BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH CỦA 2 CHẾ PHẨM THUỐC
CHỨA ENZYM

Chủ nhiệm đề tài: TS. ĐOÀN CAO SƠN
Cơ quan chủ trì đề tài:
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Năm 2010


MỤC LỤC
PHẦN A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI ............................. 1
1. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................................ 1
2. Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu............................................................ 1
3. Kết quả nghiên cứu........................................................................................................... 2
4. Kết luận rút ra từ nghiên cứu......................................................................................... 3
5.Về cải tiến kỹ thuật............................................................................................................. 5
6. Những đóng góp khác ...................................................................................................... 5
7. Tiến độ thực hiện .............................................................................................................. 6
PHẦN B. NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
CẤP BỘ................................................................................................................... 7
1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................... 7
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 7
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 9


3.3. Phương pháp ...................................................................................................... 28

3.3.1. Bromelain............................................................................................ 28
3.3.2. Trypsin ................................................................................................ 28
3.3.3. Streptokinase....................................................................................... 29
3.3.4. Streptodornase .................................................................................... 29
4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................................30
4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm
thuốc chứa bromelain và trypsin............................................................................. 30

4.1.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của bromelain và trypsin .... 30
4.1.2. Thẩm định phươn g pháp xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm
thuốc chứa bromelain và trypsin .................................................................. 34
4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm
thuốc chứa streptokinase và streptodornase .......................................................... 43

4.2.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của streptokinase và
streptodornase .............................................................................................. 43
4.2.2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng để xác định hoạt tính enzym
trong chế phẩm thuốc chứa streptokinase và streptodornase ..................... 50
4.3. Áp dụng các quy trình đã xây dựng để kiểm tra chất lượng của một số chế
phẩm trên thị trường ................................................................................................ 67

4.3.1. Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa bromelain và trypsin .... 67
4.3.2. Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa Streptokinase và
Streptodornase............................................................................................... 68
4.4. Bàn luận về ý nghĩa thực tiễn của đề tài .......................................................... 69

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................70
5.1. Kết luận............................................................................................................... 70

Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông .....................55
Bảng 18: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Streptokinase
bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông .............................................56


Bảng 19: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo thời gian ly giải khối đông......................................................57
Bảng 20: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo thời gian ly giải khối đông.......................................................58
Bảng 21: Kết quả định lượng Streptokinase của 1 số chế phẩm trên thị trường.............59
Bảng 22: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptodornase 60
Bảng 23: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát
độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase....................................61
Bảng 24: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase.......62
Bảng 25: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát
độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase......................................63
Bảng 26: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase.........64
Bảng 27: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 1 trong thử nghiệm khảo
sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase.......................65
Bảng 28: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 2 trong thử nghiệm khảo
sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase........................66
Bảng 29: Hàm lượng bromelain và trypsin trong một số chế phẩm ..............................67
Bảng 30: Hàm lượng streptokinase và streptodornase trong một số chế phẩm .............68


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng
Tyrosin....................................................................................................................34
Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ trong định lượng
Bromelain...............................................................................................................35

SK

: Streptokinase

Arg

: Arginin

Val

: Valin

Asp

: Asparagin

Lys

: Lysin

Leu

: Leucin

Plgn

: Plasminogen

Pm


chất lượng thuốc.
Các phương pháp định lượng được xây dựng hướng tới phù hợp về mặt kỹ thuật
với điều kiện trang thiết bị hiện tại của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các
cơ sở thuộc hệ thống kiểm nghiệm thuốc nói chung. Trong một số trường hợp, do
chưa có phương pháp phù hợp, sau quá trình khảo sát sơ bộ, nhóm nghiên cứu đã
phải tiến hành cải tiến các điều kiện phân tích cho phù hợp với đối tượng mẫu thuốc
cần kiểm tra cũng như điều kiện trang thiết bị hiện có.
Cụ thể, trong số 4 phương pháp xác định hoạt tính của 4 enzym thì chỉ có 2
phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym là Streptokinase (BP và CP) và
Trypsin (USP) là có sẵn trong các dược điển ở chuyên luận thuộc về các nguyên
liệu. Còn phương pháp xác định hoạt tính của Bromelain chưa có trong dược điển

1


và Streptodornase chỉ có trong chuyên luận Streptokinase nguyên liệu và giới hạn
Streptodornase, vì vậy nhóm nghiên cứu đã thực hiện các bước sau:
1- Tham khảo các tài liệu để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của
enzym Bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin.
2- Tham khảo tài liệu USP để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin
trong chế phẩm chứa hỗn hợp Bromelain và Trypsin.
3- Tham khảo tài liệu BP 2003 và CP 2005 và các nguồn tài liệu khác để xây
dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Streptokinase trong chế phẩm
chứa hỗn hợp Streptokinase và Streptodornase.
4- Tham khảo các tài liệu hiện có để xây dựng phương pháp xác định hoạt tính
của enzym Streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp Streptokinase và
Streptodornase.
5- Áp dụng 2 phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym Bromelain và
Trypsin đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym
này có trên thị trường.

chứa Bromelain và trypsin.
4/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase trong chế phẩm
hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase.

4. Kết luận rút ra từ nghiên cứu:
- 4 quy trình định lượng xác định hoạt tính của 4 enzym Bromelain, Trypsin,
Streptokinase và Streptodornase trong 2 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym đã được
xây dựng, thẩm định dựa trên đối tượng nghiên cứu là các sản phẩm đang lưu hành
trên thị trường Việt Nam. Những quy trình này đã được chứng minh tính khả thi
trong điều kiện cơ sở vật chất của nước ta, trên đúng đối tượng áp dụng là các chế
phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym, do đó đây là những giải pháp kỹ thuật có ý nghĩa ứng
dụng thực tiễn cao trong kiểm tra giám sát chất lượng thuốc chứa các hoạt chất
enzym tại Việt Nam.
- Trong quá trình thực hiện đề tài, qua những kết quả thực nghiệm, chúng tôi có
một số nhận xét về tính mới sau:
a) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Bromelain trong chế
phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin:
- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp
với phương pháp quang phổ UV-VIS.

3


- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym trypsin đến phương
pháp xác định hoạt tính của bromelain trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này.
Kết quả trypsin không ảnh hưởng đến phương pháp xác định hoạt tính của
bromelain.
b) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzym Trypsin trong chế phẩm
hỗn hợp chứa 2 enzyme Bromelain và trypsin:
- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp

Theo dược diển Mỹ (chuyên luận ly giải fibrin của Alteplase bằng cách xác định
bọt khí) thì cũng rất khó giam giữ bọt khí đồng đều trong các ống nghiệm, hơn nữa trong
quá trình tạo bọt khí có ảnh hưởng lớn đến sự tạo fibrin nên kết quả không ổn định.
Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã cải tiến cách xác định điểm ly giải hoàn toàn fibrin
bằng quan sát sự rơi cận đáy của viên bi chuẩn cho phép xác định chính xác điểm
dừng có độ đúng cao và dễ quan sát.
- Phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase: Sử dụng nhớt kế Oswald với
mao quản thích hợp thay vì thiết bị xác định độ nhớt bằng điện cực Platin có gắn
bơm chân không. Vì thiết bị này chưa có tại Việt Nam và rất đắt tiền, còn nhớt kế
Oswald hiện có tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.

6. Những đóng góp khác:
a) Góp phần đánh giá chất lượng thuốc:
Các thuốc có bản chất là enzym rất đễ bị thay đổi về mặt chất lượng. Hơn nữa
các phương pháp xác định hoạt tính các enzym rất đa dạng, cách biểu thị hoạt tính
enzyme tùy thuộc vào từng cơ sở sản xuất (có thể xác định theo IU hoặc mg hoặc
các đơn vị khác theo qui định). Vì vậy để xây dựng được một phương pháp xác định
hoạt tính của mỗi enzym sẽ góp phần nâng cao năng lực đánh giá chất lượng của
nhóm hoạt chất "khó tính" này, đặc biệt là trên đối tượng chế phẩm phối hợp các
enzym hiện đang lưu hành trên thị trường.
b) Đào tạo:
- Qua quá trình thực hiện đề tài, năng lực kiểm nghiệm, đặc biệt là kiểm
nghiệm enzym của các cán bộ tham gia nghiên cứu được cập nhật và nâng cao. Góp
phần đào tạo các cán bộ thử việc.
- Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu đã kết hợp chặt chẽ với
trường Đại học Dược Hà Nội để gắn kết công tác nghiên cứu với đào tạo nhân lực
cho ngành Dược. Trong khuôn khổ đề tài, các kết quả nghiên cứu thu được đã đăng
ký luận án tốt nghiệp thạc sĩ dược học.

5

• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả các sản phẩm đều chưa đạt
chất lượng.
• Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng
• Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ)
d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí thực hiện để tài: 450 triệu đồng.
Trong đó

Kinh phí sự nghiệp khoa học: 450 triệu đồng.
Kinh phí từ nguồn khác:

0 triệu đồng.

Trang thiết bị đã được đầu tư từ nguồn kinh phí của đề tài (chi phí những trang thiết
bị có giá trị trên 3000 USD):

Không

Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán
Chưa thanh quyết toán xong:

Không

Kinh phí tồn đọng:

Không

6




7


Về phương pháp kiểm nghiệm các enzym này, trong các dược điển mới chỉ
có Dược điển Anh quy định chuyên luận nguyên liệu Streptokinase, chưa có
chuyên luận của streptodornase nguyên liệu và các dạng chế phẩm, đặc biệt là chế
phẩm phối hợp gồm streptokinase và streptodornase.
Đối với enzym bromelain và trypsin, trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ
mới có chuyên luận nguyên liệu Trypsin, chưa có chuyên luận về chế phẩm.
Các tiêu chuẩn chất lượng của các chế phẩm hiện có trên thị trường vẫn chưa
được thẩm định, đánh giá một cách đầy đủ. Đặc biệt là tiêu chuẩn của chế phẩm hỗn
hợp Streptokinase và streptodornase do các nhà sản xuất cung cấp vẫn chưa thực
hiện được với điều kiện của các cơ sở kiểm nghiệm trong nước do không có trang
thiết bị chuyên dụng.
Từ các lý do trên, việc đánh giá chất lượng của các chế phẩm này hiện nay
vẫn còn hạn chế, và thực tế là chưa kiểm tra chất lượng các chế phẩm hỗn hợp
Streptokinase và streptodornase. Trong khi đó enzym được coi là loại thuốc sinh
học, có bản chất protein nên rất dễ bị giảm hoạt tính trong các điều kiện bảo quản
không tốt hoặc bị thoái biến theo thời gian nên không có tác dụng điều trị.
Để thực hiện nhiệm vụ này đòi hỏi phải có sự đầu tư nghiên cứu để xây dựng
các phương pháp xác định họat tính của các chế phẩm enzym nhằm áp dụng cho
công tác kiểm tra chất lượng thuốc trong điều kiện hiện có của hệ thống kiểm
nghiệm.
Trong thời gian gần đây, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương đã tiến hành
nghiên cứu và xây dựng được một số phương pháp, quy trình kiểm tra chất lượng
của một số dạng chế phẩm enzym. Tuy nhiên, do điều kiện kinh phí hạn hẹp, việc
nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở một số chế phẩm enzym đơn thành phẩn và đơn giản.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp
xác định hoạt tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là thực sự cần thiết và

Đức, Bromelain được sử dụng rộng rãi, đứng thứ 13 trong số các thảo dược.
Năm 1964 Murachi và cộng sự đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzym
Bromelain, kết quả như sau [1]:
. Trọng lượng phân tử:

33200 - 33500 Dalton

. Hằng số lắng:

2,73 S

. Tỷ trọng:

1,346

. Điểm đẳng điện pI:

9,55

9


Bromelain là enzym thuộc nhóm enzyme thiol (Cystein) protease, có khả
năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein thành các đoạn nhỏ. Thành
phần hóa học của Bromelain là một glycoprotein. Mỗi phân tử có chứa 1 chuỗi
oligosaccharid (glycan) gồm 3 manose, 2 glucosamin, 1 xylose và 1 fructose. Tùy
theo phương pháp thu nhận mà thành phần acid amin thay đổi khác nhau, trong
khoảng 121 - 144 acid amin. Hơn nữa, Bromelain trong các bộ phận khác nhau của
cây dứa cũng có thành phần hóa học khác nhau như polypeptid của Bromelain thân
có acid amin (đầu -NH2) là valin hoặc glycine, còn Bromelain quả lại có acid amin


2+

,

H2O2. Trong khi đó, một số ion kim loại như Zn2+, Fe2+, Ag+, ... lại làm ổn định cấu
trúc phân tử của Bromelain.
Hiện nay, bromelain được sản xuất bằng cách tinh chế từ hỗn hợp chiết xuất
trực tiếp từ cây dứa và thành phẩm tạo ra ở dạng viên nang hoặc viên nén, được
dùng trong điều trị. Ngoài tác dụng tham gia vào quá trình đồng hóa protein trong
thức ăn, Bromelain còn có nhiều tác dụng khác ở ngoài đường tiêu hóa. Trên thực

11


tế, Bromelain được biết đến như là một thuốc kháng viêm tự nhiên và được ứng
dụng ngày càng nhiều trong điều trị như là một thuốc hỗ trợ:
. Trong phẫu thuật hoặc tổn thương:
Bromelain hỗ trợ làm giảm sưng, các vết thâm tím, viêm hoặc đau sau phẫu
thuật hoặc thương tổn, đặc biệt trường hợp bị bỏng, bromelain giúp mau chóng lành
vết thương.
. Trong điều trị viêm xoang:
Bromelain được khuyến cáo như là thuốc điều trị hỗ trợ cho viêm xoang, làm
giảm sự xung huyết, gây dễ thở và ức chế ho, làm giảm các triệu chứng viêm xoang.
Nó là 1 trong những thuốc hỗ trợ điều trị thịnh hành ở Đức, được Hội đồng Điều trị
của Đức chỉ định trong điều trị viêm sưng ở mũi và xoang mũi do phẫu thuật hoặc
do tổn thương từ năm 1993 [5].
. Trong tiêu hóa :
Bromelain là thuốc hỗ trợ giúp tiêu hóa tự nhiên là do có khả năng tiêu hủy
protein, được dùng trong các trường hợp có các hội chứng sưng, sinh hơi và hội

amin bằng phương pháp chuẩn độ acid kiềm [7].
. Thủy phân cơ chất Nα- carbobenzoxy-L-lysin p-nitrophenyl ester: tạo ra
sản phẩm p-nitrophenol, làm thay đổi giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch theo
thời gian. Hoạt tính của bromelain được xác định dựa theo lượng p-nitrophenol tạo
thành.
. Thủy phân các protein có trong hỗn dịch sữa làm đông vón hỗn dịch sữa.
Hoạt tính của bromelain được xác định bằng cách so sánh thời gian đông vón sữa
với chất chuẩn đã biết hoạt tính.
2.2. Enzym Trypsin
2.2.1. Cấu trúc và tính chất của enzym trypsin
Enzym trypsin có mặt trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật có xương
sống, có khả năng thủy phân protein. Trypsin được sản xuất tại tuyến tụy dưới dạng
tiền enzym là trypsinogen với trọng lượng phân tử là 34 Kdalton, sau khi cắt chuỗi
gồm 6 acid amin ở đầu N tạo thành trypsin hoạt động có trọng lượng phân tử 23,8
KDalton. Phân tử trypsin là 1 chuỗi peptid đơn có khoảng 223 acid amin [26].

13


Khi tuyến tụy bị kích thích bởi cholecystokinin sẽ tiết trypsinogen vào ruột
non. Tại đó, enzym peptidase trong ruột (Enteropeptidase) sẽ hoạt hóa chúng để tạo
thành trypsin. Tuyến tụy tổng hợp 3 dạng đồng phân của trypsinogen là
trypsinogen-1 (cation trypsinogen), trypsinogen-2 (anion trypsinogen), và
trypsinogen-3 (mesotrypsinogen). Trypsinogen-1 và trypsinogen-2 là hai dạng chính
chịu trách nhiệm tiêu hóa protein với tỷ lệ 2:1, trong khi mesotrypsin chỉ chiếm 5%
trong tổng số dịch tiết của tuyến tụy, không bị các chất ức chế trypsin tác động.
Mesotrypsin là một protease biệt hóa , có vai trò đặc biệt trong việc phá hủy các
chất ức chế trypsin, nên có ích trong việc tiêu hóa các thực phẩm giầu chất ức chế
trypsin như đậu tương. Bản thân trypsin hình thành cũng lại tự động hoạt hóa
trypsinogen. Do đó chỉ cần một lượng nhỏ enzym Enteropeptidase đủ để khởi động

histidin nhận –H từ -OH của serin và cặp điện tử từ liên kết đôi –C=O di chuyển về
phía nguyên tử oxy.
. Bước 3: Liên kết giữa Nitơ và carbon của mạch peptid bị bẻ gãy. Các điện tử hóa
trị của liên kết này di chuyển để tấn công vào nguyên tử -H của histidin làm gãy
mối liên kết. Các điện tử đã chuyển dịch về phía nguyên tử oxy trong gốc carbonyl
trước đó lại di chuyển ngược lại để tái tạo lại liên kết hình thành sản phẩm trung
gian acyl-enzym.
. Bước 4: Lúc này, phân tử nước tham gia vào phản ứng. Nước thế chỗ cho đầu –N
của mạch peptid bị cắt và tấn công vào nguyên tử carbon của gốc carbonyl. Một lần
nữa, các điện tử của liên kết đôi –C=O di chuyển về phía nguyên tử oxy làm cho nó
tích điện âm, hình thành liên kết giữa oxy của nước với nguyên tử carbon, đồng
thời nitơ của Histidin nhận proton từ nước.
. Bước 5: Trong phản ứng cuối cùng này, liên kết hình thành trong bước 1 giữa
nguyên tử carbon của gốc carbonyl và serin lại di chuyển để tấn công vào nguyên tử
–H mà histidin vừa nhận được. Lúc này nguyên tử carbon tái tạo lại liên kết đôi với
nguyên tử oxy. Kết quả mạch peptit ở đầu –C bị tách ra (Hình 2).

15


Hình 2: Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzym trypsin
Do vị trí cắt của enzym nằm phía trong của chuỗi polypeptid nên trypsin
được phân loại là enzym peptidase nội phân tử (endopeptidase)
Trypsin có cấu trúc phân tử tương tự như của enzym chymotrypsin, tuy nhiên
chúng khác nhau ở loại cơ chất cần phân giải: trypsin cắt protein tại vị trí lysin và
arginin, còn chymotrypsin lại cắt tại các gốc kỵ nước như tryptophan, tyrosin và
phenylalanin.

16


trẻ nhỏ, do trypsin có khả năng phân cắt các phân tử protein trong sữa giúp trẻ tiêu
hóa dễ dàng hơn.

17


2.2.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym trypsin
Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất để xác định hoạt tính của trypsin là
trên cơ chế thủy phân cơ chất N-benzoyl-L-arginin ethyl ester như sau:
Trypsin
N-benzoyl-L-arginin ethyl ester

N-benzoyl-L-arginin + Ethanol

Trên cơ sở sản phẩm tạo thành có hai cách để xác định hoạt tính của trypsin:
- Theo Dược điển Mỹ, giá trị hấp thụ của dụng dịch theo thời gian và hoạt
tính của Trypsin được xác định bằng cách quy đổi từ sự biến thiên giá trị của độ
hấp thụ [3,28].
- Theo Dược điển Anh, lượng N-benzoyl-L-arginin tạo thành làm thay đổi
pH của hỗn hợp phản ứng. Hoạt tính enzym trypsin được tính toán bằng cách so
sánh với chất chuẩn đã biết hoạt tính, dựa trên thể tích dung dịch natri hydroxyd cần
thiết để duy trì pH tại giá trị 8,0 [27].
2.3. Enzym streptokinase
2.3.1. Cấu trúc và tính chất của enzym streptokinase
Streptokinase được phát hiện vào năm 1933, do Bác sỹ William Smith Tilett
người Mỹ một cách hoàn toàn tình cờ trong một thử nghiệm: Ông lấy huyết tương
người từ máu có chứa chất chống đông oxalat để loại bỏ Ca++ nên không bị đông.
Sau đó ông bổ sung Ca++ vào ống chứng, liên cầu khuẩn và canxi vào các ống thử
với hy vọng là các vi khuẩn sẽ hấp phụ fibrinogen trong huyết tương để ngăn ngừa
hình thành cục đông. Nhưng ông đã thất vọng khi tất cả các ống nghiệm, kể cả ống