ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN CƯỜNG
Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY THÌA CANH (Gymnema
sylvestre) THÔNG QUA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO””

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học:

: 2010 - 2014

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình

Thái Nguyên, năm 2014



B1

: Thiamin

B3

: Nicotinic acid

B5

: Gamborg’s

B6

: Pyridoxine

BA

: 6-Benzylaminopurine

CV

: Coefficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

IAA

cây thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy). .................................................. 32
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi
cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) ................................................... 35
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng
nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) ..................... 37
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Thìa
Canh (sau 30 ngày nuôi cấy). ................................................................ 38
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng
ra rễ của cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) .................................. 40


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex. Sehunlt ...................................... 4
Hình 2.2 . Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật ........ 8
Hình 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 1%, HgCl2
0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy Cây Thìa Canh ............ 31
Hình 4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình nhân nhanh chồi
Cây thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) .................................................. 33
Hình 4.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi
Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) .................................................. 36
Hình 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng
nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) ..................... 37
Hình 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của Cây Thìa
Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) ................................................................. 39
Hình 4.6. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với IAA đến khả năng
ra rễ của Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy).................................. 41


MỤC LỤC

2.4.2. Chất khoáng .................................................................................................. 12
2.4.3. Vitamin .......................................................................................................... 14
2.4.4. Các chất điều hòa sinh trưởng...................................................................... 15
2.4.5. Agar ............................................................................................................... 20
2.4.6. pH của môi trường ........................................................................................ 20
2.4.7. Điều kiện vô trùng ........................................................................................ 20
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.................................................................................................................................. 22
3.1 Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 22
3.1.1. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................... 22
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu....................................................................... 22
3.3. Hóa chất và thiết bị .......................................................................................... 22
3.3.1. Hóa chất......................................................................................................... 22
3.3.2. Thiết bị .......................................................................................................... 22
3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................................... 23
3.4.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 23
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 24
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................... 30
4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaClO 1%, HgCl2 0,1%
đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy Cây Thìa Canh. ........................................ 30
4.2. Kết quả Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình nhân nhanh chồi
Cây Thìa Canh......................................................................................................... 32
4.3. Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin) đến
khả năng nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh ............................................................. 34


4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Cây
Thìa Canh ................................................................................................................ 34
4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Kinetin đến khả năng
nhân nhanh chồi Cây Thìa Canh (sau 30 ngày nuôi cấy) ...................................... 36

gymnemic acid trong cây Thìa Canh có tác dụng làm hạ đường huyết, với cơ chế
tác dụng đã được xác định là tăng tiết insulin của tuyến tuỵ, tăng cường hoạt lực
của insulin, ức chế hấp thu glucose ở ruột, làm tăng hoạt tính của men hấp thu và
sử dụng đường, giảm cholesterol và lipid máu.
Trong tự nhiên, Cây thìa Canh tái sinh thông qua hạt, đoạn thân tươi. Việc
gây trồng cây Thìa Canh đã được tiến hành ở một số nơi thông qua đoạn thân,
hạt, tuy nhiên các phương pháp nhân giống trên cho hiệu quả không cao. Nuôi
cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống cây trồng cho hiệu quả
cao. Nhiều loại cây dược liệu đã được nhân giống thành công thông qua phương
pháp nuôi cấy mô tế bào. Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: ”Nghiên cứu nhân nhanh Cây Thìa Canh (Gymnema
sylvestre) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào”.


2

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

- Nhân nhanh Cây Thìa Canh (Gymnema sylvestre) thông qua phương
pháp nuôi cấy mô tế bào.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định được ảnh hưởng của chất khử trùng tới khả Tạo mẫu sạch
sinh chồi Cây Thìa Canh.
- Xác định được ảnh hưởng của (BA, kinetin, nước dừa) tới khả năng
nhân nhanh chồi của Cây Thìa Canh.
- Xác định được ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (NAA và
BA, Kinetin), nước dừa tới khả năng nhân nhanh cây Thìa Canh.
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1.4.1. Ý nghĩa khoa học

Phân loại:
Giới (regnum)

Plantae

Bộ (ordo)

Gentianales

Họ (familia)

Apocynaceae

Phân họ (subfamilia)

Asclepiadoideae

Tông (tribus)

Marsdenieae

Chi (genus)

Gymnema

Loài (species)

G. sylvestre

2.1.2. Đặc điểm thực vật học của Cây Thìa Canh

5

của insulin, ức chế hấp thu glucose ở ruột, làm tăng hoạt tính của men hấp thu
và sử dụng đường, giảm cholesterol và lipit máu.[8]
Trong y học cổ truyền, cây thường dùng trị dái đường với liều 4g lá khô
đủ để làm ngưng glucoza. Lá cũng dùng làm thuốc dễ tiêu hóa, còn dùng tán
thành bột để chống độc. Cây Thìa Canh đã được sử dụng ở Ấn độ từ 2000
năm nay để trị bệnh “nước tiểu ngọt”. Ngoài ra cây còn được dùng đắp lên vết
rắn độc cắn. Ở Trung Quốc, người ta dùng cả cây bỏ rễ và quả làm thuốc trị
phong thấp tê bại, viêm mạch máu, rắn độc cắn, trĩ và các vết thương do
dao.[15],[16],[17].

2.1.4.Tình hình nghiên cứu trên thế giới.
- Cây Thìa canh, có tên khoa học là gymnema sylvestre, 1 loại cây dây
leo, thân gỗ, được sử dụng tại Ấn độ, Trung quốc hơn 2000 năm nay để trị
bệnh nước tiểu ngọt như mật, nó còn có tên Gurmar, có nghĩa là kẻ huỷ diệt
đường. Dây thìa canh được biết đến và sử dụng rộng rãi tại nhiều nước như
Ấn độ với tên Diabeticin, Mỹ với tên Sugarest, Singapore với tên Glucos care,
Nhật Bản, Trung Quốc, Úc…[15],[16].
- Loại cây này giúp hỗ trợ tuyến tụy sản suất ra insulin trong tiểu đường
tuýp 2 nên là một phương pháp điều trị tự nhiên khá tốt cho căn bệnh này.
Dây thìa canh cũng cải thiện khả năng giảm đường huyết của insulin trong cả
tiểu đường tuýp 1 và tuýp 2. Nó làm giảm cảm giác thèm ngọt. Loại thảo
dược này có thể là một thay thế tuyệt vời cho các loại thuốc uống giảm đường
huyết cho tiểu đường tuýp 2.[1],[5],[8],[10],[12].

2.1.5. Tình hình nghiên cứu trong nước
- Tại Việt Nam, từ năm 2006 các nhà khoa học thuộc Trường Đại học
Dược Hà Nội do tiến sĩ Trần Văn Ơn, phụ trách bộ môn Thực vật chủ trì đã
lần đầu tiên điều tra phát hiện Dây thìa canh tại 1 số tỉnh miền Trung và miền



7

quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học
[14].
- Nguyên tắc cơ bản của nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật
phức tạp đều do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân
hóa đều mang thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ
đó để xây dựng lại toàn bộ cơ thể [6].

2.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.2. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902 lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa
ra quan niệm: “Mỗi tế bào bất kỳ (đã biệt hoá) lấy từ một cơ thể thực vật đều
có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh”. Theo
quan niệm của sinh học hiện đại thì “tất cả mọi tế bào của một cơ thể đều chứ
bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng
hợp những kiểu protein - enzyme giống hệt nhau và nếu tế bào được nuôi
trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc
trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường. Khả năng đó của tế bào
được gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật” [14].
Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào
thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái
sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [14].

2.2.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
- Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều
bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp

chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá. Kỹ thuật nuôi cấy
mô, tế bào thực vật thực xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình
thái của tế bào thực vật một cách có định hướng dựa vào sự phân hoá và phản
phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật [14].

2.2.4. Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào


9

- Trong nội bộ từng cơ thể được diễn ra theo các cơ chế nguyên phân,
đây là cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào
con có bộ nhiễm sắc thể giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu. Như vậy,
qua nguyên phân bộ nhiễm sắc thể của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang
tế bào con. Nguyên nhân của hiện tượng này là do ở kỳ trung gian của quá
trình nguyên phân, mỗi phân tử DNA đã thực hiện quá trình sao mã để hình
thành hai phân tử DNA giống nhau và giống DNA ban đầu và sau đó phân
chia đều đặn hai phân tử DNA về hai tế bào con ở kỳ sau.
- Giữa hai thế hệ cơ thể được hình thành thông qua cơ chế giảm phân
đã làm cho thế hệ sau có hiện tượng phân ly tính trạng do bộ nhiễm sắc thể
của thế hệ sau không giống nhau và không giống bố mẹ. Đây là nguồn
nguyên liệu cho chọn lọc tự nhiên và tiến hóa nhưng nó lại là trở ngại lớn khi
muốn duy trì các tính trạng mong muốn ở bố mẹ. Nhân giống vô tính in vitro
đã giải quyết được vấn đề này.[14].
- Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống in vitro khi lấy các bộ
phận sinh dưỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông
tin di truyền giống nhau và tạo nên cơ thể mới có thông tin di truyền giống
nhau và giống cơ thể mẹ. Như vậy các tính trạng mong muốn sẽ được giữ lại
một cách nguyên vẹn cho mọi cơ thể con.
2.3. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

sinh trưởng có đóng góp rất lớn trong việc kích thích tạo chồi mà vẫn đảm
bảo được sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy.[14].

2.3.4. Tạo cây mô hoàn chỉnh
Kích thích chồi ra rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây hoàn
chỉnh. Chồi hữu hiệu được chọn lựa đưa vào môi trường ra rễ. Môi trường tạo
rễ thường giảm đi một nửa hàm lượng các chất môi trường cơ bản nhằm hạn
chế quá trình sinh trưởng, tập chung cho ra rễ, loại bỏ các chất kích thích tạo
chồi, phân chia chồi và thay vào đó là một số auxin kích thích tạo rễ. Tùy theo
loại cây mà sử dụng các hàm lượng auxin cho phù hợp. Thông thường các
chất NAA, IBA, IAA được sử dụng với hàm lượng 1-5mg/l để kích thích chồi


11

ra rễ đối với một số cây thân gỗ. Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo ra
quá nhỏ và ngắn có thể sử dụng GA3 và và một số hợp chất như nước dừa…
bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con chuyển sang khu huấn
luyện.

2.3.5. Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm
Cây con đạt tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao
cây) sẽ được đưa ra ngoài huấn luyện một thời gian để thích ứng với điều kiện
môi trường bên ngoài, sau đó chuyển từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới,
sau đó chuyển cây ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro do được nuôi cấy trong
điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô
trùng tốt nên khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn
như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp,
cây con dễ mấy nước và mau héo.
Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây nuôi cấy mô phải mát, cường độ

dương như: MgSO4, FeSO4, ZnSO4, MnSO4, CuSO4. Tùy từng môi trường mà
thành phần và các tỷ lệ các muối khoáng được cung cấp khác nhau. Môi
trường chứa nhiều N thích hợp cho việc hình thành chồi, môi trường giàu K
sẽ kích thích mạnh mẽ sự trao đổi chất.
- Nitơ (N): Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng NO3- và
NH4+. Các muối khoáng có nitơ thường dùng là Ca(NO3)2.4H2O (Canxi
nitrat), KNO3 (Kali nitrat), NH4NO3 (Amoni nitrat), NaNO3 (Natri nitrat) .
Các muối amon thường dùng: (NH4)2SO4 (Amoni sunphat), hoặc NH4NO3
(Amoni nitrat) [14].
- Photphos (P) thường được đưa vào môi trường dưới hai dạng muối:
NaHPO4.7H2O và KH2PO4.
- Kali (K) được cung cấp cho môi trường dưới dạng: KNO3 (Kali
nitrat), KCl (Kali Clorua), KH2PO4 (Kali photphat).


13

- Canxi (Ca) trong môi trường cung cấp dưới dạng muối Canxi nitrat:
Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O [14].
- Magie (Mg) cung cấp cho môi trường thường ở dạng MgSO4.7H2O.
- Các ion Na+ và Cl- cần ở hàm lượng thấp và được đưa vào môi trường
cùng với các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường.
Khoáng vi lượng:
Các khoáng vi lượng được sử dụng với hàm lượng thấp (thường là dưới
30mg/l) nhằm cung cấp đầy đủ các chất khoáng cho môi trường. Khoáng vi
lượng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy mặc dù là sử
dụng với nồng độ thấp nhưng nó đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự
hoạt động của các enzyme. Các nguyên tố vi lượng được dùng trong nuôi cấy mô
tế bào là Fe, Bo, Mn, I, Zn, Cu, Ni, Co. Chúng cung cấp dưới các dạng muối: KI,
FeSO4, ZnSO4, CuSO4, MnSO4, Na2MoO4, CoCl2, H2BO4, NiCl2 [14].

trưởng của tế bào. Nói chung các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ
khi hàm lượng thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế
bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp.
Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HCl
(B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic acid, trong đó vitamin B1 là không thể
thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào
thực vật. Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho cho
sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong
môi trường MS. Các tác giả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của
B1 trong nuôi cấy mô.
- Inositol thường được nói đến như là một vitamin kích thích một cách
tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không
phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp.


15

- Vitamin B1 (Thiamine.HCl, Aneurin): Là một chất bổ sung rất cần
cho môi trường nuôi cấy. Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1
bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào
nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân tử vit B1. Vì vậy không
nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc chẳng hạn.
- Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin): Là tiền chất của pyridoxalphosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase.
Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau:
Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate
- Myo-Inositol (Bios I): Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, cụ
thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic và pectine. Inosit là chất bền vững
khi khử trùng. Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 mg/l. Khi phân tích
thành phần của nước dừa người ta thu được inosit trong một phân đoạn trung
tính.

(2,4-D)

và

naphthoxyacetic acid (NOA). IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn
lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin
nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các
enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) không có tác dụng. Những auxin có
hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic
acid

(4-CPA)

hoặc

p-chlorophenoxyacetic

acid

(PCPA),

2,4,5-

trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid
(MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram), và 3,6-dichloro-2methoxybenzoic acid (dicamba). Đặc điểm chung của các auxin là tính chất
phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng
trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn,
tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn. Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong
ethanol hoặc trong NaOH loãng [9], [14].
Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông

là ethylene. Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế
sinh trưởng của chồi đỉnh
- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn
- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh
chồi phụ trong nuôi cấy mô