BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
KHẢ NĂNG TÁI SINH Ở LÚA IR64 VÀ
MTL250 (Oryza sativa L.)
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. TRẦN THỊ XUÂN MAI
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Năm 2009
SINH VIÊN THỰC HIỆN
ĐỖ HOÀNG ĐĂNG KHOA
MSSV: 3052836
LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC
K31
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ
Nhiệm Khoa Khoa Học, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này.
2. Giống MTL250 .............................................................................................. 4
a) Đặc điểm nông học và năng suất ........................................................... 5
b) Phẩm chất và phản ứng đối với sâu bệnh ............................................. 5
II. NUÔI CẤY MÔ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH NUÔI CẤY MÔ....................................................................................... 5
1. Nuôi cấy mô .................................................................................................. 5
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô....................................... 6
a) Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy mô................................................... 6
b) Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 9
c) Điều kiện ủ và chiếu sáng..................................................................... 16
III. NUÔI CẤY MÔ LÚA................................................................................... 17
1. Vật liệu nuôi cấy.......................................................................................... 17
2. Sự phát triển của phôi lúa .......................................................................... 18
3. Các loại môi trường nuôi cấy mô lúa ......................................................... 18
a) Môi trường tạo mô sẹo ......................................................................... 18
b) Môi trường tái sinh chồi ...................................................................... 19
4. Điều kiện ủ và chiếu sáng trong nuôi cấy mô ............................................ 19
PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 21
I. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .................................................................... 21
1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................................. 21
a) Nguyên liệu ........................................................................................... 21
b) Hóa chất ............................................................................................... 21
2. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................... 21
a) Thiết bị ................................................................................................. 21
b) Dụng cụ ................................................................................................ 21
II. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ................................................... 21
1.Thời gian ...................................................................................................... 21
2.Địa điểm ....................................................................................................... 21
III. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đường maltose lên sự phát triển của
mô sẹo ................................................................................................................... 29
IV. Thí Nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường cấy chuyền đến khả năng
tái sinh của mô sẹo ............................................................................................... 30
V. Tạo chồi và tạo rễ ............................................................................................ 32
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 33
I. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 33
II.ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 34
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 37
DANH SÁCH HÌNH
Tiêu đề
Trang
Hình 1: Cấu trúc hình cầu ........................................................................................ 25
Hình 2: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống IR64.................. 26
Hình 3: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống MTL250 ........... 26
Hình 4: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng ở giống IR64 ....................... 27
Hình 5: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống MTL250 ........... 28
Hình 6: Hiện tượng tiết phenol ở môi trường CIM-J3 trong điều kiện có
ánh sáng ..................................................................................................................... 31
Hình 7: Mô có chất lượng tốt ở giai đoạn cấy chuyền.............................................. 32
Hình 8: Mô sẹo tạo chồi ............................................................................................. 32
Hình 9: Tạo rễ............................................................................................................ 32
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Tỷ lệ mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở hai giống IR64 và MTL250
α-napthaleneacetic acid
Luận văn tốt nghiệp
Công nghệ Sinh học K31
TÓM LƯỢC
Hai giống lúa MTL250 và IR64 đã được sử dụng trong nghiên cứu này để theo
dõi các điều kiện nuôi cấy và sự kết hợp các thành phần trong môi trường nuôi
cấy ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của dòng lúa indica. Giống MTL250 có tỷ
lệ hình thành mô sẹo tốt ở cả hai điều kiện sáng liên tục và tối hoàn toàn, giống
IR64 có sự đáp ứng tốt trong điều kiện tối hoàn toàn. Nhiệt độ 320C thích hợp
cho quá trình hình thành mô sẹo và chất lượng mô cho cả hai giống lúa. Sự kết
hợp đường maltose ở nồng độ 3% vào môi trường kích thích mô sẹo có ảnh
hưởng tốt lên khả năng tạo mô sẹo và tỷ lệ mô có cấu trúc hình cầu, chặt và khô.
Trong giai đoạn cấy chuyền, mô sẹo 3 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường
CIM-J3 trong điều kiện tối cho kết quả tốt nhất cho quá trình nhân sinh khối và
biệt hóa của mô sẹo.
PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một quốc gia có nền nông nghiệp lâu đời và cây lúa là một
cây lương thực quan trọng có diện tích canh tác 4,13 triệu ha. Không chỉ ở Việt
Nam, lúa còn là nguồn thực phẩm chính của gần một nửa dân số thế giới
(Shimamoto, 1995). Cây lúa thuộc hai loài: Oryza sativa lúa trồng ở Châu Á và
Oryza glaberima lúa trồng ở Châu Phi. Hai dòng chính của Oryza sativa là
O.japonica và O.indica. Ở Việt Nam, đồng bằng sông Cửu Long được mệnh
danh là vựa lúa của Việt Nam có diện tích canh tác lúa chiếm 40% và sản lượng
lúa chiếm 50% so với cả nước (Nguyễn Thị Lang, 2000).
đến khả năng tái sinh ở hai giống lúa IR64 và MTL250 làm tiền đề cho các thí
nghiệm khác trên hai giống lúa trên.
2
PHẦN II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
I. SƠ LƯỢC VỀ HAI GIỐNG LÚA IR64 VÀ MTL250
1. Giống IR64
Giống lúa IR 64 có nguồn gốc từ Viện Lúa Quốc tế (IR18348-36-3-3) được
khảo nghiệm tại đồng bằng sông Cửu Long từ năm 1983 với tên gọi OM89,
được công nhận giống vào ngày 29 tháng 5 năm 1985 tại Hội Đồng Giống
quốc gia Philippines, với tên gọi IR64, được công nhận giống quốc gia tại
Việt Nam năm 1987. Giống IR 64 là một trong ba giống có tính thích nghi
rộng theo kết qủa chương trình INGER năm 1996 (trong đó có giống OM576
của Việt Nam). Đây là giống được lai tạo tại IRRI theo chiến lược đa dạng
nguồn gen kháng với các loại sâu bệnh hại và các stress không phải sinh học.
Trong quá trình phát triển tại ĐBSCL, nó còn có tên IR64B hoặc IR64NC
(nguyên chủng).
Có thể nói sau IR42, giống lúa IR64 có mức độ ổn định trong sản
xuất lâu dài nhất từ trước đến nay, với những ưu điểm năng suất cao, chống
chịu ổn định với sâu bệnh hại chính, nhất là giống cao sản có phẩm chất gạo
hàng đầu, giống hội đủ cả hai tiêu chuẩn hàm lượng amylose trung bình, và
độ trở hồ trung bình. IR64 hiện được chọn là một trong 5 giống phát triển
trong vùng lúa xuất khẩu 1 triệu ha của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn.
a) Đặc tính nông học
Giống lúa IR64 có thời gian sinh trưởng thuộc nhóm A2 (105-110 ngày).
Chiều cao cây 90-95 cm và độ dài bông 24-25cm. So với giống khác, IR64 có
số bông trên bụi trung bình (10.9 bông). Số hạt chắc trên bông 78.3 hạt. Tuy
thích hợp với điều kiện thâm canh. Với dạng hình rất đẹp, đẻ khỏe và gọn,
chịu được thâm canh cao và chúng có bộ lá thẳng đứng, đó là tiêu chuẩn một
giống cho năng suất cao. Giống này cũng được làm vật liệu lai trên các nước
trồng lúa. Mới đây người ta ly trích nhân của IR64 làm vật liệu trong
nghiên cứu di truyền phân tử.
Có thể nói giống này tương đối hoàn hảo so với các giống khác .Trên
đất phèn , mặn nhẹ chúng cũng chịu đựng khá tốt và cho năng suất rất ổn định.
2. Giống MTL250
MTL250 là giống lúa được nhập nội từ IRRI, do Đại Học Cần Thơ khảo
nghiệm. MTL250 được chọn là một trong 5 giống phát triển theo chương trình
1 triệu ha lúa xuất khẩu của Bộ NN và PTNT. Đây là giống lúa cao sản ngắn
ngày, có mùi thơm nhẹ, được đăng ký khảo nghiệm trong mạng lưới quốc gia
mấy năm gần đây.
4
a) Đặc điểm nông học và năng suất:
Thời gian sinh trưởng: 105-110 ngày
Chiều cao: 95-105cm.
Dài hạt gạo: 6,9 mm.
Dạng hạt thon dài. Năng suất trung bình 5-7 tấn / ha.
b) Phẩm chất hạt và phản ứng với sâu bệnh:
MTL250 chống chịu rầy nâu cấp 5 và bệnh đạo ôn cấp 4.
MTL250 có dạng hạt thon dài, tỉ lệ bạc bụng cấp 9 là 13,7%, amylose 25,8%,
hàm lượng protein 9,1%, tỉ lệ gạo nguyên 42,7%, tỉ lệ gạo xát trắng 60%, dài
hạt gạo 6,9 mm. Đặc biệt MTL250 có mùi thơm nhẹ sau khi nấu chín, nhưng
thuộc nhóm hơi cứng cơm.
II. NUÔI CẤY MÔ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY MÔ
dung ở nồng độ thấp. Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.
Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng nhiều đến sự
phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh
sáng thấp hơn so với phôi phát triển ngoài tự nhiên. Nuôi cấy phôi thường
được sử dụng để phá ngủ ở hạt, thử sức sống của hạt và để duy trì những phôi
yếu và cứu phôi lai xa (Nguyễn Đức Thành, 2000)
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô
a) Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy mô
*Vô trùng mẫu cấy
Mẫu dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan
hay bộ phận của cây: chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá…các cấu trúc
của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…); các cơ quan dự trữ (củ, căn hành…). Tùy
theo sự tiếp xúc với môi trường mà các mẫu thực vật có chứa ít hay nhiều
mầm bệnh (vi khuẩn, nấm). Các cấu trúc thực vật được bao kín (lá mầm,
phôi, mô thịt trong quả…) thường không chứa hoặc có ít vi sinh vật. Ngược
lại, các mô và cơ quan thực vật tiếp xúc với nước, đất như rễ, củ, thân ngầm
thường có lượng vi sinh vật rất cao và rất khó loại bỏ hoàn toàn chúng ra
khỏi nguồn mẫu.
Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất
có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hiệu quả của các chất này phụ thuộc vào
thời gian, nồng độ xử lý và khả năng xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách
trên bề mặt mẫu cấy.
-
Dung dịch Hypocloride
Ion hypocloride có trong sodium hypocloride (NaOCl) hoặc Calcium
hypocloride [Ca(OCl)2]. Sodium hypocloride hòa tan trong nước ở dạng
lỏng. Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox.
Nồng độ cuối cùng có thể thay đổi từ 0,25 – 2% trọng lượng / thể tích tùy
-
Chất khử nấm
Nhiều chất khử nấm có nguồn gốc là thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng
trong khử trùng. Ví dụ Benomyl, Carbendazim, Fenbendazol là các chất khử
nấm của thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng như chất khử trùng bề mặt.
Nồng độ và liều lượng thay đổi theo loại mẫu thực vật.
-
Chất kháng sinh
Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt để loại trực
tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy. Các chất kháng sinh thường được sử dụng
là: Streptomycin, Merthiolate, Penicilin, Alcide, Rifampicin.
7
Luận văn tốt nghiệp
Công nghệ Sinh học K31
*Vô trùng dụng cụ và môi trường
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát
triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần
môi trường nuôi cấy. Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa
đường, muối khoáng, vitamin..rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn
phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các
tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi
8
cộng sự (1991), có khoảng 5% đường saccarose của môi trường bị
phá hủy khi khử trùng.
+Sau khi khử trùng phải giảm áp suất từ từ, giảm nhanh sẽ
làm cho chất lỏng trong bình trào lên miệng bình.
-
Màng lọc
Dùng để loại bỏ tác nhân gây nhiễm có kích thước 0,025-10µm khỏi môi
trường nuôi cấy (môi trường lỏng), nước cất…Đây là phương pháp phù hợp
đối với những môi trường mà thành phần của chúng bị phân hủy bởi nhiệt độ
cao. Những môi trường đó được lọc vô trùng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
qua các màng có lỗ siêu nhỏ.
Các loại màng lọc phổ biến:
+Màng lọc bằng thép không gỉ: màng Swinney.
+Màng lọc bằng polypropylene: màng Swinex, đây là loại
màng chỉ dùng 1 lần rồi bỏ.
Với các dung môi kỵ nước như dung dịch có chứa dimetyl sulfoxit thì phải
dùng màng lọc bằng cellulose acetate (có kích thước 0,1-0,2 µm). kích thước
lỗ của màng lọc ≤ 0,22 µm, có thể loại bỏ hoàn toàn các vi sinh vật gây
nhiễm: vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…(Torres, 1989).
b) Môi trường nuôi cấy
Thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật,
loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan
nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác
nhau. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển
của mẫu cấy.
hấp thu potassium ở dạng K+. Các dạng muối potassium thường dùng là KNO3,
KCl, KH2PO4. Nồng độ trong môi trường từ 2 =>25mM.
-Calcium (Ca): Calcium là thành phần của vách tế bào, màng tế bào và
hoạt tính của một số enzyme. Mô cây hấp thu dưới dạng Ca2+. Các dạng Calcium
thường dùng là Ca(NO3)2.6H2O, CaCl2.6H2O. Nồng độ trong môi trường từ
1=>3,5mM.
-Magnesium (Mg) : Magnesium được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O
với nồng độ từ 0,5=>3mM.
-Lưu huỳnh (S): là thành phần của một số amino acid như cystein,
methionin và vài vitamin. Mô cây hấp thu lưu huỳnh ở dạng SO42-.
10
-Sodium (Na): Ion Na+ được hấp thu vào trong cây tuy nhiên chức năng
của Na đối với cây trồng thực sự chưa rõ. Người ta cho rằng Na có chức năng
ổn định thẩm thấu của các cây sống trong vùng mặn.
-Chloride (Cl): Chloride có vai trò trong quang hợp chủ yếu ở hệ thống
quang II trong quá trình quang phân ly nước. Ngoài ra, ion Cl- còn điều hòa sự
đóng mở của khí khẩu. Mô cây hấp thu Chloride ở dạng Cl-.
-
Các nguyên tố khoáng vi lượng
Các nguyên tố thường được sử dụng như Iodine (I), Bo(B),
Mangan(Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Nhôm (Al), Sắt (Fe)…Có rất ít các
nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển
của mô và tế bào. Tuy nhiên để an toàn các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với
cây đều được cung cấp trong môi trường nuôi cấy.
-Bo (B): Vai trò của Bo trong cây cũng chưa thực sự rõ. Người ta thấy Bo
này thì chưa thật sự hiểu rõ. Người ta thấy Nickel là thành phần của enzyme
urease biến đổi ure sang ammonium.
*Các vitamin
Các vitamin có chức năng làm chất xúc tác trong quá trình biến dưỡng.
Lượng vitamin được tổng hợp trong mô rất ít nên cần cung cấp vitamin trong
môi trường nuôi cấy. Các vitamin thường được sử dụng là: Thiamin (B1) cần
cho sự trao đổi hydratcarbon và sinh tổng hợp một số amino acid, Nicotinic
acid (B3) tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp, pyridoxine (B6) là một
coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng tra đổi chất. Ngoài ra còn sử dụng
các loại vitamin khác như Biotin (vitamin H), Acid Folic (Vitamin M),
Riboflavin (vitamin B2), acid ascorbic (vitamin C), acid pantothenic (vitamin
B5), Toccopherol (vitamin E). Các vitamin thường được dùng ở nồng độ từ 0,1
=>10mg/l.
* Acid amin
Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường cần phải được bổ sung các
amino acid vì chúng giữ vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái.
Tất cả các dạng tự nhiên của amino acid (dạng L) dễ dàng được mô nuôi
cấy hấp thụ (Skoog and Miles, 1957). L-arginin dung cho nuôi cấy rễ, L-tyrosin
dung cho nuôi cấy chồi, L-serin dung cho nuôi cấy hạt phấn. Nồng độ sử dụng
của mỗi loại là 10-100mg/l (Narayanaswamy, 1994).
Các L-glutamin, L-asparagin cũng được dùng trong nuôi cấy vì chúng
tham gia vào cảm ứng và duy trì quá trình phát sinh phôi vô tính. Các amino
acid còn là nguồn cung cấp nitơ hữu cơ cho mô cấy.
12
*Nguồn carbonhydrate
in vitro
Luận văn tốt nghiệp
Công nghệ Sinh học K31
Các auxin thường được sử dụng ở nồng độ 0,1=>5,0mg/l. Auxin thường
được dùng kết hợp với cytokinin trong sự nhân chồi (Bùi Bá Bổng, 1995).
Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động
sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay
thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus).
- Cytokinin
Cytokinin là adenine được thay thế N-6 liên kết với auxin gây ra sự phân
chia tế bào ở thực vật. Zeatin là cytokinin tự nhiên ở thực vật. Kinetin và
benzyladenin được tổng hợp đầu tiên nhưng gần đây được chứng minh là được
tạo ra tự nhiên ở vài loài cây. Cytokinin đóng vai trò chính trong sự thành lập
chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô. Nhiều cytokinin được tổng hợp như
diphenylurea (DPU), thidiazuron (TDZ). TDZ được sử dụng rộng rãi trong nuôi
cấy mô ngày nay. TDZ ngăn cản cytokinin oxidase và giảm sự biến dưỡng dẫn
đến mức độ cao hơn của cytokinin trong nuôi cấy mô. Benzyladenin được sử
dụng để kích thích sự tăng trưởng chồi, các cytokinin thường được dùng ở nồng
độ từ 1=>10mg/l (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
-
Các chất điều hòa sinh trưởng khác
Ngoài các chất trên, một số chất khác cũng được sử dụng trong nuôi cấy
mô như:
-Gibberelin: GA3 thường được sử dụng để kích thích sự kéo dài ở
phân sinh mô chồi.
-Abscisic acid (ABA): được sử dụng trong sự tạo phôi vô tính
trong thao tác phôi và đổi phôi thành cây con.
Gelrite
Gelrite TM (Kelco Division of Merck and Co.) là polysaccharide được
sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas elodea. Gelrite tạo được môi trường trong
suốt nên có thể nhận biết sự tạp nhiễm từ rất sớm. Tuy nhiên, gelrite không thể
tạo gel khi đun nóng lại như agar. Một đặc tính giới hạn nữa của Gelrite là nồng
độ của cation hóa trị hai như ion calcium và ion magnesium phải ở trong khoảng
4=>8mM/l. Nồng độ của hai ion trên thấp hoặc cao hơn khoảng này đều làm cho
môi trường không tạo gel được. Gelrite TM cũng có khả năng gây dư lượng
nước trong mô khi dùng ở lượng thấp.
-
Phytagel
PhytgelTM được xem là dạng thay thế agar đươc sản xuất từ một chất có
nguồn gốc từ vi khuẩn, bao gồm acid glucuronic, rhamnose và glucose.Tạo môi
trường trong suốt và có tính tạo gel cao vì vậy giúp nhận biết sự tạp nhiễm rất
tốt. Phytagel được dùng với nồng độ từ 1,5=>2,4g/l. Sự dư thừa nước trong mô
cũng xảy ra với chất tạo gel này.
15
Luận văn tốt nghiệp
Công nghệ Sinh học K31
Tùy loại vật liệu mà chất tạo gel nào sẽ được sử dụng. Mô của một vài
loài có thể sinh trưởng tốt trong môi trường có chất tạo gel này nhưng lại không
tốt ở môi trường có chất tạo gel khác. Các chất tạo gel khác nhau sẽ gây ra hiên
Tùy theo mục đích nghiên cứu mà vật liệu nuôi cấy sẽ được chọn từ những
phần khác nhau của cây lúa ban đầu. Một phương pháp sản xuất trực tiếp các
giống lúa là nuôi cấy mô phân sinh chồi từ hạt gạo nảy mầm hai tuần tuổi.
Dương Tấn Nhật và ctv (2000) đã tiến hành thí nghiệm trên mẫu cắt mỏng của
mô phân sinh chồi của hạt gạo nảy mầm hai tuần tuổi. Kết quả có hơn 95% cây
con tái sinh sống sót khi chuyển ra nhà kín. Phương pháp này giúp rút ngắn thời
gian tái sinh cây so với phương pháp tái sinh từ mô sẹo vì không phải qua giai
đoạn cấy chuyển.
Bên cạnh mô phân sinh chồi thì mô phân sinh rễ cũng được sử dụng để tái
sinh cây. Theo báo cáo của Shin-ichiro Kawata và Aiya Ishihara (1968), mô sẹo
đã được tạo từ chóp rễ và được tái sinh trên môi trường MS có bổ sung thêm
2,4-D, IAA, thiamine, pyridoxine, nicotinic acid, casein hydrolysate. Năm 2003
Mandal và ctv. đã báo cáo về nghiên cứu tạo mô sẹo từ rễ non của hai dòng lúa
Quing Livan 1 và IET 13856. Rễ từ hạt lúa mới nảy mầm được 8 ngày tuổi có
khả năng tạo sẹo với phẩm chất tốt và tỷ lệ tái sinh cao.
Ngoài ra, phương pháp tạo mô sẹo từ hạt gạo là một trong những phương
pháp phổ biến trong nuôi cấy mô lúa. Lúa dưới 3 tháng tuổi sau khi thu hoạch sẽ
cho kết quả tạo sẹo tốt hơn lúa đã thu hoạch sau 3 tháng (Huỳnh Thị Hồng Mai,
2005). Theo báo cáo của Nguyễn Minh Thế (2001) tỷ lệ tạo mô sẹo từ hạt gạo
của các giống KDML 105, Jasmine 85, Tài nguyên, Một bụi cũng đạt kết quả
tốt.
Cây lúa được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy túi phấn đã được báo cáo
lần đầu bởi Niiezki và Oono (1968). Chen Y và ctv. (1981, 1982) đã báo cáo về
sự phát triển của mô sẹo và cây được tạo ra từ hạt phấn lấy từ bao phấn 3-4 ngày
tuổi. Kỹ thuật này được ứng dụng nhằm tạo các dòng thuần đơn bội kép.
17
môi trường MS cơ bản có bổ sung 500mg/l proline, 500mg/l glutamine, 300mg/l
CEH, 30g/l sucrose, 2,5mg/l 2,4-D cho kết quả tạo mô sẹo tốt nhất ở hai giống
lúa MTL250 và IR64 với tỷ lệ lần lượt là 46% và 44,7%.
18
Copyright: Tài liệu đại học ©