chiết ethanol của loài Nhục
14
tử Cachin thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với Staphylococcus
aureus kháng methiciline [16].
Sarcosperma affinis Gagnep. là một loài đặc hữu của Việt Nam. Cho đến
nay vẫn chƣa có công bố nào về hoạt tính sinh học của loài này. Nhóm nghiên
cứu đã tiến hành sàng lọc hoạt tính của dịch chiết loài này tại Viện Nghiên
cứu Thuốc Tự nhiên, Trƣờng Đại học Toyama - Nhật Bản. Tại đây đang tập
trung nghiên cứu, tìm kiếm các loại kháng sinh có nguồn gốc thực vật có đích
tác dụng là FtsZ. FtsZ là một protein cần thiết cho sự tồn tại và phân chia của
tế bào vi khuẩn. Nó có mặt ở hầu hết các loài vi khuẩn nhƣng không có ở tế
bào nhân thực. Do đó, các kháng sinh có đích tác dụng là FtsZ sẽ có tác dụng
chọn lọc, ít độc tính và an toàn hơn với cơ thể ngƣời. Cụ thể, các kháng sinh
sẽ liên kết với FtsZ làm tăng hoạt động của GTPase, ức chế sự lắp ráp FtsZ
dẫn đến ức chế sự phân chia tế bào vi khuẩn [17]. Kết quả nghiên cứu từ 207
dịch chiết dƣợc liệu đƣợc thu mẫu tại miền Trung Việt Nam cho thấy dịch
chiết Nhục tử gần có tác dụng tốt nhất, làm ức chế khả năng lắp ráp của
protein FtsZ lên đến 88,36 ± 6,5%. Đây là một bằng chứng cho thấy Nhục tử
gần có có thể chứa một số hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Vì vậy,
Copyright: Tài liệu đại học ©