ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG
CỦA MỘT SÔ CHẤT PHYTOHORMONE LÊN
QUA TRÌNH VI NHÂN GIÔNG MỘT số
DÒNG LÚA BẤT DỤC Đực
(PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC LÚA LAI)
MÃ SỐ : QT. 99-11
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI : Đỗ VĂN CÁT
Cán bỏ tham gia:
TS. Đỗ Năng Vịnh
TS. Hoàng Tuyết Minh
HÀ NỘI, THẢNG 10-2000
PTỊ m í
MIC 1,1 (
Mo (láII
ỊMián I
INlii'1 II II
iMnán III
IMnán IV
lMnán V
pỉnán VI
‘I ran
I
: I 011 quan lài IiC'11
I Tinh hình Iighiõn cứu nuôi CÁV mô-tô hào trên thô
£>iới và Irong nước.
II. Các nhân tô anh hướng lèn qua 1 rình phát sinh 4
hình thái mô-le hào Ihưc vãi invitio.
1. Môi trường
2. Điều kiện miõi cáy

BAP: Ren/.yl Amino 1’urinc
IRRI: International Rice keseaeli Instiluie
I-MTH: I /íp mỏng 10' bào
T(ÌM S: T herm osen sitive ( ỉciiic Malc Slorilỉty
\v/v: Tiọng lượiiỊi/lhổ lú li
AON: Axii deroxyribonik leic
( ( 'Ang sir
MỞ ĐẦU
Lúa lai đã trở thành vấn đề thời sự trong nông nghiệp không chỉ ở
nước ta mà ở khắp các nước trổng lúa trên thê giới. Nhờ đưa lúa lai vào
sản xuất mà sản lượng lúa của Trung quốc tăng lên gấp bội, Trung quốc
đã giảm được 50% đất trổng lúa để trổng các cãy nông nghiệp khác. Lúa
lai cũng nhanh chóng được nhập nội vào nước ta vì năng xuất của lúa lai
vượt trội hơn so với lúa thường từ 20 -30% ; Do vậy việc nghiên cứu và tạo
ra các dòng lúa lai là vấn đề cấp thiết. Nhà nước ta đã chi hàng nhiều tý
đồng để nghiên cứu, tạo ra các dòng lúa lai của việt nam; Kết quá về vấn
để này chưa nhiều.
Vấn đề đặt ra là tại sao công nghệ lúa lai lại tiến bộ chậm trễ như
vậy ? Lý do vì tạo ra các dòng mẹ bất dục đực và các con lai F1 có nhiều
khó khăn, năng suất của chúng quá thấp. Tuy vậy trong những năm qua
các nhà khoa học Việt nam cũng đã thu được một số kết quả trong ITnh
vực này; Đã chọn tạo được một số dòng TGMS bất dục đực do gen nhãn
nhạy cảm với nhiệt độ gây ra; phục vụ cho công nghệ lúa lai hai dòng. Đã
chuyển các gen TGMS vào các giống lúa thường có nhiều đặc điểm tốt;
Kết hợp với nuôi cấy bao phấn đê tạo ra các dòng TGMS mới có nhiều ưu
việt hem. Nếu chọn tạo theo phương pháp thông thường phái trải qua nhiều
thế hệ chưa chắc đã nhận được các dòng theo ý muốn, hơn nữa dòng vừa
nhận được không hoàn toàn thuán chủng.
Khí hậu ở miền bắc nước ta chỉ cho phép sản xuất hạt chứa gen
TGMS vào hai thời vụ ( vụ xuân sớm và vụ thu đông ). Thời tiết lại luôn

Từ năm 1965 - Nickell đã thành công trong việc nuôi cấy các tế bào
đơn trong dịch huyền phù của cây đậu trong thời gian dài. Năm 1960
Bergman dùng phương pháp lọc dịch huyền phù, được những tế bào đơn
độc lập, những tế bào này tiếp tục phân chia, tạo ra mô sẹo. úng dụng kỹ
thuật này Váil và haberlandt (1965) đã nhận được cây thuốc lá hoàn chỉnh
từ các tế bào đơn nuôi cấy.
Vào đầu những năm 70 các nhà khoa học Nhật bản Nagata và
Tanaka đã tách và nuôi cấy thành công tế bào trần (protoplast) của cây
thuốc lá. Từ đó mở ra một lĩnh vực cực kỳ quan trọng trong công nghệ
sinh học là lai xa giữa các tế bào soma. Bằng phương pháp dung hợp tế
bào trần của các loài rất xa nhau. Nhờ phương pháp dung hợp tế bào trần
người ta có thê chuyển các gen, đoạn gen mong nuốn từ tế bào này sang tê
bào khác. Tê bào trần đã trở thành một công cụ không thể thay thế để
nghiên cứu vai trò của ADN trong các cơ quan tử và quan hệ giữa chúng
với ADN trong nhân.
Trong những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào
trần gắn chặt với các nghiên cứu về công nghệ di truyền thực vật. Đê
chuyển các gen từ tế bào này sang tế bào khác, người ta thường dùng các
plasmid của vi khuẩn làm vật chuyển vận; Người ta lắp ghép các gen định
chuyển vào plasmid của vi khuẩn và nuôi các ci khuẩn này với mô của cây
cần nhận gen. Bằng phương pháp này các nhà khoa học đã thành công
trong việc chuyển các gen mong muốn vào nhiều cây quan trọng như
bông, thuốc lá, dưa chuột
3
lượng không đầy đủ (Bhojwani và Razdan 1983). Vì vậy người ta thường
phải bổ sung vào môi trường một sô vitamin như Thiamin, piridoxin,
nicotinic axit, pantotenic axit (vitamin bs); Tuỳ theo giai đoạn, và đôi
tượng nuôi cấy.
Vitamin c đôi khi được bổ sung vào môi trường với hàm lượng cao
( 1-lOOmg/l) không có nghĩa là cãy đòi hỏi nhu cầu lớn như vậy, mà nó

Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu thường sử dụng môi trường có các
tổ hợp các chất auxin/ xitokinin cao sẽ kích thích mô phát triển rễ, trái lại
tý lệ này thấp sẽ gây phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức trung gian mô sẽ
phát triển thành mô sẹo. Hiện tượng này thường gặp trong nuôi cấy mô
thuốc lá (Street,, 1979), đậu hà lan (Harvinder,l990)(8).
Người ta thấy xitokinin tham gia điều hoà sinh trưởng ở tất cả các
pha phát triển của cây từ khi hạt bắt đầu nảy mám đến khi cây hoá già
(Heiđe,! 972). Nó kích thích sứ tạo chồi nách bằng việc làm giảm tính trội
5
chồi cao nhất. Đặc biệt trong môi trường nuôi cấy rễ củ sâm ks sự có mặt
của nước dừa đã làm cho tác dụng của các hoimone sinh trưởng tăng lên
rõ rệt. Tác dụng của nước dừa có lẽ là do ảnh hưởng của hỗn hợp các chất
tham gia điều hoà sinh trướng lên mõ nuôi cấy.
2. Điều kiện nuôi cấy ;'
a. Ảnh sáng
Ánh sáng có tác dụng mạnh mẽ lên sự phát sinh hình thái trong quá trình
phát triển của mô nuôi cấy invitro. Sự phát sinh hình thái của các mô nuôi
cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tô như: chu kỳ, cường độ và thành phần
quang phổ của ánh sáng.
Một chu kỳ xác định (16 giờ sáng/ 8giờ tối) tương phán với sự
nuôi cấy liên tục trong ánh sáng hoặc trong tối hoàn toàn là cần thiết cho
sự tái sinh chổi ở các mẫu mô phong lữ (Ammirato 1986). Chu kỳ chiếu
sáng cũng có vai trò quan trọng trong quá trình tạo hoa và tạo củ trong
nuôi cây invitro. Sự có mặt của ánh sáng hay khồng cũng ánh hưởng mạnh
mẽ lên sự phát sinh và phát triển của phôi sôma. Nuôi cấy hoàn toàn trong
tối đả làm giám thấp tần sô biến dị của phôi cây cà rốt. 0 cà rốt và cây
cần nước nuôi trong tối sẽ làm phôi bị vàng úa, trái lại trong ánh sáng,
phôi sôma của chúng sẽ tái sinh cây hoàn chỉnh( Ammirato 1986).
Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự phát sinh hình thái cũng
được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu; người ta thấy rằng ánh sáng đỏ

Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng bao phấn con lai F1 của tổ hợp lúa
lai o Peiai 64S X 0*1225 để thu nhận các dòng TGMS thuần chủng mới.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu (í
1. Xử lý mẫu vật í '
Các mẫu vật được đưa vào nuôi cấy đều được rửa sạch bằng nước
cất, khử trùng sơ bộ bằng cồn 75% trong vòng một phút, tiếp theo khử
trùng bằng H20 2 iO% trong 15-20 phút hay bằng HgC12 0,1% trong vòng
3-5 phút. Sau đó mẫu được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và đưa vào
môi trường nuôi cấy thích hợp.
2. Môi trường nuôi cấy ó
Môi trường gốc dùng cho các thí nghiệm là môi trường thạch rắn
(0,8% thạch) được chuẩn bị theo công thức của Murashige-Skoog (1962)
viét tắt là MS và môi trường LS (Linsmaier-Skôg 1965).
Trong đó thành phần nồng độ các chất phytohormone thuộc nhóm
auxin và xitokinin và các chất phụ gia được thay đôỉ tuỳ vào mục đích của
từng bước thí nghiệm.
3. Điều kiện nuôi cấy é
Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy luôn được duy trì khoảng từ 22-
25°c, chiếu sáng 10 giờ/ngày đêm bằng hệ thống giàn đèn neon. Riêng
việc nuôi cấy tạo mô sẹo được nuôi trong buồng tối.
9
Phần III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I. KHẢ NĂNG TẠO MỎ SẸO c
1. Tạo mỏ sẹo từ phôi chín và phói non^
Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên khả năng tạo mô sẹo ở
phôi chínỊHạt gạo) và phôi non (hạt đang còn sữa) của các dòng VN.01 ;
40s có chứa gen TGMS gây bất dục đực nhạy cảm với nhiệt độ. Các hạt
gạo và phôi non đã vô trùng của hai dòng lúa trên được cấy lên môi trường
MS có liểu lượng 2,4D thay đổi từ : 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0mg/l. Mẫu vật được

Embryogenic callus). Mô sẹo cứng có màu trắng, sữa, khô, khi cấv
chuyển lên môi trường tái sinh, nó dính chặt trên mặt thạch. Còn mô xốp
10
Chúng tôi nghiên cứu anh hường của các tỷ lệ Xitokinin/auxin lên
khá năng tái sinh chổi. Các khối mô sẹo có kích thước bằng nhau được
cấy lên các môi trường MS2, MS3, MS4 (xem phụ lục) có bổ sung nồng
độ xitokinin/auxin tương ứng với các tỷ lệ sau : 2/1 ; 2,5/1 ; 12/1. Sau đó
các mẫu được nuôi trong phòng nuôi.
Sau 3 tuần nuôi cấy, kết quá thu được trình bày ở báng 3:
Hảng 3 : Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khá năng tái sinh cây từ
mô sẹo.
_____
__________________
_________________ _________________ ________
_
_____
_
Tên
dòng
VN-01
8S
9S Zs.97A
Môi
trường
Sô mô
sẹo
đem
cấy
Tỷ lệ
tái

29 75,8
MS3 38
100
28 100 28 96,4
30
83,3
MS4
32 96,8 31 93,5 26 88,4
27
74,0
Qua bảng này ta thấy trong môi trường MS.3 (Tỷ lệ xitokinin/auxin
2,5/1) là môi trường tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất ở tất cả các dòng
nghiên cứu. Trên môi trường này các dòng VN.01 ; 8S tỷ ỉệ tái sinh chồi
đạt 100% còn dòng 9S đạt 96,4% ; dòng Zs.??chỉ đạt 83,3%, nhưng cũng
đểu cao hơn trong môi trường MS.2 và MS.4 (75,8%, 74%).
Các dòng VN.01, 8S tỷ lệ tái sinh ở tất cả các môi trường chúng đều
xấp xỉ bằng nhau, đều cao hơn tỷ lê tái sinh chổi của 2 dòng kia 9S và
Zs.97A trong các môi trường tương ứng.
Theo tiến sĩ Hoàng Tuyết Minh cho biết 2 dòng VN.01 và 9S bản
thân chúng có khả năng đẻ nhánh cao. Điều đó lý giải về khả năng tái sinh
chồi cao trong nuôi cấy chúng.
Trong môi trường MS.2 ; MS.3 ; MS.4 có bổ sung nồng độ
xitokinin/auxin khác nhau là 2/1 ; 2,25/1 ; 12/1, các tỷ lệ này có ảnh
hưởng rõ rệt lên khả năng tái sinh chổi của các dòng.
Môi trường MS.3 (2,25 xitokinin/lauxin) cho tỷ lệ tái sinh chổi tốt
nhất đối với tất cả các dòng lúa nghiên cứu. Còn môi trường MS.2 ; MS.4
cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp hơn nhiều. Có lẽ trong các môi trường này
nồng độ xitokinin quá cao ở môi trường MS.4 và quá thấp ở môi trường
MS.2 không thích hợp cho việc tái sinh chồi. Vì vậy việc tìm ra tỷ lệ
xitokinin trên auxin thích hợp cho việc tái sinh, nhân chồi là hết sức cần

vào vào
vào
MS.S
}\
4,4 Mì
. A ? __
34
4,2
25
3,8
MS.9
31
4,8 _
30 4,5
35 4,6
25 4,3
MS.K) 31
4,2
30
4,1
37
3,9
25
3,0
<a)u;i hãng 11,hy ta thÃy trên mối trườngMS.R (có lmg/1 (X-NAA) hộ
sò itliAii rliổi của e.íc dòng VN-OI, 8S, 9S và (lòng Zs.97A tirơiig ứng chỉ
<l;tt '1.1 : 4.2 : 4,1 ; 3,8 IÀH. Trong khi đó ở môi trường MvS.9 có nồng độ (X-
NAA l,ì 1,5mg/l thì hệ số nhAn cliổi của tAt cả các (lòng tương ứng (1ỔII
VH'<Í| (lòi so với 2 niAi tnrờng kin là 4,8 ; 4,5 ; 4,6 ; 4,3 lẩn.
I lìílp Iihíìt là mỏi Inrờnp MS. 10 khi uổng độ a-NAA tăng lên

chổi
cấy
vào
Tỷ lệ
tao rễ
(%)
Số
chồi
cấy
vào
Tỷ lệ
tao rễ
(%)
Số chồi
cấy
vào
Tỷ lệ
tao rễ
(%)
MS
50 98 50
98
50
96
50
96
LS 50 100
50 100 50 100 50 100
V. TẢI TAO CÂY LÚA TỪ MỔ SEO CỦA DAO PHẤN F1 CỦA T ổ HƠP LAI
y PHIAI 6 4 S X O 1 2 2 5.

(cm)
Chiêu dài
cổ hông
(cm)
Chiều dài
bông (cm)
Đoạn bông
nghẹn so với
chiểu dài bông
Sô hoa trôn
hỏng chính
1 71,9+1,8
-S,x
23.3 + 2,2 24,0
148
1 1
79,2 + 2,1
-5.Í1
20,4 + 2,5
27,5
143
17 68,7 + 3,5
-5.S
l‘),7 + 1,8
2‘),4
135
22 80,2 + 2,4
-5.4
20.1 + 1,6 26,‘)
141

Plant tissue and cell culture. Blackwell Scientific publication, p 39-
51.
ọ
9. Sxvaminathan, 1984.
Tissue culture and Third World agriculture. Problems and potential,
in tissue culture technology and development centre for Science and
technology for development. Unite nation.
10.Heide Ola M.,1972.
The role of Cytokinin in regenerations processes. In Hoimonal
Regulation in plant growth and development. Proc. Adv. study inst. ỉzmir.
p. 207-219.
1?
PHỤ LỤC
I hììnli pliíỉn dinh (lưỡng mAi trường cơ bòn MS (Murashige and Skooịĩ, 1962)
riiònli phỉìn
Ilàm lượng (itig/1)
K hoátiỊi đa lương
KNO,
NĨI.NO,
CaCI2. 2II2C)
MjỉS( ),. 7H2()
K HịK ),,
FcS( )„. 7HjO
Na2EDTA
khoáng, vi lương
MiiS()4. 4H2()
/ iiSO,. 7Hj()
lí,no,
KI
CtiSO, 5Mj()

PHỤ LỤC
NHŨNG MÔI TRUỒNG SỬDỤNG TRONG BÁO CÁO NÀY
Ký hiệu
môi
trường
Môi
trường cơ
bản
Phytohormone
2,4D (mg/1)
Kinetin
(mg/1)
(X NAA
(mg/1)
PAP
(mg/1)
MSI
MS
2 1
1
MS2 MS
1
1
1
MS3
MS
2 1
0,25
MS4
MS

4. Hạt phấn hữu thụ
AM1
ấẮ®*;
.í. «
5. Hạt phấn bất thụ
6. Hạt pliấn của cAy nghi là Tam bội
PHIẾU ĐẢNG KÝ
KẾT QUẢ NGHIÊN cứu KH-CN
Téĩm đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của một sỏ chất phytohormon lên quá
trhmh vi nhân giống một sô dòng lúa bất dục đực.
M lãisố: QT-99-11
Cơ t (quan chù trì đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Điaa chỉ:
334 Nguyễn Trãi, Quận Thanh xuân - Hà nội.
Điệệm thoại:
8.585277
Cơ i tquan quản lý đề tài:
Đại học Quốc gia Hà Nội
Km8 đường Xuân Thuỷ, Cầu giấy Hà Nội.
ĐitệỆm thoại:
8.340564
Tô>nn<ig kinh phí thực hiện:
7.000.000đ
Trooing đó: - Từ ngân sách nhà nước:
7,0 triệu đổng, hoặc
USD.
- Kinh phí của Trường:
tr.đ
USD
- Vay tín dụng:

Các dòng bất dục đực nhận được cần được tiếp tục nghiên cứu có khả nâng ứng
dụng được vào thực tiễn chọn giông.
Chủ nhiệm để tài
Thủ trưởng cơ quan
Chủ trì để tài
Chủ tịch Hội đồng
đánh giá chính thức
Thủ trưởng cơ quan
Quản lý đề tài
Họ và tèn:
Đỗ Văn Cát
Nguyền Ngọc Long
1
ỈA ilo rỵ ỹ $JưQOữ(fac.
'k u V r^ G L u a n c Ị ỊÌq c
Học vị: GVC
PGS.TS
Pér
1S H K
p & n u e
Ký tên:
* t ì v Ẵ
Đóng dấu
.
ị
KMOA-HpTT Ị
Vy TỤ NHtf;N , ý'