BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG
THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)
BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN
TẾ BÀO UNG THƢ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2016


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG
THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)
BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và GS.TS Nguyễn Công
Hào đã định hƣớng khoa học, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Xin gởi đến Thầy những lời biết ơn chân thành nhất.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của TS. Trần Ngọc Quyển và những anh chị trong Viện
Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Công nghệ Hóa
học trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án.
Sau cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên,
giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án này.

ii


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ..........................................................................................4
1.1

GIỚI THIỆU DENDRIMER .............................................................................4

1.1.1

Khái niệm về dendrimer ..............................................................................4

1.1.2

Tính chất của dendrimer..............................................................................6

1.1.3


Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân hƣớng

đích – acid folic .....................................................................................................25
1.4

PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ CỦA

DENDRIMER VÀ DẪN XUẤT ...............................................................................28
1.4.1

Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất dựa vào phổ MALDI-

TOF-MS (WtMALD) ................................................................................................ 28
1.4.2

Xác định khối lƣợng phân tử polymer dựa vào phổ 1H-NMR ..................30

1.4.3

Một số phƣơng pháp khác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất .......30

CHƢƠNG 2 - NGHIÊN CỨU ......................................................................................32
2.1 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................32
iii


2.1.1

Nội dung nghiên cứu .................................................................................32

3.1.2

Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối

lƣợng MS ...............................................................................................................79
3.1.3

Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR
…………………………………………………………………………...80

3.2

BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM VỚI TÁC NHÂN ALKYL ................84

3.2.1

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .............................84

3.2.2

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..........................91

3.2.3

Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ......................................95

3.2.4

Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ................................ 99


DẪN XUẤT ............................................................................................................116
3.7

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC .................................117

3.7.1

Khảo sát khả năng mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil
………………………………………………………………………….117

3.7.2

Khảo sát khả năng nhả thuốc ..................................................................119

KẾT LUẬN .................................................................................................................120
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................122
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ............123
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Đánh giá khối lƣợng phân tử PAMAM và dẫn xuất dựa vào MALDI-TOF-MS [77]
.......................................................................................................................................29
Bảng 1.2: Khối lƣợng phân tử tính toán theo lý thuyết (WtLT) của các dendrimer
PAMAM từ G-0.5 – G3.0 [1, 98] ................................................................................31


với dodecylamine.........................................................................................................101
Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5
với alkylamine .............................................................................................................103
vi


Bảng 3.16: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ...................104
Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm G3.0-FA .........................................106
Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA ...110

vii


DANH MỤC CÔNG THỨC

Công thức 2.1: Công thức tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa trên phổ 1H-NMR
.......................................................................................................................................41
Công thức 2.2: Công thức tính độ chuyển hóa của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0
thông qua phổ 1H-NMR .................................................................................................44

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [2] ......................................................................4
Hình 1.2: Các thế hệ dendrimer [4] ................................................................................5
Hình 1.3: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là EDA thế hệ chẵn .............................5
Hình 1.4: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là hexane diamine thế hệ lẻ .................6
Hình 1.5: Các dạng phân bố dendrimer trong dung dịch [8] ..........................................7
Hình 1.6: Kích thƣớc của dendrimer và kích thƣớc các vật chất trong cơ thể [8] .........8

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.0 ...............75
Hình 3.5: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.5 ...............75
Hình 3.6: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.0 ...............76
Hình 3.7: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.5 ...............77
Hình 3.8: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G3.0 ...............78
ix


Hình 3.9: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z ...................................84
Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h (G3.0-C10)
.......................................................................................................................................87
Hình 3.11: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z .................................91
Hình 3.12: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol ................................ 95
Hình 3.13: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine ..........................99
Hình 3.14: Cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G 3.0-FA ..................................105
Hình 3.15: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA ....................106
Hình 3.16: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA ..............................109
Hình 3.17: Phổ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA ................................109
Hình 3.18: Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu ........................114
Hình 3.19: Kết quả TEM của Dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer
PAMAM G3.0-C6 .......................................................................................................116
Hình 3.20: Kết quả TEM của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA và G3.0-C6-FA
.....................................................................................................................................116
Hình 3.21: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0.....118
Hình 3.22: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dẫn xuất dendrimer PAMAM
G3.0-C6-FA .................................................................................................................118

x



Sơ đồ 2.7: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA .............................39
Sơ đồ 2.8: Các sản phẩm không mong muốn của phản ứng biến tính dendrimer
PAMAM G3.0 với acid folic .........................................................................................40
Sơ đồ 2.9: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5...........................................51
Sơ đồ 2.10: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0 ..........................................52
Sơ đồ 2.11: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5 ..........................................53
Sơ đồ 2.12: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5 ..........................................55
Sơ đồ 2.13: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0 ..........................................56
Sơ đồ 2.14: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride ..............57
Sơ đồ 2.15: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..........60
Sơ đồ 2.16: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol .......................62
Sơ đồ 2.17: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với amine .........................64
Sơ đồ 2.18: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với FA ..............................66
Sơ đồ 2.19: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hecxanoyl chloride và FA
.......................................................................................................................................67
Sơ đồ 2.20: Quy trình nang hóa thuốc 5-FU của dendrimer PAMAM ........................69
Sơ đồ 2.21: Quy trình nhả thuốc 5-FU của dendrimer-5FU .........................................70

xii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ac

Acetyl

ADN

Acid Deoxyribonucleic


Ethylendiamine

EDC

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

EGFR

Epidermal Growth Factor Receptor

EPR

Enhanced Permeability And Retention Effect

5-FU

5-Flurouracil

FA

Acid folic

FAR

Folate Receptor

FITC

Fluorescein Isothiocyanate


LC-MS

Liquid chromatography-mass spectrometry

MA

Methyl acrylate

MPEG

Methoxy polyethylen glycol

MS

Mass Spectroscopy

MRI

Magnetic Resonance Imaging
xiii


NHS

N-Hydroxysuccinimide

NMR

Nuclear Magnetic Resonance


Với mục đích điều trị hiệu quả, các nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc điều trị
ngay tại các tế bào ung thƣ và giảm thiểu sự nguy hại đối với các tế bào lành của cơ
thể, y học gọi phƣơng pháp này là điều trị hƣớng đích (Targeted Therapy). Phƣơng
pháp điều trị hƣớng đích mở ra một hƣớng mới trong quá trình điều trị ung thƣ.
Phƣơng pháp này liên quan đến việc sử dụng những loại dƣợc phẩm có khả năng tấn
công một cách đặc biệt đối với các tế bào ung thƣ [1-4]. Khả năng phân biệt tế bào ung
thƣ và tế bào bình thƣờng giúp cho phƣơng pháp điều trị hƣớng đích trở thành một
phƣơng pháp điều trị đƣợc lựa chọn ngày nay.
Các dendrimer đƣợc quan tâm sử dụng nhƣ chất mang thuốc hƣớng đích trong
điều trị ung thƣ. Dendrimer là một loại nano polymer có nhiều đặc điểm nổi bật phù
hợp với vai trò một chất mang với cấu trúc phân tử dạng hình cầu, nhánh bên trong có
nhiều không gian trống, có nhiều nhóm thế hoạt động ở bề mặt. Tuy nhiên, những
nhóm chức hoạt động ở bề mặt dendrimer lại tƣơng tác hóa - sinh học với các tế bào
trong cơ thể do đó chúng gây độc cho tế bào. Nhằm khắc phục những hạn chế trên và
để cải thiện một số tính chất hỗ trợ cho việc mang thuốc đúng nơi và hiệu quả thì bề
mặt dendrimer đƣợc biến tính bằng một trong các tác nhân tƣơng hợp sinh học nhƣ
ankyl, PEG (Polyethylene Glycol), … kết hợp tác nhân hƣớng đích nhƣ acid folic,
peptide RGD (Arg-Gly-Asp), Anti-EGFR (epidermal growth factor receptor) và kháng
thể Anti-HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor), biotin, ... thông qua các
liên kết hóa học [3, 5-12].
Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
tổng hợp hệ chất mang thuốc nano polyamidoamine (PAMAM) biến tính có khả năng
hướng đích đến tế bào ung thư”.

1


Mục tiêu của luận án
Tổng hợp các thế hệ dendrimer PAMAM và biến tính bề mặt dendrimer
PAMAM bằng các tác nhân alkyl hóa và tác nhân hƣớng đích (acid folic) nhằm mục


-

Phát hiện mới về phổ 1H-NMR trong việc đánh giá khối lƣợng phân tử
dendrimer có ý nghĩa quan trọng trong việc vận dụng, đánh giá quá trình tổng
hợp chuyển hóa các hợp chất, thuốc, ...

3


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU DENDRIMER
1.1.1 Khái niệm về dendrimer
Khái niệm dendrimer đƣợc Donald A. Tomalia và cộng sự [13] đƣa ra đầu tiên
vào năm 1985. Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “Dendron”, có nghĩa là nhánh
cây. Dendrimer là một nanopolymer có dạng hình cầu, cấu trúc nhánh, có nhiều tính
chất ƣu việt hơn so với polymer mạch thẳng.

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [14]
Phân tử dendrimer đƣợc cấu tạo ba phần gồm: lõi (còn gọi là nhân hoặc core), các
nhánh bên trong và các nhóm bề mặt bên ngoài. Các nhánh bên trong đƣợc lặp đi lặp
lại có nhiệm vụ liên kết các nhóm bên ngoài với lõi. Các nhóm bên ngoài còn đƣợc gọi
là các nhóm bề mặt hoạt động (hình 1.1)[14-16].
Dendrimer có các đơn vị nhánh liên tiếp lặp đi lặp lại hƣớng ra ngoài từ điểm nút
khởi đầu. Một dendrimer có hai điểm nút khi đi từ trung tâm đến ngoại vi đƣợc gọi là
dendrimer thế hệ thứ 2 (ký hiệu là G2.0) [14].

4

D: Đƣợc gọi là chỉ số phân tán, đặc trƣng cho độ phân tán của một mẫu
polymer.

-

Mn: Khối lƣợng phân tử trung bình số.

-

Mw: Khối lƣợng phân tử trung bình khối.

-

Mw > Mn: mẫu polymer đa phân tán. Khi D càng lớn thì mẫu polymer
càng phân tán.

Trong dung dịch các dendrimer thƣờng tồn tại ở các dạng sau:
6


-

Dạng monomer, dimer, trimer (hình 1.5a).

-

Kết thành chùm có hình dạng méo mó (hình 1.5b).

-



8


Hình 1.7: Các hình thức mang thuốc của dendrimer [21]
Một trong những ý tƣởng để giải quyết vấn đề này là đƣa thuốc trực tiếp vào vị
trí cần phát huy tác dụng (cơ quan, tế bào hoặc các thành phần của tế bào), tạo ra một
loại thuốc có tính chọn lọc cao vào một cơ quan nào đó trong cơ thể. Thuốc sẽ phát
huy tác dụng khi đƣợc hấp thu qua màng tế bào. Có nhiều con đƣờng để thuốc hấp thu
qua màng tế bào nhƣ khuếch tán trực tiếp qua lớp lipide, khuếch tán qua các lỗ xuyên
qua lớp lipide, khuếch tán qua màng nhờ chất mang hay sự ẩm bào. Đối với các loại
thuốc gây độc tế bào nhƣ thuốc trị ung thƣ thì đƣợc hấp thu qua màng tế bào nhờ một
hệ vận chuyển thuốc, do đó việc ra đời của chất mang thuốc là một liệu pháp mới
trong điều trị ung thƣ. Các chất mang thuốc có tác dụng nhƣ một giá đỡ cho thuốc,
giúp thuốc tránh khỏi sự đào thải bởi các các cơ chế bảo vệ của cơ thể (chuyển hóa ở
gan, thải trừ qua thận, phân huỷ bởi các enzyme trong máu, tấn công của bạch cầu và
hệ thống miễn dịch....). Các chất mang còn giúp phân tử thuốc đến đƣợc đích tác dụng
mong muốn. Tiêu chí quan trọng nhất đối với các chất mang đó là tính tƣơng hợp sinh
học. Chất mang thuốc có tác dụng nhƣ một tiền dƣợc (prodrug) giúp giảm độc tính của
thuốc, thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ
của thuốc và giảm lƣợng thuốc điều trị [5, 21, 22].
1.1.2.4 Tính đa hóa trị
Tính đa hóa trị của dendrimer do các nhóm bên ngoài quyết định, các nhóm bên
ngoài càng nhiều thì hóa trị dendrimer càng tăng. Nhờ vào tính đa hóa trị, các
dendrimer có thể mang đƣợc nhiều nhóm bên ngoài. Dendrimer với nhiều nhóm chức
trên bề mặt có khả năng tƣơng tác với các phối tử đặc trƣng, giúp các nhà nghiên cứu
thiết kế xây dựng các hệ chất mang đa chức năng ứng dụng trong y học [1, 23].

9