Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
PHầN 1: Mở đầu
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, khoai tây (solanum tuberosum L.) đợc coi là nguồn lơng
thực quan trọng, có giá trị dinh dỡng và giá trị kinh tế cao, chiếm vị trí không
nhỏ trong nền kinh tế quốc dân của nhiều nớc trên thế giới. Hiện nay khoai
tây đựơc xếp là cây lơng thực đứng hàng thứ t sau lúa mì, lúa nớc và ngô. Đây
là cây lơng thực quan trọng trong cơ cấu cây trồng vụ đông do có các u điểm
nh thời gian sinh trởng ngắn (80 - 100 ngày), cho năng suất cao (15 - 30
tấn/ha), củ giàu dinh dỡng (protein; đờng; lipít; các loại vitamin B1; B2; B3;
các loại khoáng quan trọng (kali, canxi, magie) và nhiều nhất là vitamin C (20
50mg%) (Tạ Thu Cúc, 2000) [2]. Khoai tây là loại rau có nhiều năng lợng,
cứ 1 kg khoai tây cho 848 kcal. Cây khoai tây vốn là một cây a lạnh có nguồn
gốc ở vùng cao nhiệt đới (từ 1000 m trở lên). Trải qua quá trình chọn lọc và
thuần hoá, nó đợc trồng ở các vùng khí hậu khác nhau bao gồm các vùng ôn
đới, á nhiệt đới và nhiệt đới với các điều kiện sinh thái khác nhau từ vùng
đồng bằng đến vùng núi cao.
ở Việt Nam, khoai tây đợc coi là nhóm cây lơng thực có tầm quan
trọng đứng thứ ba sau lúa và ngô. Trong quá trình phát triển kinh tế xã hội,
nhu cầu tiêu thụ khoai tây của thị trờng nói chung, đặc biệt là các đô thị, khu
công nghiệp, khu du lịch, sẽ ngày càng tăng. Việt Nam có khả năng phát triển
mạnh khoai tây, đây là cây trồng vụ Đông lý tởng cho đồng bằng Bắc Bộ,
miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. ở miền Bắc nớc ta, khoai
tây đợc trồng sau hai vụ lúa, đã góp phần cải tạo và nâng cao độ phì nhiêu cho
đất, hạn chế lây lan của sâu bệnh. Đồng thời, việc luân canh nh vậy mang lại
hiệu quả kinh tế cao cho ngời nông dân. Tuy nhiên, khoai tây cha đợc phát
nguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính quý của nguyên
liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với phơng pháp nhân
giống truyền thống. Xuất phát từ ý nghĩa khoa học trên, chúng tôi đã tiến hành
đề tài : Nghiên cứu ảnh hởng của một số nồng độ trong quy trình nhân
nhanh giống khoai tây củ siêu bi nhằm tạo giống sạch bệnh.
1.2. Mục tiêu, ý nghĩa
1.2.1. Mục tiêu
Xác định đợc nồng độ tối u của - NAA, HgCl2, BAP tới khả năng
sống của mầm không bị nhiễm, khả năng sinh trởng chồi và khả năng tạo củ
bi trong nuôi cấy invitro của hai giống khoai tây: Solara, Diamant.
1.2.2. ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- ý nghĩa thực tiễn: kết quả nghiên cứu thành công sẽ ứng dụng trong
việc sản xuất giống khoai tây củ bi bằng phơng pháp invitro tạo đợc những
cây sạch bệnh, năng suất cao, giảm giá thành củ giống cho ngời sản xuất.
- ý nghĩa khoa học: xác định đợc nồng độ tối u của - NAA, HgCl2,
BAP bổ sung vào môi trờng nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây
invitro. Đồng thời nhằm đáp ứng nhu cầu về giống khoai tây củ siêu bi sạch
bệnh cho nghiên cứu.
1.2.3. Đối tợng và phạm vi nghiên cứu
1.2.3.1. Đối tợng nghiên cứu
Đề tài đợc nghiên cứu trên hai giống khoai tây nhập nội:
- Giống Solara.
- Giống Diamant.
1.2.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hởng của thời gian khử trùng, nồng độ HgCl2 đến khả
năng sống của mầm và ảnh hởng của - NAA đến khả năng sinh trởng chồi
của các giống khoai tây, ảnh hởng nồng độ BAP tới khả năng tạo củ trong ống
nghiệm.
1.2.3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Khoa Công nghệ Sinh học
PHầN 2. tổng quan tài liệu
2.1. Khái quát về khoai tây
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
2.1.1.1. Nguồn gốc
Khoai tây có nguồn gốc hơn 8000 năm trớc tại những khu vực nhiệt đới
cao của Peru nơi mà khoảng 5500 loài khoai tây đã đợc trồng bởi nhiều thế hệ
ngời dân tại vùng này. Theo Bucaxôp thì cây khoai tây đợc xác định có nguồn
gốc ở Nam Mỹ thuộc các nớc Chile, Peru, Bôlivia (Tạ Thu Cúc ; 2000) [2].
Theo các tài liệu cổ thì khoai tây hoang dại đợc ngời dân dãy Andess ở
Nam Peru và Bắc Bôlivia từ 3000 - 4000 năm trớc công nguyên. Sau khi thuần
hoá khoai tây đợc lan rộng khắp miền núi dãy Adess (Nguyễn Quang Thạch,
1993).
Khoai tây đợc du nhập vào Việt Nam từ 1890 và chủ yếu trồng ở Đồng
bằng Sông Hồng (Trơng Văn Hộ, Lê Thị Tuyết, Phạm Xuân Tùng, Vander
Zaag, 1988). Trớc năm 1970, diện tích khoai tây của nớc ta còn rất thấp, chỉ
khoảng 3000ha và chỉ đợc xem nh một loại rau (Trơng Văn Hộ, 1990) [8].
Nhờ cuộc cách mạng xanh ở miền Bắc, lúa xuân thay thế lúa chiêm, cùng với
sự ra đời của vụ đông mà cây khoai tây ở Việt Nam đợc chuyển vị trí từ một
cây rau sang một cây lơng thực quan trọng. Diện tích trồng khoai tây của nớc
ta đợc tăng lên nhanh chóng. Thậm chí, có giai đoạn (1987) Bộ Nông nghiệp
đã đánh giá cây khoai tây là cây lơng thực quan trọng thứ hai sau lúa, có vai
trò vừa là cây lơng thực vừa là cây thực phẩm, đồng thời là cây xuất khẩu có
giá trị kinh tế cao.
Sau một giai đoạn dài biến động thăng trầm, gần đây tình hình sản xuất
khoai tây ở Việt Nam có chiều hớng giảm sút nghiêm trọng cả về diện tích và
sản lợng. Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự giảm sút đó là do thiếu giống mới
có năng suất, chất lợng cao, sử dụng giống cũ đã thoái hoá nên năng suất thấp
(khoảng 10 tấn/ha) trong khi năng suất khoai tây ở Pháp là 35 tấn/ha, Hà Lan
khả năng cho củ. Cây khoai tây thuộc nhóm thân thảo, họ cà, thuộc loài
solanum tuberosum L. Theo tổng kết hiện nay có khoảng 20 loài khoai tây thơng phẩm ở thể tứ bội (2n = 4x = 48), có khả năng sinh trởng phát triển và cho
năng suất cao [4]. Và nó đợc phân loại theo bảng dới đây:
Khoai tây (Solanum tuberosum L) thuộc loài S. Tuberosum, chi
Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp
Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta.
2.1.2.2. Đặc điểm sinh thái
Cây khoai tây yêu cầu khí hậu mát mẻ, ôn hoà. Nhiệt độ là một yếu tố
quan trọng ảnh hởng trực tiếp đến sinh trởng và phát triển của khoai tây. Mỗi
thời kỳ sinh trởng và phát triển chúng yêu cầu nhiệt độ khác nhau. Nhiệt độ
thích hợp cho hạt nảy mầm là từ 18 - 20C, nhiệt độ thích hợp nhất cho thân lá
phát triển là 20 - 22 C. ở thời kỳ sinh trởng dinh dỡng nó có thể thích ứng với
biên độ nhiệt độ từ 10 - 25 C, rộng hơn so với giai đoạn sinh trởng sinh thực.
Lor (1960) đã chứng minh rằng nhiệt độ càng cao thì khối lợng thân, lá, củ
càng giảm.
Khoai tây là cây a sáng, cờng độ ánh sáng thích hợp cho khoai tây sinh
trởng và cho năng suất cao là từ 40.000 - 60.000 lux. Thời kỳ từ cây non đến
giai đoạn hình thành củ khoai tây đòi hỏi ánh sáng ngày dài (trên 14h ánh
sáng/ngày đêm) để quang hợp và tích luỹ chất dinh dỡng, đồng thời ra hoa,
đậu quả. Thời kỳ sinh trởng sinh thực và khi củ bắt đầu hình thành, cây khoai
tây cần có thời gian chiếu sáng ngắn.
2.1.2.3.Đặc điểm hình thái
Rễ
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
5
Trơng Thị Phơng Chi
Quả
Khoai tây thuộc loại quả mọng. Hình dạng quả tròn hoặc trái xoan. Khi
quả chín có màu trắng bạc phớt hồng, mùi vị rất dễ chịu. Quả có từ 2 - 3 ngăn,
bên trong có chứa nhiều hạt (30 - 300 hạt).
Củ khoai tây
Củ khoai tây là bộ phận thực phẩm cho con ngời. Củ khoai tây còn có tên
gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ đợc hình thành là do thân phát triển dới
đất, trong điều kiện bóng tối.
Hình dạng củ khoai tây có thể là tròn, elip, tròn dài, đôi khi hình vuông.
Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống, có thể là màu trắng, trắng nhạt, vàng,
vàng nhạt. Trên củ có nhiều mắt ngủ nhng phân bố không đều, số lợng mắt
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
6
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
ngủ nhiều hay ít tuỳ thuộc vào từng giống. Trên mắt ngủ có mi mắt và mắt: mi
mắt dài hay ngắn, mắt nông hay sâu là do đặc tính di truyền của giống trên
mỗi mắt thờng có 2 - 3 mầm ngủ và thờng tập trung nhiều trên đỉnh củ tuỳ
thuộc từng giống, thời vụ, đất trồng và điều kiện chăm sóc mà có trọng lợng
củ khác nhau [7].
2.1.3. Giá trị kinh tế và dinh dỡng
7
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
Theo Beukema, Varder Zaag (1979) thì cứ 1kg khoai tây cho 480 kalo.
Nếu sử dụng 100g khoai tây thì có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu về protein,
10% nhu cầu về vitamin C mỗi ngày. Tinh bột của khoai tây còn đợc dùng
trong công nghiệp dệt, sợi, gỗ ép và giấy. ở một số nớc phát triển, ngời ta còn
dùng khoai tây làm thức ăn gia súc, đặc biệt là trong công nghệ tạo acid hữu
cơ (lactic, citric), các dung môi hữu cơ (ethanol, butanol, axeton) (Grion,
1986, dẫn theo Nguyễn Quang Thạch, 1993) [10]. Gần đây ngời ta còn phát
hiện ra chất PPO (Poly phenol oxydase) trong vỏ khoai tây có tác dụng chống
bám dính làm cho vi khuẩn không xâm nhập vào trong tế bào gây bệnh. PPO
đợc coi là thứ vũ khí chống lại vi khuẩn trong đó có cả HIV (theo Thừa Thiên
Huế năm 2000). Khoai tây còn là cây cải tạo đất rất tốt trong các hệ thống
luân canh và đợc dùng làm thuốc. Thân lá khoai tây bào chế ra thuốc giảm
đau, an thần, chữa bệnh thần kinh. So sánh về năng suất chất khô trên một đơn
vị diện tích trồng trọt thì khoai tây cho năng suất cao hơn lúa mỳ 3,04 lần; lúa
nớc 1,33 lần và ngô 2,2 lần. Ngoài tiêu thụ trong nớc, khoai tây còn là mặt
hàng có giá trị xuất khẩu.
2.1.4. Tình hình nghiên cứu khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam
2.1.4.1. Tình hình nghiên cứu khoai tây trên thế giới
Thấy đợc tầm quan trọng của khoai tây với nền sản xuất lơng thực và
sản lợng khoai tây trên toàn thế giới.
Việc sử dụng củ nhỏ đã đợc quan tâm từ lâu vì nó cho hệ số nhân giống
cao. Gregory (1956) là ngời đầu tiên nghiên cứu về chất kích thích tạo củ
khoai tây kích thớc nhỏ bằng kỹ thuật in vitro. Tuy nhiên, việc sản xuất theo
các phơng pháp trên gặp một số khó khăn là thờng chỉ sản xuất đợc một vụ
trong năm và rất phụ thuộc vào nguồn cây in vitro.
Gần đây, hãng American Ag - Tec áp dụng công nghệ Quantum tuber
cho phép sản xuất hàng triệu củ nhỏ cho một năm, rút ngắn đợc thời gian tạo
củ nhỏ cho một năm, đặc biệt rút ngắn đợc thời gian tạo củ trong 40 - 50 ngày.
Theo ông Robert Britt, giám đốc công ty American Ag - Tec thì một công ty
có thể sản xuất đợc khoảng 10 - 20 triệu củ/năm. Điều này có nghĩa là chỉ cần
2 năm có thể nhân giống phổ biến cho diện tích khoai tây rộng lớn.
2.1.4.2. Tình hình nghiên cứu khoai tây ở Việt Nam
Bên cạnh những thành tựu và giá trị kinh tế của to lớn mà khoai tây mang
lại, có nhiều vấn đề phát sinh trong qua trình trồng và chăm sóc, đó là vấn đề
dịch bệnh, củ giống bị thoái hóa, năng suất thấp, kỹ thuật chăm sóc cha hoàn
thiện...Đây là những thách thức lớn của ngành nông nghiệp vì nó ảnh hởng lớn
tới chất lợng và sản lợng của cây trồng. Do đó nhiều công trình nghiên cứu
thực hiện nhằm mục đích tạo giống khoai tây sạch bệnh, ổn định cho sản lợng
cao, chất lợng tốt và đáp ứng nhu cầu giống cho bà con nông dân. Ngày nay,
những công trình nghiên cứu về khoai tây tập trung vào hoàn thiện kỹ thuật
canh tác, các vấn đề làm giảm năng suất khoai tây: dịch bệnh, chất lợng củ
giống....Việc nghiên cứu nhằm nâng cao chất lợng và sản lợng tạo củ giống
mini sạch bệnh trên khoai tây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô mới chỉ là bớc đầu
nghiên cứu. Có một số công trình nghiên cứu trên đối tợng khoai tây đã đợc
công bố.
Tác giả Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu cải lơng
giống khoai tây Arkersegen - một giống thích ứng với điều kiện nớc ta nhng
rất mẫn cảm với virus Y và nấm Phitoprola. Kết quả chọn lọc đợc giống mới
chống chịu PVY và mang các đặc tính mong muốn [9].
các tác giả Nguyễn Thị Hơng, Nguyễn Thị Sơn, Trần Thị Thanh Minh
(2005) [5].
Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đính (2006) về ảnh hởng của việc
phun bổ sung kali lên lá vào các giai đoạn sinh trởng khác nhau đến một số
chỉ tiêu sinh lý sinh hoá của giống khoai tây KT3 đã góp phần nâng cao
năng suất, phẩm chất của củ khoai tây
Các hớng nghiên cứu khác nhau đã và đang đợc tiến hành trên khoai
tây đặt cơ sở khoa học cho phép có thể thực hiện đợc các nghiên cứu nâng
cao chất lợng khoai tây giống, nhằm tạo giống khoai tây cho sản l ợng cao,
sạch bệnh.
2.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào (NCMTB) thực vật là phơng pháp sử dụng các điều
kiện nhân tạo để duy trì sự sống của tế bào thực vật trong điều kiện in
vitro. Mục đích chung của NCMTB thực vật là sử dụng các điều kiện nh
ánh sáng, nhiệt độ, thành phần dinh dỡng, chất điều hoà sinh trởng... để
điều khiển quá trình sinh trởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo
mục tiêu đặt ra [14].
2.2.1. Vài nét về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
10
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
tinh dịch cá bẹ có tác dụng kích thích sinh trởng rất rõ rệt trong nuôi cấy
những mảnh mô thân cây thuốc lá. Ông cho rằng chất có hoạt tính là sản phẩm
phân giải, và một năm sau, chất đó đợc tổng hợp thành công, đợc Skoog gọi là
kinetin do có tác dụng kích thích sự phân bào. Việc phát hiện ra NAA, 2,4-D,
kinetin cùng với các loại vitamin và nớc dừa là những bớc tiến có ý nghĩa
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
11
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
trong giai đoạn thứ hai của NCMTB thực vật. Nickell (1956) đã duy trì đợc sự
sinh trởng liên tục huyền phù cây đậu trắng (Phaseolus vulgarisi). Melcher và
Beck đã nuôi các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ
sung chất dinh dỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo
đợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng
đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp [15]. Năm 1957, Skoog và Miller
đã chứng minh sự biệt hoá của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tuỷ
thuốc lá phụ thuộc nồng độ tơng đối của tỷ lệ auxin/cytokinin và từ đó đa ra
quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan thực vật.
Trong giai đoạn mới từ năm 1960 trở lại đây, cùng với việc NCMTB đơn,
tế bào trần (protoplast), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn đợc phát triển
mạnh. Các kỹ thuật lai tế bào soma bằng dung hợp tế bào trần và các kỹ thuật
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
12
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
Mô sẹo (Callus) là một khối các tế bào phát sinh vô tổ chức và có hình
dạng không nhất định. Nuôi cấy mô sẹo đợc ứng dụng trong nhân giống in
vitro ở những thực vật mà phơng pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trởng ít có
hiệu quả hoặc không thực hiện đợc; làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn;
thu nhận các chất có hoạt tính sinh học; nguyên liệu cho chọn tạo giống tế bào
đột biến, chọn dòng tế bào chịu mặn, chịu bệnh và nghiên cứu hình thành cơ
quan.
Nuôi cấy phôi:
Nuôi cấy phôi vô tính hiện nay đợc xem nh một kỹ thuật mang lại nhiều
hiệu quả. Phơng pháp này đợc dùng để phá trạng thái ngủ nghỉ của hạt, thử
sức sống của hạt, duy trì phôi yếu.
13
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
dụng ở nồng độ cao hơn sẽ ức chế sự sinh trởng phát triển của mô nuôi cấy
[18]. Ngoài ra, các đờng khác nh Maltose, Glucose, Fructose... ít đợc sử
dụng.
Thành phần khoáng
Sau đờng, chất khoáng là nhóm dinh dỡng quan trọng không kém cho sự
phát triển in vitro. Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời
không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Cho đến nay rất
nhiều môi trờng dinh dỡng muối khoáng đợc tìm ra nh môi trờng MS
( Murashige và Skoog, 1962), môi trờng Knop (1974), Gamborg (1968)...
Trong đó, môi trờng MS đợc đánh giá là phù hợp nhất đối với đa số các loài
thực vật, nó chứa đủ thành phần khoáng đa lợng và vi lợng cho cây phát triển
[14]. Ngày nay, có nhiều môi trờng đợc cải tiến từ môi trờng MS.
Trong môi trờng nuôi cấy, nguồn Nitơ vô cơ đợc cung cấp dới dạng NO3và NH4+. Đồng thời có thể sử dụng các dạng nitơ hữu cơ nh axit amin. Một số
ít trờng hợp nitơ có thể đợc cung cấp dới dạng ure. Đối với photpho thì hai
dạng thờng dùng nhất là NaH3PO4.7H2O và KH2PO4. Nồng độ photpho trong
môi trờng biến thiên từ 0,15 - 4 mM. Nguyên tố Kali thờng đợc cung cấp cho
Khoa Công nghệ Sinh học
ánh sáng
ánh sáng có tác động mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào chu kỳ, cờng độ,
thành phần quang phổ của ánh sáng [17]. Cờng độ ánh sáng thích hợp cho
nhiều loại mô trong giai đoạn tái sinh là 2000 - 3000 lux.
Nhiệt độ
Tuỳ thuộc vào loài thực vật mà nhiệt độ nuôi cấy là khác nhau nhng nhiệt
độ thích hợp là 25 20C. Nhiệt độ này có ảnh hởng tích cực tới quá trình sinh
trởng và phát triển của đa số các loài thực vật nuôi cấy. Trong một số trờng
hợp, nhiệt độ lạnh lại có ảnh hởng tốt hơn chẳng hạn xử lý bao phấn lúa ở 4 0C
thì hiệu suất tạo mô sẹo sẽ tăng [13]. Nhiệt độ cao còn ảnh hởng tới sinh trởng
của các mô nuôi cấy thông qua tác động lên cấu trúc của các chất điều hoà sinh trởng thực vật nh phân huỷ IAA và GA [20].
Độ pH
Độ pH ảnh hởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dỡng vào tế
bào. Giá trị pH thay đổi làm thay đổi chiều hớng và tốc độ của nhiều phản ứng
sinh hoá, quyết định hấp thụ cation và anion của tế bào, ảnh hởng đến áp suất
Auxin là hợp chất chứa nhân indol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro,
auxin có tác dụng kích thích sinh trởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trởng
của mẫu thông qua hoạt hoá sự phân chia và làm giãn tế bào, kích thích quá
trình tổng hợp và trao đổi chất, điều hoà sự phân chia rễ và chồi. Nồng độ
NAA thấp sẽ dẫn tới sự hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới hình
thành mô sẹo. Tuy nhiên nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển của rễ. Các chất
thuộc nhóm auxin thờng dùng là IBA, NAA và 2,4-D.
ảnh hởng của Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trởng có tác dụng tăng sự phân chia tế
bào. Các cytokinin thờng gặp là BAP và kinetin. Trong đó kinetin là dẫn xuất
của bazơ nitơ adenin. BAP là cytokinin đợc tổng hợp nhân tạo. Chúng cũng có
tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào
phân sinh với sự phát triển chồi từ mô sẹo nuôi cấy. Nồng độ cytokinin thờng
đợc sử dụng là 0,5 - 2mg/l. Nếu nồng độ thấp hơn thì biểu hiện hiệu quả kích
thích kém, khả năng tạo chồi giảm. Ngợc lại, cytokinin ở nồng độ cao sẽ hoạt
hoá hình thành chồi bất định gây ra hiện tợng mọng nớc và kìm hãm quá trình
tạo rễ.
Trong nuôi cấy in vitro thì sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có tác dụng
quyết định đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô nuôi cấy. Các tỷ lệ
auxin/cytokinin khác nhau sẽ có tác dụng không giống nhau đối với sự phân
hoá của mô nuôi cấy. Nếu tỷ lệ này cao thì thích hợp cho hình thành rễ, còn
thấp sẽ hình thành chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho
phát triển của mô sẹo.
Ngoài auxin và cytokinin còn có nhiều chất điều hoà sinh trởng khác nh
Giberellin, etylen, axit ascorbic. Giberellin có tác dụng kích thích kéo dài tế
bào thực vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm. Với phơng pháp này
hoàn toàn có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều giữ nguyên đặc tính
của cây mẹ, có hệ số nhân giống và hiệu quả kinh tế cao, không tốn diện tích
nhân giống. Hiện nay, đã có nhiều quy trình nhân giống in vitro của nhiều loài
thực vật. Nhìn chung, các quy trình gồm 5 giai đoạn [11], [18]:
Giai đoạn 1: Chọn mẫu
Lựa chọn đối tợng (có thể là thân, lá, củ) thích hợp để làm mẫu. Kết quả
của quy trình phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của mẫu. Quan trọng nhất vẫn
là đỉnh sinh trởng, chồi nách, sau đó là hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ... Mô chọn
để nuôi cấy thờng là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ đợc các
đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định. Cây đợc chọn để lấy mẫu thờng
là cây u việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao. Tuỳ mục đích nuôi cấy và đặc tính
của loài mà chọn mẫu phù hợp. Bên cạnh đó phải chú ý tới tuổi mẫu, thời gian
lấy mẫu, mùa vụ.
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng
Mẫu phải đợc khử trùng trớc khi cấy vào môi trờng nuôi cấy. Việc khử
trùng mẫu trong điều kiện vô trùng sẽ làm giảm khả năng nhiễm bệnh của
mẫu nuôi cấy. Tuỳ theo sự tiếp xúc của mẫu với môi trờng mà lựa chọn hoá
chất, chế độ khử trùng cho phù hợp. Sau khi khử trùng, cấy mẫu vô trùng vào
môi trờng nhân tạo trong ống nghiệm hoặc trong bình nuôi. Các mẫu nếu
không bị nhiễm vi khuẩn, nấm hoặc virus sẽ đợc lu giữ trong phòng với nhiệt
độ, ánh sáng thích hợp, nếu là nuôi cấy mô sẹo thì đợc để trong tối. Sau một
thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào là mô
sẹo, hoặc cơ quan hoặc phôi vô tính có đặc điểm gần nh phôi hữu tính. Giai
đoạn này thờng kéo dài 2 - 12 tháng.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Thành phần và điều kiện môi trờng nuôi cấy phải đợc tối u hoá nhằm đạt
từ ống nghiệm ra phải đợc rửa sạch môi trờng bám vào rễ để tránh sự xâm
nhập của côn trùng và nấm mốc. Trong giai đoạn này, cần phải chăm sóc, bảo
vệ cây trớc những yếu tố bất lợi sau: Mất nớc nhanh làm cây bị héo, nhiễm vi
khuẩn và nấm, bị bệnh thối nhũn, cháy lá do nắng... Cần phải che phủ cây
bằng nilon, tới, phun sơng đảm bảo độ ẩm và làm mát. Giá thể trồng cây có
thể là đất, mùn ca và bọt biển. Giai đoạn này thờng đòi hỏi 4 - 16 tuần.
Với phơng pháp nhân giống in vitro, nuôi cấy mô thực vật đã góp một
phần rất lớn vào kết quả nghiên cứu của di truyền học, hoá sinh học, vi sinh
học, thể hiện tính u việt hơn so với phơng pháp nhân giống khác. Đồng thời đã
có những thành tựu mang ý nghĩa lớn không chỉ trong nghiên cứu mà còn có
ý nghĩa đối với cuộc sống của con ngời.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
18
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
Phần 3: vật liệu - nội dung - phơng pháp nghiên
cứu
3.1. Vật liệu nghiên cứu
Củ các giống khoai tây nhập nội:
- Giống Diamant: là giống khoai tây nhập nội, chọn lọc từ tập đoàn
19
Trơng Thị Phơng Chi
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
- Nhân chồi: Mẫu sạch thu đợc ở trên đợc cấy vào môi trờng MS cơ bản,
bổ sung agar 1%, saccarose 2% và -NAA riêng rẽ nồng độ từ 0,05mg/l đến
0,40mg/l. Các bình nuôi cấy đợc đặt trong phòng cấy với nhiệt độ 25oC 2oC ,
dới ánh sáng đèn huỳnh quang khoảng 3000 lux. Mỗi công thức 15 bình
(khoảng 100 cây) nhắc lại 3 lần. Đánh giá khả năng nhân chồi qua các khoảng
thời gian 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần nuôi cấy.
- Tạo củ: cây khoai tây invitro có chiều cao từ 4cm - 5cm với 5 lá - 6 lá
(sau khoảng 3 tuần) sẽ đợc sử dụng để tạo củ. Chất cảm ứng tạo củ là BAP ở
các nồng độ khác nhau 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 10,0; 10,5(mg/l). Sử dụng nền môi
trờng MS cơ bản (nh phần phụ lục), saccarose 2%, nớc dừa 15%. Các bình sau
khi bổ sung chất cảm ứng tạo củ đợc đặt trong buồng tối nhiệt độ 25 oC 2oC.
Các thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi công thức 15 bình (khoảng 100 cây).
Các thí nghiệm :
*) Thí nghiệm 1: ảnh hởng của thời gian chất khử trùng đến khả năng
sống của mầm không bị nhiễm (HgCl2 1%).
Thí nghiệm gồm 6 công thức:
+ Công thức 1: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 3 phút.
+ Công thức 2: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 4 phút.
+ Công thức 1: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,05 mg/l
- NAA.
+ Công thức 2: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,10 mg/l
- NAA.
+ Công thức 3: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,20 mg/l
- NAA.
+ Công thức 4: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,30 mg/l
- NAA.
+ Công thức 5: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,40 mg/l
- NAA.
*) Thí nghiệm 4: ảnh hởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo củ
khoai tây siêu bi nuôi cấy trong ống nghiệm.
Thí nghiệm gồm 7 công thức:
+ Công thức đối chứng: môi trờng MS + 2% saccarose.
+ Công thức 1: môi trờng MS + 2% saccarose + 7,5 mg/l BAP.
+ Công thức 2: môi trờng MS + 2% saccarose + 8,0 mg/l BAP.
+ Công thức 3: môi trờng MS + 2% saccarose + 8,5 mg/l BAP.
+ Công thức 4: môi trờng MS + 2% saccarose + 9,0 mg/l BAP.
+ Công thức 5: môi trờng MS + 2% saccarose + 10,0 mg/l BAP.
+ Công thức 6: môi trờng MS + 2% saccarose + 10,5 mg/l BAP.
Mỗi công thức trong các thí nghiệm tiến hành với 15 bình, mỗi bình 5
mẫu, lặp lại 3 lần. Tiến hành theo dõi định kỳ 7 ngày 1 lần.
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đợc bố trí trên một giàn nuôi, các thí nghiệm đợc sắp xếp
ngẫu nhiên theo khoảng cách nhất định. Mỗi thí nghiệm đợc nhắc lại 3 lần,
mỗi lần nhắc gồm 15 bình.
3.4. Các chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu cấy) x 100
Trờng Cao đẳng Nông Lâm
Khoa Công nghệ Sinh học
PHầN 4: KếT QUả Và THảO LUậN
4.1. Kết quả nghiên cứu thời gian và nồng độ chất khử trùng
Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, phơng pháp khử trùng là rất quan trọng, nó
quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Tuỳ theo sự tiếp
xúc của mẫu với môi trờng mà nó chứa nhiều hay ít mầm bệnh vi sinh vật nh
nấm, vi khuẩn Vì vậy cần phải có chế độ khử trùng hợp lý cho kết quả tốt
nhất. Phơng pháp khử trùng mẫu cấy thông dụng nhất là dùng các hoá chất có
khả năng tiêu diệt vi sinh vật nh: Canxi hypoclorit, Natri hypoclorit, Clorua
thuỷ ngân, nớc Javen, chất kháng sinh.... Hoá chất đợc sử dụng làm chất khử
trùng mẫu cần đảm bảo hai đặc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không
độc hoặc độc ở mức độ thấp với thực vật. Chế độ khử trùng tốt nhất cần đảm
bảo vô trùng, tỉ lệ mẫu nhiễm thấp, tỉ lệ mẫu sống cao, mẫu có khả năng phân
hoá sinh trởng và phát triển tốt. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ
thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các
kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy. Thông thờng ngời ta xử lý mô cấy bằng
cồn 70% trong vòng 30 giây sau đó mới xử lý diệt khuẩn.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khử trùng mẫu các mầm
khoai tây khoẻ có kích thớc từ 1,5cm - 2,0cm bằng cồn 70% trong thời gian 1
phút, sau đó xử lý dung dịch HgCl 2 1%, trong các khoảng thời gian 3 phút đến
8 phút, tráng lại mầm bằng nớc cất vô trùng. Mầm đã khử trùng đợc cấy vào
môi trờng MS cơ bản, bổ sung agar 1% và saccarose 2%. Sau 1 tuần nuôi cấy,
chúng tôi đã thu đợc bảng kết quả sau:
Bảng 4.1. ảnh hởng của thời gian khử trùng đến khả năng sống của
Khoa Công nghệ Sinh học
42,4
54,5
71,6
82,3
75,3
42,5
Kết quả trên đợc thể hiện ở hình 4.1
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hởng của thời gian khử trùng đến khả năng
sống của mầm không bị nhiễm.
Kết quả cho thấy, thời gian khử trùng cho các giống khoai tây trong nuôi
cấy in vitro bằng HgCl2 1% khác nhau thì cho ra tỷ lệ sống của mầm không bị
bệnh khác biệt nhau rõ rệt.
Khi khử trùng mẫu ở công thức 1 (cồn 70 o trong 1 phút và HgCl2 1% trong
3 phút ) cho tỷ lệ sống của mầm không bị bệnh là thấp nhất: giống Solara là
45,3% và Diamant là 42,4%. Giữ nguyên thời gian khử trùng với cồn 70o trong
1 phút và tăng thời gian khử trùng với HgCl2 1% lên 6 phút (công thức 4) nuôi
cấy trên môi trờng MS cơ bản có bổ sung thêm agar 1% và saccarose 2% thì
thấy tỷ lệ sống của mầm không bị bệnh ở 2 giống đạt hiệu quả cao nhất:giống
Diamant là 82,3% và giống Solara là 81,6%.
Nh vậy, để thu đợc mầm
sống cao nhất đáp ứng điều kiện vô trùng trong nuôi cấy in vitro nên chọn khử
trùng mẫu bằng công thức 6 thời gian khử trùng với cồn 70 o trong 1 phút và
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
tuần
Solara
Diamant
5,00
4,25
10,83
11,25
34,81
33,62
1,00
1,50
81,33
40,09
83,18
36,27
Kết quả trên đợc thể hiện ở hình 4.2
Báo cáo thực tập tốt nghiệp
25
Trơng Thị Phơng Chi
Copyright: Tài liệu đại học ©