BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN
TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN
TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………...
Chương 1. TỔNG QUAN…………………………………………..
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo……………………………...
1.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo……………………………
1.1.2. Phân loại đông trùng hạ thảo………………………………...
1.1.3. Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo………………
1.1.4. Tác dụng của đông trùng hạ thảo…………………………….
1.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo…………………..
1.2. Tổng quan về adenosin,
cordycepin……………………………
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học…………………
1.2.2. Dược động học cordycepin và adenosin…………………….
1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosin…………………………
1.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin……………….
1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng………………………………
1.3.2. Phương pháp đo màu………………………………………..
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản……………………………..
1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR…………...
1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng…………………………………….
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………….
1.4.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng……………………………
1.4.2. Một số thông số đặc trưng…………………………………...
1.4.3. Ứng dụng…………………………………………………….
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….
2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………….
2.2. Hóa chất, dung môi…………………………………………….

20
20
21
21
22
21
23
24
26


2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………..
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………….
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký…………………………
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn…………………………………...
3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện……………………..
3.1.3. Khảo sát lựa chọn pha động…………………………………
3.1.4. Khảo sát thể tích tiêm mẫu………………………………….
3.1.5. Khảo sát nhiệt độ cột………………………………………..
3.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu…………………….
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết...…………………………………..
3.2.2. Khảo sát số lần chiết……..………………………………….
3.2.3. Khảo sát phương pháp chiết…………………………………
3.2.4. Khảo sát nhiệt độ chiết………………………………………
3.2.5. Khảo sát thời gian chiết……………………………………..
3.3. Quy trình phân tích……………………………………………
3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử…………………
3.3.2. Điều kiện sắc ký……………………………………………..
3.3.3. Đánh giá kết quả……………………………………………..
3.4. Đánh giá phương pháp…………………………………………

38
39
39
40
41
41
41
42
47
48
51
53
54
54
56
58
64


Từ viết tắt
ACN
AOAC
CE
DD
DMSO
ĐTHT
EtOH
HL
HPLC
MeOH

Methanol
Mass spectrometry
Photo diode array
Parts per million
Relative standard deviation
Standard deviation

Thin layer chromatography
Ultraviolet
Visible

Hàm lượng
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
Khối phổ
Dãy diod quang
Phần triệu
Hệ số tương quan
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Trung bình
Thực phẩm chức năng
Sắc ký lớp mỏng
Tài liệu tham khảo
Tử ngoại
Khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

35

Bảng 3.9. Kết quả độ thích hợp của hệ thống ……………………………...

42

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin,
cordycepin và diện tích pic………………………………………………….

47

Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu R1…………...

49

Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu L1……..

49

Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác trung gian ……...………………………..

50

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu R1……………………………...

52

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu thử L1………………………….

52


10

Hình 1.5. Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron
của cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15]……..............

12

Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao…………...

18

Hình 3.7. Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b)………

28

Hình 3.8. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm 5 µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40
µl (d)…………………………………………………………………….

31

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) và mẫu thử (c) ở điều kiện
nhiệt độ cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) và mẫu thử (d) ở điều kiện
nhiệt độ cột 25oC………………………………………………………...

32

Hình 3.10. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3)…..

34


44

Hình 3.19. So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ
cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D)…………………………….

46


Hình 3.20. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ
1- 40 µg/ml (pic adenosine tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2
phút)…………..........................................................................................

47

Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện
tích pic (mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin b)……………………....

48

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu placebo 1 thêm chuẩn (0,25 µg/ml mỗi chất)

54

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)……………………………….

55

Hình 3.24: So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và
mẫu chuẩn tương ứng…………………………………………………..

phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế


phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
với các mục tiêu sau:
- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng adenosin và cordycepin
trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo (dạng lỏng, dạng rắn) bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm chứa đông trùng
hạ thảo đang lưu hành trên thị trường.


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo:
1.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) là một loại đông dược quý có bản chất là
dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensis thuộc nhóm nấm
Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướm trong chi Thitarodes
trước đây phân loại trong chi Hepialus.
Tên gọi “đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung dongchungxiacao) xuất phát từ
quan sát thực tế khi thấy vào mùa hè nấm Ophiocordyceps sinensis mọc chồi
từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất. Vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này
giống con sâu (côn trùng), đến mùa hè thì chúng giống như một loài thực vật.
Dược liệu đông trùng hạ thảo thu hái gồm phần sâu non dài 2,5 – 3 cm, đường
kính 3 – 5 mm màu vàng nâu hay xám nâu. Sâu có 8 đôi chân, 4 đôi chân ở
giữa thân sâu là trông rõ nhất. Thân nấm hình trụ mọc ra từ đầu con sâu, thân
nấm thường dài 3 – 6 cm. Khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất, nó tiêu thụ
đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu biến sâu thành xác khô. Nấm quả thể
thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh. Cơ chế nhiễm nấm C. sinensis
vào sâu hiện nay chưa biết rõ. Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm do ăn

như didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt
chất này không thể tìm thấy ở trong các dược liệu khác trong tự nhiên.
b.

Các polysaccharid
Đây cũng là thành phần chính góp phần vào các tác dụng sinh học của

đông trùng hạ thảo. Bản đồ saccharid của dược liệu này có vai trò trong đánh
giá chất lượng. Một số monosaccharid có trong đông trùng hạ thảo như
rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose…
c.

Các sterol
Các phytosterol trong đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β

sitosterol) đóng vai trò quan trọng trong điều trị ung thư vú, tuyến tiền liệt và
ung thư trực tràng.
d.

Các nhóm hoạt chất khác


Đông trùng hạ thảo có chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic,
acid aspartic, arginin… và các hợp chất kiểu polyamin như cadaverin,
spermidin, spermin…, các cyclodipeptid như cordycedipeptid A. Các hợp chất
này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus [25], [37].

Cordycepin

Guanosin

IgG, IgM trong huyết thanh.
c. Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết cao đông trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự như
quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase.
d. Tác dụng chống ung thư
Thành phần polysaccharides trong nấm đông trùng hạ thảo (cordyglucan (1 3)β – glucan) cũng như vài loài nấm khác được cho là có tác dụng ức chế khối u
do hai cơ chế: (1) trực tiếp gây độc cho tế bào ung thư; (2) gián tiếp ức chế
thông qua hệ miễn dịch tự miễn của cơ thể [9].
e. Tác dụng chống viêm
Đông trùng hạ thảo tác dụng ức chế việc sản sinh các tác nhân gây viêm như
gốc tự do NO, các cytokine TNF α và IL 12, ức chế sự mất hạt nhỏ và phát triển
của bạch cầu.


f. Tác dụng bảo vệ thận, phổi, gan
Đông trùng hạ thảo có công dụng nhanh trong việc phục hồi và làm giảm các
triệu chứng viêm thận mãn, suy thận, liệt dương, di tinh, mệt mỏi, đau lưng,
các vấn đề của đường hô hấp: ho, đờm, suyễn, viêm/ hen phế quản, lao
phổi…Tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm tăng hoạt tính của các men
AST, ALT, γ GTP, ALP, LDH [7], [23], [25], [37].
1.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo
Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng hạ
thảo được bán trên thị trường. Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm
một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân
sâm, tam thất, tổ yến. Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang,
viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng). Có thể kể tên một vài
chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau:
- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken,
bột Cordyceps extract…
- Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ

Dung môi
Nước
Methanol
Ethanol
1 – propanol
2 – propanol
1- butanol
Ethylen glycol
Phổ hấp thụ UV:

Độ tan (mg/ml)
5
6
13
20
13
9
8

Trong dung dịch nước, HCl 0,1N, NaOH 0,1N adenosin có phổ hấp thụ UV
tương tự nhau, bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm với ε = 15185 [8].
1.2.2. Dược động học cordycepin và adenosin
Cordycepin là chất cấu tạo tương tự adenosin nên có con đường chuyển
hóa tương tự. Khi nghiên cứu dùng adenosin cho động vật có vú, ở bên ngoài
tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase
trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vào
trong tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi adenosin kinase tạo thành ATP.
Nếu tế bào không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm amin bởi
adenosin deaminase trong tế bào. Dạng hypoxanthinosin không hoạt tính được
tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận. Tương tự như vậy, cordycepin

insulin trong máu nhưng làm giảm hàm lượng glucose máu thông qua tác dụng
làm tăng nồng độ glycogen tại gan. Đồng thời cordycepin có tác dụng bảo vệ
thận và giảm chấn thương lách do tiểu đường [22].
b. Tác dụng của adenosin
* Tác dụng chống viêm
Adenosin được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ
thể của adenosin A2A. Nồng độ adenosin ngoại bào ở tế bào bình thường khoảng
300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn thương nồng độ này nhanh chóng nâng lên
600 – 1200 nM.
* Tác dụng trên tim
Adenosin trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch
vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền
nút nhĩ thất. Adenosin được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim.
* Tác dụng trên phổi, thần kinh trung ương
Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến
bệnh viêm đường hô hấp như bạch cầu, tế bào lympho… Ngoài ra adenosin có
tác dụng tốt đối với một số bệnh rối loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ, thoái
hóa thần kinh…[11], [27].
1.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin
1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
MA King Wah và các cộng sự đã tiến hành xác định cordycepin và 7
nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient. Dịch chiết nước của 11 sản phẩm chứa đông


trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 được xử lý bằng
hỗn hợp Na2HPO4 0,05M : carboxymethyl cellulose (4 : 1) sau đó đặt vào tủ
sấy 8 phút ở 60oC để hoạt hóa. Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform:
ethylacetat : isopropanol : nước (8 : 2 : 6 : 0,6 theo thể tích) với 2 giọt amoniac
cho mỗi 10 ml hỗn hợp. Quãng đường triển khai dung môi 18 cm, chạy lượt hai

giữa 2 phương pháp này [18].
1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng
Bảng 1.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin.
Cột
Pha động
C18 (250 x Đệm phosphat pH 6,5 :
4,6 mm)
methanol (17 :3)
C18 (250 x Methanol (A) và Nước (B)
4,6 mm)
0 – 2 phút: 100 – 85% B; 2
– 5 phút: 85 – 70% B; 5 –
10 phút: 70 – 55% B; 10 –
12 phút: 55 – 85% B; 12 –
15 phút: 85 – 100% B
Eclipse
A: dung dịch NaH2PO4
XDB-C18 0,02M và Na2HPO4 0,02 M
(250 x 4,6 B: methanol
mm, 5 µm) 0 – 5 phút: 0% A
5 – 15 phút: 0 – 5% A
15 – 40 phút: 5 – 40% A
40 – 50 phút: 40% A
Shimadzu
A: dung dịch amoni acetat
VP-ODS
0,04M pH 5,2
B: methanol

Tốc độ dòng Detector TLTK

ProtoSIL
Methanol : H2O (20 : 80)
1,0 ml/phút UV 254
250 x 4,6
nm
mm, 5 µm
Waters
Methanol : H2O (8 : 92)
1,0 ml/phút UV 254
Sheild RP
nm
18 (150 x
4,6 mm, 5
µm)
Eclipse
A: nước có 0,1% acid 0,8 ml/phút UV 260
XDB-C18 acetic
nm
(150 x 4,6 B: acetonitril có 0,1% acid
mm, 5 µm) acetic
0 – 2,5 phút: 2% B
2,5 – 12,5 phút: 2 – 12% B
2,5 – 14 phút: 12 – 96% B.
C18 (150 x Methanol : H2O (30 : 70)
0,5 ml/phút UV 260
4,6 mm, 5
nm
µm)
Zorbax
A: H2O

Jian – Ping Yuan và cộng sự đã tiến hành định lượng 7 nucleosid và 7
nucleobase trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng detector PAD.


Phương pháp sử dụng pha động gradient với hai thành phần A (methanol) và B
(đệm phosphat: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat
0,02M). Đường chuẩn xây dựng 5 – 300 μg/ml. Giới hạn phát hiện và giới hạn
định lượng của cordycepin và adenosin là 0,01 μg/ml và 0,03 μg/ml. Độ thu hồi
của phương pháp đối với cordycepin là 98,3%, với adenosin là 100,6% [36].
Jian – Wei Xie và cộng sự đã tiến hành định lượng các nucleosid chính trong
Cordyceps sinensis (thymin, adenine, adenosin, cordycepin) bằng phương pháp
sắc ký lỏng khối phổ LC/ESI – MS. Phương pháp sử dụng pha động A (amoni
acetat 0,04M pH 5,2) và B (methanol). Đường chuẩn cordycepin xây dựng từ
0,5 – 107,5 μg/ml, adenosin 0,6 – 114,0 μg/ml . Độ thu hồi của cordycepin 99,3
– 104,0%, độ thu hồi adenosin 98,0 – 101,5% [34].
Lei Huang và đồng nghiệp đã nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện phân tích
adenosin và cordycepin trong dược liệu ĐTHT loài C. sinensis và C. militaris.
Phương pháp cho kết quả pha động tối ưu methanol và nước tỷ lệ 92 : 8, bước
sóng phát hiện 254 nm. Đường chuẩn của cordycepin được xây dựng từ 2,85
đến 130 μg/ml, của adenosin từ 2,50 – 120 μg/ml, giới hạn phát hiện cordycepin
là 0,25 μg/ml, của adenosin là 0,30 μg/ml [12].
Jiang – Feng Song cùng đồng nghiệp đã nghiên cứu tối ưu cách chiết xuất
cordycepin từ loài Cordyceps militaris bằng phần mềm tối ưu hóa, phân tích
bằng phương pháp sắc ký lỏng. Pha động sử dụng A (nước có 0,1% acid acetic)
và B (acetonitril có 0,1% acid acetic) theo tỷ lệ gradient. Kết quả tối ưu hóa
chiết xuất cho điều kiện chiết: dung môi chiết ethanol 20,21%, thời gian chiết
101,88 phút, tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu: 33,13 ml/g [26].
Li Yu và đồng nghiệp đã nghiên cứu định lượng đồng thời 11 nucleosid
trong dược liệu ĐTHT được thu hái tại Trung Quốc. Pha động sử dụng dung
môi methanol và nước theo chương trình gradient. Mẫu dược liệu được chiết

Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl
và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril, pha động là
dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật
RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau,
thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh tế. Cột thông dụng là cột
ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10m. Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm
dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào