ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HIỀN

TÊN ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TIÊN MAO TRÙNG
(TRYPANOSOMMA EVANSI) LƯU HÀNH TRÊN TRÂU Ở
TỈNH TUYÊN QUANG”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Thú y

Khoa

: Chăn nuôi thú y

Khóa học

: 2009 - 2014

Giảng viên hướng dẫn : GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang
đoạn chèn RoTAT 1.2 ................................................................... 49
Bảng 4.2. Thành phần và điều kiện phản ứng giải trình tự gene .................... 50
Bảng 4.3. So sánh trình tự gene RoTAT 1.2 của chủng T. evansi Tuyên Quang
với trình tự GenBank..................................................................... 51
Bảng 4.4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen
RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Bam HI............................ 53
Bảng 4.5. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen
RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Xho I ............................... 53
Bảng 4.6. Thành phần và điều kiện phản ứng nối gen .................................... 54


67

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1. Kết quả điện di ADN tổng số .......................................................... 43
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số .................. 44
Hình 4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .................................................... 44
Hình 4.4. Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2 ................... 46
Hình 4.5. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường LB có
ampicilin, chất chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG ................ 47
Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid .......................................... 48
từ các khuẩn lạc màu trắng.............................................................................. 48
Hình 4.7. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp
mồi F1.2 /R1.2............................................................................... 50
Hình 4.8. Trình tự gene RoTAT 1.2 của T. evansi ......................................... 51

: Dideoxynucletit
EDTA
: Ethylen Diamin Tetra Acetic
ELISA
: Enzym Linked Immunosorbent Assay
EtBr
: Ethydium bromide
IFAT
: Indirect Fluorescent Antibody Test
IPTG
: Isopropyl β - D - thiogalactoside
ISG
: Invanant Surface Glycoprotein
KST
: Ký sinh trùng
LATEX
: Latex Agglutination Test
PBS
: Phosphat Buffered Saline
PBST
: Phosphat Buffered Saline Tween
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PVDF
: Polyvinylidene difluoride
RE
: Restriction enzyme
SDS
: Sodium Dodecyl Sulfat
SDS - PAGE : Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide

2.1.2.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng ........................ 8
2.1.2.3. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh ............................................................. 9
2.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh ............................................... 10
2.1.3.1. Đặc điểm bệnh lý ............................................................................ 10
2.1.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò ............. 11
2.1.3.3. Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng ................................................. 12
2.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ............................................................ 13
2.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng ........................................................................ 13
2.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm ..................................................................... 13
2.1.5. Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction).......................................................................... 18
2.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng ............................................................... 18
2.1.6.1. Phòng bệnh ...................................................................................... 18
2.1.6.2. Điều trị bệnh.................................................................................... 20


70

2.2. Tách dòng gene ........................................................................................ 21
2.2.1. Khái niệm và các phương pháp ............................................................. 21
2.2.2. Vector tách dòng ................................................................................... 24
2.2.2.1. Khái niệm ........................................................................................ 24
2.2.2.2. Các loại vector tách dòng ................................................................ 25
2.2.3. Plasmid pCR 2.1.................................................................................... 26
2.3. Biểu hiện gene .......................................................................................... 27
2.3.1. Khái niệm .............................................................................................. 27
2.3.2. Vector biểu hiện .................................................................................... 29
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 30
3.1. Đối tượng ................................................................................................. 30

3.5.13. Phương pháp Western blot .................................................................. 42
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 43
4.1. Tách dòng và xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt
RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi ............................................................. 43
4.2. Kết quả biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên của T. evansi .................. 52
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 60
5.1. Kết luận .................................................................................................... 60
5.1.1. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề
mặt RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi ...................................................... 60
5.1.2. Kết quả biểu hiện gene mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi ... 60
5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 62
I. Tài liệu tiếng Việt ........................................................................................ 62
II. Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................... 64


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng
biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ.
Tuy nhiên, Van Meirvenne cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký
sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện
đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981)
[27], hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở
gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là
hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao
trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao

mao trùng phân lập ở Tuyên Quang để tạo cơ sở cho việc xác định cấu trúc
kháng nguyên
- Kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp được chế tạo trong nước phục vụ
sản xuất Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu với bệnh tiên mao
trùng ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài sẽ tách dòng, xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề
mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện được gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT
1.2 của tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập ở Tuyên Quang.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ sản xuất Kit chẩn đoán
huyết thanh học có khả năng phát hiện đặc hiệu bệnh tiên mao trùng gia súc ở
Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc
2.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
2.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động
vật nguyên sinh
Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [5],
vị trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa)
như sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida

(Steel, 1885)
Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế
(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T.
brucei, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax.
2.1.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng
Tiên mao trùng T. evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là
một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 µm (trung bình là 25 µm),
chiều rộng 1,5 - 2 µm. Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân
nhọn. Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của
các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae. Cấu trúc từ ngoài
vào trong được chia thành 3 phần chính:
- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp
ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp
vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant
Glycoprotein Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp
song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của
các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972
[28]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]).
- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh
chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào
màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào)
và mạng lưới golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng.
Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân,
về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN). Từ kinetoplast có


5

một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự

nghĩa là từ 5 - 10% số gene của KST cung cấp cho sự biến đổi kháng nguyên


6

bề mặt này.
Quá trình biến đổi kháng nguyên từ trước đến nay đều cho rằng do đáp
ứng của KST đối với kháng thể của vật chủ để trốn tránh sự phá hủy của hệ
thống miễn dịch. Ngày nay, nhiều quan sát đã cho phép loại bỏ giả thiết này.
Van Meirvenne cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh
trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp
ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981) [27],
hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia
súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là hoàn
toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao
trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao
trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất.
* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi
Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt
(VSG) và với bổ thể, gắn lên trên bề mặt và làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó
cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá của gene. Kết quả là các
phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng các phân tử VSG
mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước đã không còn tác dụng đối với
kháng nguyên mới này.
Theo Barry và Tumer (1991) [24], các VSG được mã hoá nhờ các gene
chuyên biệt. Từ kho chứa hàng nghìn gene khác nhau, một loại gene VSG
được hoạt hoá một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên
VSG. Mỗi bên VSG mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ
gene của tiên mao trùng tồn tại một số lớn gene VSG, các gene này sử dụng
nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG

thú hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo,
sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch..., nhưng
không ký sinh ở người.
Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ
các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu
(thuộc họ Tabanidae). Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả
tiên mao trùng vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu
sẽ truyền tiên mao trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ. Sự lây truyền này
mang tính chất cơ học. Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới
truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng.
Theo Phan Địch Lân (1974) [10], Phan Địch Lân (2004) [11], phần lớn
các loài mòng tập trung ở khu vực miền núi và trung du. Trong 53 loài mòng
thì có tới 44 loài phân bố ở vùng rừng núi có độ cao dưới 1.000 mét so với
mặt nước biển, càng lên cao số loài càng ít dần (độ cao trên 1.000 mét chỉ có
26 loài). Ở vùng trung du (rừng thưa, độ cao không quá 500 mét so với mặt
nước biển có 27 loài; vùng đồi trọc chỉ có 9 - 11 loài; vùng rừng núi ven biển
phát hiện chỉ có 8 loài. Những loài mòng phổ biến ở tất cả các vùng là:
Tabanus rubidus, T. striatus, Chrysops dispar, Chrysozoma assamensis.
Những loài mòng chỉ gặp ở vùng núi là: Tabanus flavistriatus, T.


9

fumifer, Chrysops vADNer. Miền Bắc nước ta có 4 loài ruồi hút máu, 2 loài
phổ biến ở tất cả các vùng là Stomoxys calcitrans và Liperosis exigua; 2 loài
chỉ thấy ở những vùng sinh cảnh đặc biệt: loài Bdellolarynx sanguinolentus
(chỉ xuất hiện ở vùng có độ cao dưới 1.000mét), loài Stomoxys indica (chỉ
thấy ở vùng núi Cẩm Thuỷ - Thanh Hoá).
Phan Địch Lân (2004) [11], cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm thấy hai
loài mòng T. rubidus và T. striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ 15,2% và

nhiễm cao hơn ( 6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao nhất (12,9 - 14,8%), trâu
trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổi.
Theo Phan Văn Chinh (2006) [2], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở
4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 năm
tuổi (6,92% và 2,31%). Mùa lây lan bệnh thường xảy ra trong các tháng nóng
ẩm, mưa nhiều (từ tháng 4 đến tháng 9).
Theo Luckins (1988) [30], sự xuất hiện lượng lớn ruồi, mòng trong
mùa mưa nóng ẩm luôn có liên quan đến tình hình dịch tễ bệnh tiên mao trùng
ở trâu, bò, dê, lạc đà. Từ cuối mùa thu, mùa đông và đầu mùa xuân, trâu bò
nhiễm tiên mao trùng phải sống trong điều kiện thời tiết lạnh, thiếu thức ăn
nên sức đề kháng giảm, bệnh thường phát ra vào thời gian này và trâu bò bị
đổ ngã hàng loạt. Tiên mao trùng có sức đề kháng yếu, dễ chết khi tiếp xúc
với nước cất, cồn và thuốc sát trùng.
Bò ở Guaico nhiễm T. evansi từ 11 - 74%, bò dưới 12 tháng nhiễm
21,04%; bò trên 25 tháng nhiễm 72,92%; bò Zebu cao sản nhiễm 74,4%.
Bò ở Venezuela dưới 3 tháng nhiễm T. evansi 13% và bò trên 36 tháng
nhiễm 50%.
2.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
2.1.3.1. Đặc điểm bệnh lý
Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò,
ngựa, tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da, kích
thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao trùng được tiêm truyền.
Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong
bạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia
theo chiều dọc. Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng
như nhau. Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày. Biểu đồ sóng tiên mao
trùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt
sóng yếu. Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên
mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng. Mỗi
đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể

tiên mao trùng, trâu bò thường đột ngột lên cơn sốt (40 - 41,7 C) kéo dài 2 - 4
ngày rồi giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên. Thời gian gián đoạn giữa
hai cơn sốt dài hay ngắn tuỳ theo thể trọng con vật. Khi sốt, kiểm tra máu
thường thấy tiên mao trùng.
- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiện
hội chứng thần kinh như điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tường, chạy
vòng quanh kêu rống lên. Trường hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợn
ngược rồi đổ ngã vật xuống, sùi bọt mép giống như trâu bị cảm nắng. Sau 20 -


12

30 phút con vật lại đứng dậy đi lại được. Những trâu bò mắc bệnh có triệu
chứng lâm sàng như trên thường là mắc bệnh ở thể cấp tính.
Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân
sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được. Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và
nhai lại cho đến khi sắp chết.
- Phù thũng dưới da: phù thũng thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như
ở bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục.
- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu,
bò bệnh. Mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng đỏ
ngầu. Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng (củi nhãn) kéo che kín giác mạc.
- Hội chứng tiêu hoá: một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng,
màu vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp
theo những cơn sốt cách quãng. Ỉa chảy trong bệnh tiên mao trùng thường dai
dẳng và con vật vẫn ăn được.
- Gầy yếu, suy nhược: ở thể bệnh cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉ
sau 7 - 14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu. Nếu bệnh
kéo dài thì con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạc
mắt nhợt nhạt, lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năng

sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]). Triệu chứng sẩy thai có thể
thấy ở trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng (Nguyễn Đăng Khải, 1995 [6]).
2.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm
* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:
Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phương
pháp sau:
- Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T. evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi;
vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi. Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến
kính đã có sẵn 1 giọt EDTA 1%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men
lên để máu dàn theo la men thành một lớp mỏng. Soi dưới kính hiển vi (độ
phóng đại 10 x 10 và 10 x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống.
- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)
+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng
một góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính
khoảng 1 - 1,25 cm. Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn
Methanol, nhuộm Giemsa [1 giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS (Phosphat
Buffered Saline) pH = 7,2] trong 25 phút. Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy
mạnh, để khô rồi soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng,


14

do đó khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều
loài tiên mao trùng cùng một lúc.
+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm,
dùng la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn
Methanol trong 2 phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml
dung dịch PBS pH = 7,2). Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô, soi

số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng
được (Lê Ngọc Mỹ, 1994 [14]; Đoàn Văn Phúc, 1994 [17]).
* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:
Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng
nguyên tiên mao trùng. Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu.
- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng
+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination
Test): hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muối
sinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao
trùng vào, trộn đều, đậy la men và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20
hoặc 10 x 40). Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là (+) và ngược lại là (-).
Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng.
+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động có
trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T.
evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao
trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên
với kháng thể. Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường,
và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các
hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng
nguyên bề mặt (epitop surface). Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng
lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết
định của kháng nguyên. Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng
thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể
đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại. Kết quả là các
hạt latex cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể
quan sát bằng mắt thường. Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng
nguyên bề mặt được tinh chế từ chủng T. evansi không nhuộm màu.
Phương pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứng

các dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể (Luckins, 1988 [23]; Davison,
1999 [20]).
Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu
bò mắc bệnh tiên mao trùng, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu bò khoẻ
mạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh.
Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu (1994) [21],
đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩn đoán
bệnh tiên mao trùng. Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng cho phản


17

ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng tới 1/40. Theo Lương Tố Thu, Lê
Ngọc Mỹ và cs (1996) [22], độ nhạy của phương pháp IFAT là 71,25.
Để tinh chế kháng nguyên T. evansi dùng trong phản ứng miễn dịch
huỳnh quang gián tiếp để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu bò, Vương
Thị Lan Phương (2004) [18], đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T. evansi
phân lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6
mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT và thu được
26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác nhau. Bằng phản ứng dung giải
miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch, tác giả đã xác định được sự
thay đổi kháng nguyên bề mặt của T. evansi: đa số các VAT của các kho
kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8 VAT/26 VAT có hiệu giá
kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với các VAT của các kho
kháng nguyên khác. Các VAT trội xuất hiện sớm trong 4 tuần lễ đầu nhiễm
bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng
nguyên chẩn đoán. Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên theo phương
pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang
gián tiếp, chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)