ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA
GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÒ TẠI MỘT SỐ
HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG
VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thái Nguyên, năm 2010


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA
GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÒ TẠI MỘT SỐ
HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG
VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.62.50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Thái Nguyên, ngày ... tháng ... năm 2010

Nguyễn Thị Kim Dung


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nước ............... 3
1.1.1. Trên thế giới ........................................................................................ 3
1.1.2. Ở Việt Nam ......................................................................................... 4
1.2. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng................................................. 5
1.3. Mầm bệnh ................................................................................................ 10
1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu ....................................... 11
1.3.2. Đặc tính nuôi cấy ........................................................................... 12
1.3.3. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida ................. 15
1.3.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida........ 16
1.3.5. Serotype của vi khuẩn P. multocida .............................................. 18
1.3.6. Độc lực của vi khuẩn P. multocida................................................ 21

2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ............................................................. 36
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P. multocida ... 37


2.4.2.1. Nuôi cấy, phân lập ...................................................................... 37
2.4.2.2. Phương pháp xác định các đặc tính sinh vật, hóa học................ 38
2.4.3. Phương pháp thử độc lực trên chuột nhắt trắng ................................ 41
2.4.4. Phương pháp thử kháng sinh đồ........................................................ 42
2.4.5. Chế tạo vắc xin tại chỗ theo tiêu chuẩn ngành.................................. 42
2.4.5.1. Phương pháp tính LD50 của P. multocida trên chuột.................. 42
2.4.5.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn .................................. 43
2.4.5.3. Phương pháp chế tạo vắc xin...................................................... 43
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 45
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................... 46
3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng
từ năm 2006 – 2009 ........................................................................................ 46
3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009.... 47
3.1.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ
năm 2006 – 2009 ......................................................................................... 48
3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ....... 50
3.1.4. Triệu chứng đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng............... 53
3.1.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia
súc khoẻ tại tỉnh Cao Bằng.......................................................................... 54
3.1.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ dịch
theo lứa tuổi.................................................................................................. 56
3.1.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của các
chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại một số huyện
có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng ............................................................. 58
3.1.8. Xác định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida bằng phương
pháp PCR (Polymerase chain reaction)....................................................... 59


DNA:

Deoxyribonucleic Acid

ĐC:

Đối chứng

FAO:

Food and Agriculture Oganization

LD50:

Lethal Dose 50 - Liều gây chết 50%

MR:

Methyl Red

PCR:

Polymerase Chain Reaction

P. multocida:

Pasteurella multocida

TN:

Bảng 3.4. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ
huyết trùng........................................................................................ 53
Bảng 3.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia
súc khoẻ............................................................................................ 55
Bảng 3.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ
dịch theo lứa tuổi.............................................................................. 57
Bảng 3.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của vi
khuẩn P. multocida phân lập............................................................. 58
Bảng 3.8. Kết quả thử độc lực của các chủng P. multocida phân lập .............. 60
Bảng 3.9. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P.
multocida phân lập ........................................................................... 62
Bảng 3.10. Kết quả chọn chủng vi khuẩn P. multocida để chế tạo autovaccine .. 63
Bảng 3.11. Kết quả xác định LD50................................................................... 64
Bảng 3.12. Kết quả chế tạo và kiểm nghiệm autovaccine trong phòng thí nghiệm 65
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của các lô autovaccine......... 67
Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 1 và 2 năm tuổi.. 69
Bảng 3.15. Kết quả thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 3 năm tuổi .. 70
Bảng 3.16. Kết quả theo dõi biến động về chỉ tiêu thân nhiệt và tần số hô hấp ...... 72


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ phân loại nhóm vi khuẩn gây bệnh theo tính chất sinh
vật học ............................................................................................ 37
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida ............................. 40
Hình 2.3. Sơ đồ chế tạo vắc xin ...................................................................... 44


1


được thực hiện đề tài: “Xác định vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh
tụ huyết trùng ở trâu, bò tại một số huyện có dịch trên địa bàn tỉnh Cao
Bằng và bước đầu thử nghiệm auto-vaccine”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn
tỉnh Cao Bằng;
- Khảo sát sự lưu hành vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò;
- Xác định type giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida phân
lập được;
- Thử nghiệm hiệu quả bảo hộ và tính an toàn trên động vật thí nghiệm
của autovaccine phòng bệnh tụ huyết trùng.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
* Ý nghĩa khoa học:
- Bổ sung tư liệu về đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu bò, sự
lưu hành của vi khuẩn Pasteurella multocida;
- Bổ sung tư liệu về kết quả phân lập và giám định đặc tính sinh vật
học của vi khuẩn Pasteurella multocida, kết quả xác định type vi khuẩn
Pasteurella multocida bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
* Ý nghĩa thực tiễn
- Là cơ sở để xác định biện pháp phòng bệnh có hiệu quả;
- Là cơ sở để nghiên cứu chế tạo vắc xin phòng bệnh đạt hiệu quả
phòng hộ cao.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nước
1.1.1. Trên thế giới

multocida thuộc serotype I Roberts gây ra, còn Pasteurellosis dùng chỉ bệnh
do vi khuẩn Pasteurella gây ra.
Ngày nay, sau hơn một trăm năm kể từ khi phát hiện lần đầu, P.
multocida vẫn là nguyên nhân gây bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài gia súc
gia cầm. Tuy có tính thích nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau, nhưng
P. multocida đều có những đặc tính cơ bản giống nhau.
1.1.2. Ở Việt Nam
Theo Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958) [3], bệnh tụ huyết
trùng trâu, bò được Cudamie phát hiện đầu tiên vào năm 1868 ở trâu thuộc
tỉnh Bà Rịa và Long Thành, sau đó Gemain (1869) phát hiện bệnh ở Gò Công,
Shein (1901) xác nhận có bệnh này ở Tây Ninh.
Theo Đoàn Thị Băng Tâm (1987) [30], tại Việt Nam bệnh thường xảy
ra ở Nam bộ và đặc biệt ở miền tây Nam bộ, vào những năm 1910, 1919,
1920, 1933, 1935 dịch xảy ra rất lớn và mạnh. Bệnh gây thiệt hại và lây lan
nhiều hơn ở những vùng đất trũng, thấp, khí hậu ẩm ướt. Bùi Quý Huy (1998)
[10] cũng cho biết: Trước đây bệnh tụ huyết trùng xảy ra mạnh ở các tỉnh phía
Nam và xảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phía Bắc. Trong những năm 70 có 80% số ổ
dịch tụ huyết trùng và 84% số thiệt hại gia súc do bệnh tụ huyết trùng thuộc
về các tỉnh ở phía Nam. Đến những năm 90 phân bố địa lý của bệnh nghiêng
về các tỉnh phía Bắc, số địa phương có dịch tụ huyết trùng cũng tăng lên
nhiều, hàng năm có 20 – 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành.
Ở nước ta khí hậu nóng ẩm, mỗi miền Bắc – Trung – Nam có điều
kiện khí hậu và hệ sinh thái khác nhau. Các tác giả (Nguyễn Vĩnh Phước,


5
1978 [24], Nguyễn Ngã, 1996 [20], Nguyễn Thiên Thu, 1996 [32]) đã nhận
định bệnh tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra thường trùng với những cơn mưa ở
từng vùng và kéo dài đến hết mùa mưa.
Ngoài các đặc điểm dịch tễ, nhiều tác giả cũng đã đi sâu nghiên cứu

các loài vật với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố
như mức độ cảm nhiễm của vùng, mức độ bùng nổ của các vụ dịch trước đó,
mức độ miễn dịch toàn đàn, đặc biệt phụ thuộc vào lứa tuổi mắc bệnh.
De Alwis (1984) [46] cũng cho biết mức độ cảm nhiễm của động vật non
mạnh hơn động vật già, ở trâu và bò tỷ lệ mắc bệnh ở lứa tuổi dưới 6 tháng là
3,5%, trong khi đó trâu, bò ở lứa tuổi từ 6 tháng đến 2 năm là 30 – 32%, ngược
lại trâu, bò trên 2 năm tuổi tỷ lệ mắc bệnh chiếm từ 3 – 5% toàn đàn.
- Mùa vụ phát bệnh:
Bệnh tụ huyết trùng phụ thuộc rất lớn vào thời tiết, khí hậu. Mustafa
và cs (1978) [60] nghiên cứu về ảnh hưởng của mùa vụ tới bệnh tụ huyết
trùng đã nhận xét bệnh thường liên quan tới điều kiện khí hậu ẩm ướt.
Mùa phát bệnh tụ huyết trùng ở các nước Châu Á tập trung vào các
tháng và mùa khác nhau trong năm. Ở Lào bệnh phát ra từ tháng 4 đến tháng
8; Ở Pakistan bệnh xảy ra rải rác quanh năm song thường từ tháng 4 đến
tháng 6 hàng năm (FAO, 1991) [50]. Ở đảo Java (Indonesia) bệnh xuất hiện
vào cuối mùa khô, đầu mùa mưa (Natalia và cs, 1992) [67], bệnh xảy ra các
tháng 8, 9 ở Malaysia (Yeo và Mukhtar, 1992) [79].
Yeo và Mukhtar (1992) [79] theo dõi dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu,
bò ở đảo Sabah, Malaysia từ 1983 – 1991 cho biết số lượng ổ dịch và số
lượng trâu, bò chết hàng năm ở các huyện rất khác nhau: Một số huyện xảy ra
dịch từ tháng giêng đến tháng 3, trong khi phần lớn lại xảy ra dịch từ tháng 7
đến tháng 11. Từ số liệu theo dõi của mình, tác giả đã so sánh giữa 2 vùng
trong cùng một đất nước về loài vật mắc bệnh, tuổi mắc bệnh, thời gian xảy ra


7
bệnh và cho rằng sở dĩ có sự khác nhau này là do điều kiện thời tiết khí hậu
có sự khác nhau giữa 2 vùng, đồng thời phương thức chăn nuôi giữa 2 vùng
cũng khác nhau. Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy tại từng địa
phương, từng quốc gia khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu,

- Vùng phát bệnh
Các nghiên cứu đều cho thấy bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra ở
những vùng đất trũng, khí hậu nóng và ẩm ướt. Theo Phan Đình Đỗ và Trịnh
Văn Thịnh (1958) [3] bệnh thường xảy ra ở vùng ẩm thấp, khí hậu nóng ẩm,
mưa nhiều. Đặc biệt ở những vùng đất trũng, ẩm thấp, lầy lội, bị ngập lụt, có
nhiều ruộng nước, nhiều kênh rạch, vùng có địa hình phức tạp, trình độ dân trí
thấp bệnh thường xảy ra và lây lan mạnh làm chết nhiều gia súc (Võ Văn
Hùng, 1997) [9]. Năm 1990 riêng ba tỉnh Sơn La, Hoàng Liên Sơn, Bắc Thái
số ổ dịch tụ huyết trùng gia súc chiếm 60% và trong đó có tới 70% số gia súc
chết so với toàn miền Bắc (Bùi Quý Huy, 1998) [10]. Đỗ Văn Được (2003)
[5] cho biết ở Lạng Sơn vùng núi đất, có độ dốc lớn, nhiệt độ thấp, ẩm độ cao,
tập quán chăn nuôi còn lạc hậu, chăn thả tự do thì tỷ lệ bị nhiễm bệnh và chết
cao. Theo Hoàng Đăng Huyến (2004) [11] ở Bắc Giang những vùng đồi núi
thấp tỷ lệ mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng cao. Nguyễn Văn Minh (2005)
[19] thông báo ở Hà Tây tỷ lệ trâu, bò ốm chết vì bệnh tụ huyết trùng ở vùng
đồi, bán sơn địa cao hơn so với vùng chiêm trũng và vùng đồng bằng.
Ở những vùng mà phương thức chăn nuôi còn thả rông, không có
người chăm sóc, không làm chuồng nuôi nhốt, để gia súc ở những nơi bùn
lầy, ngập nước, vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng kém thì khả năng xảy ra bệnh
cao. Ngoài ra, trình độ dân trí thấp, nhận thức của người dân về công tác
phòng chống bệnh chưa cao, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào việc
phòng chống dịch bệnh còn nhiều khó khăn… cũng không tránh khỏi việc
dịch bệnh thường xuyên xảy ra.


9

- Cách lây lan
Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [15], bệnh tụ huyết trùng trâu bò lây
truyền theo các con đường sau: Bệnh trực tiếp lây lan từ súc vật bệnh sang súc

Pasteurella hoặc nó sẽ gây bệnh ngay cho vật chủ khi vật chủ chịu tác động
của các yếu tố stress làm cho sức đề kháng của cơ thể giảm hoặc nó sẽ tồn tại
ở đường hô hấp của vật chủ.
Cao Văn Hồng (2002) [8] cho biết tỷ lệ trâu, bò và lợn khoẻ mang P.
multocida ở đường hô hấp khi điều tra ở Đăk Lăk là 14,79% và 11,61% và
sau 6 tháng có dịch thì tỷ lệ này lên tới 21,43%.
1.3. Mầm bệnh
Giống Pasteurella có nhiều loài, căn cứ vào tính chất gây bệnh cho
các loài động vật, người ta chia giống Pasteurella thành 3 loài, trong đó loài
gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là Pasteurella multocida và với
từng giống gia súc, gia cầm khác nhau bệnh tụ huyết trùng lại do các serotype
khác nhau gây ra.
Theo phân loại của Bergey (1984) [38 ], Pasteurella multocida thuộc:
- Bộ (order) Eubacteriales
- Họ (family) Parvobacteriaceae
- Tộc (tribe) Pasteurellaceae
- Giống (genus) Pasteurella
- Loài (species) Pasteurella multocida
Trước đây Pasteurella multocida có tên là Pasteurella boviseptica,
Pasteurella suiseptica, Pasteurella aviseptica,… tùy thuộc vào ký chủ đầu
tiên của vi khuẩn phân lập được. Và cuối cùng tên gọi đã được thống nhất là
Pasteurella multocida.


11
Bảng 1.1. Tóm tắt danh pháp của P. multocida
Tác giả

Năm


Bacterium bipolare multocidium

Oreste and Armani

1887

Bacillus septicaemia

Trevisan

1887

Pasteurella Cholerae-gallinarum

Lehmann and Neumann

1889

Bacterium multocidium

Stemberg

1893

Bacterium septicaemia haemorrhagicae

Lignieres

1900


khi phát triển trong điều kiện thiếu O2. Vi khuẩn thường đồng nhất trong máu
động vật. Trong môi trường nhân tạo vi khuẩn thường đa hình dạng, hình
trứng, hình cầu... Tác giả còn nhận thấy khi nuôi cấy nhiều lần trong môi
trường nhân tạo, chiều dài của vi khuẩn tăng lên.
Trong cơ thể gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong môi trường có
huyết thanh hoặc máu vỡ, vi khuẩn hình thành giáp mô nhưng khi nhuộm khó
thấy. Khi nhuộm tiêu bản bệnh phẩm, P. multocida bắt màu xẫm ở hai đầu,
còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu nên người ta
gọi P. multocida là vi khuẩn lưỡng cực. Nguyên nhân này là do nguyên sinh
chất của vi khuẩn dồn về 2 đầu.
Trong canh khuẩn vi khuẩn có hình trứng, hình cầu đứng riêng lẻ hay
thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già vi khuẩn suy yếu, biến dạng thay đổi
hình thái như hình gậy dài, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường,
có khi dài 2-3 µm. Vi khuẩn không có lông, không di động không hình thành
nha bào.
Pasteurella dễ nhuộm với thuốc nhuộm thông thường như Anilin,
Methylen Bleu, Fuchsine và Giemsa.
1.3.2. Đặc tính nuôi cấy
P. multocida là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, ưa kiềm nhẹ
(PH = 7,2 – 7,4), có thể nuôi cấy ở nhiệt độ từ 13°C đến 38°C, thích hợp nhất
là ở nhiệt độ 37°C.
Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém. Vi
khuẩn phát triển tốt hơn trên môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 5-10%
huyết thanh hoặc máu động vật.


13
Trên môi trường nước thịt: Sau khi cấy 24 giờ ở nhiệt độ 37oC vi
khuẩn làm đục môi trường, đáy ống có cặn nhầy, lắc có hiện tượng vẩn như
sương mù rồi lại mất, có khi sinh ra một màng mỏng trên mặt môi trường.

khuẩn và cũng là môi trường phân lập, giữ giống và nhân giống.
Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: Đây là môi
trường đặc biệt dùng để phân lập, giám định và xác định độc lực của vi khuẩn
Pasteurella. Trên môi trường này vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc
đặc biệt, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển
vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp (khoảng 20 lần) và góc phản quang
của ánh sáng đèn điện là 45o. Những khuẩn lạc dạng S từ canh trùng thường
mới có tính dung quang. Khuẩn lạc dạng M và R không có đặc điểm nói trên.
Tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc
khác nhau:
+ Nếu vi khuẩn có độc lực cao: Khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ
chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu
vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent).
+ Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: Khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện
tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent).
+ Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: Khuẩn lạc của chúng không có hiện
tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ
tròn trong.
Hiện tượng phát huỳnh quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy sau
24 giờ. Nếu để lâu sau 72 giờ thì huỳnh quang sẽ mất đi. Theo Smith (1990)
[77] đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của vi
khuẩn tụ huyết trùng. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng tụ
huyết trùng có tính kháng nguyên và miễn dịch cao.
Như vậy, vi khuẩn tụ huyết trùng có thể phát triển trên nhiều loại môi
trường, song có một số loại môi trường được các tác giả cho là thích hợp để