ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

LÝ THỊ KIM TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ
DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRỊNH TẤT CƢỜNG


1.2.

Cấu trúc và hình dạng của GABA .................................................................11

1.3.

Quá trình tổng hợp và chức năng của GABA trong não ................................ 12

1.4.

Enzym tổng hợp GABA .................................................................................13

1.5.

Thụ thể GABA ............................................................................................... 14

1.6.

Sản xuất GABA từ vi sinh vật .......................................................................15

1.7.

Cơ chất tham gia sản xuất GABA ..................................................................17

1.8.

Thực phẩm chức năng GABA........................................................................18

1.8.1. Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng chứa GABA ......18
1.8.2. Nghiên cứu về GABA ở Việt Nam ............ Error! Bookmark not defined.

Error! Bookmark not defined.
2.2.1.6. Định lƣợng glutamic acid bằng phƣơng pháp so màu.................. Error!
Bookmark not defined.
2.2.1.7. Chiết xuất glutamic acid trong cám gạo bằng phƣơng pháp nƣớc sôi
Error! Bookmark not defined.
2.2.1.8. Xác định GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) [41]
Error! Bookmark not defined.
2.2.1.9. Định lƣợng GABA bằng phƣơng pháp so màu [57] Error! Bookmark
not defined.
2.2.1.10. Xác định nguồn vô cơ và hữu cơ thích hợp lên men Error! Bookmark
not defined.
2.2.1.11. Tìm các điều kiện lên men thích hợp trên môi trƣờng dịch cám gạo
Error! Bookmark not defined.
2.2.2. Tinh chế GABA [31] .................................. Error! Bookmark not defined.
2.2.2.1. Khử màu .............................................. Error! Bookmark not defined.
2.2.2.2. Khử muối ............................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.2.3. Chạy sắc ký trao đổi ion...................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2.4. Kết tinh GABA ................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính GABA .......................... Error! Bookmark not defined.
2.2.3.1. Nuôi tế bào WSS-1 và tế bào PC12 .... Error! Bookmark not defined.
2.2.3.2. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào ........... Error! Bookmark not
defined.
2.2.3.3. Xác định GABA bằng phƣơng pháp HPLC [42] ..... Error! Bookmark
not defined.
2.2.3.4. Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào sự thay đổi màu iot [49] ..... Error!
Bookmark not defined.
2.2.3.5. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot ..... Error! Bookmark
not defined.

iii

defined.
3.2. Đánh giá hoạt tính của GABA bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng .... Error!
Bookmark not defined.
3.3.

Đánh giá hoạt tính của GABA ....................... Error! Bookmark not defined.

iv


3.3.1. Đánh giá khả năng sống chết của tế bào PC12 ........ Error! Bookmark not
defined.
3.3.2. Xác định GABA bằng HPLC ..................... Error! Bookmark not defined.
3.3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của GABA thông qua thụ thể ................ Error!
Bookmark not defined.
3.3.3.1. Nuôi cấy tế bào WSS-1 ....................... Error! Bookmark not defined.
3.3.3.2. Đánh giá hoạt tính GABA thông qua sự bắt màu Iot trên dòng tế bào
WSS1................................................................................................................Error!
Bookmark not defined.
3.3.3.3. Định lƣợng GABA dựa vào sự thay đổi màu iot Error! Bookmark not
defined.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

GABA

Axit gamma-amino butylric

GABA-T


MSG

Monosodium glutamate

OD

Mật độ quang học

PLP

Pyridoxalphosphate

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC

Thin layer chromatography

TPCN

Thực phẩm chức năng

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. Cấu trúc của GABA.......................................................................................4
Hình 2. Con đƣờng tổng hợp và phân hủy của GABA...............................................5
Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA...........................................................6


vii


Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh sạch vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh sạch của
mẫu............................................................................................................................52
Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi nổi sau 24 giờ nuôi cấy tế bào WSS-1
(A), sau 48 giờ (B)....................................................................................................53
Hình 27: Kết quả thay đổi OD của Iot dựa vào thay đổi nồng độ của GABA lên
men............................................................................................................................54
Hình 28: Đƣờng chuẩn giữa nồng độ GABA và mật độ quang tại bƣớc sóng
405nm........................................................................................................................55

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS.........................................................................15
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lƣợng của hai mẫu cám gạo....................................................30
Bảng 4: Giá trị glutamic acid của các mẫu cám gạo....................................................33
Bảng 5: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon.....................38
Bảng 6: Lƣợng GABA và mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ.........................39

viii


Bảng 7: Tỉ lệ MSG (%) ảnh hƣởng tới hiệu suất tạo GABA trong hai loại môi
trƣờng........................................................................................................................40
Bảng 8: Hàm lƣợng GABA trong dịch lên men theo hai phƣơng pháp đo...............55

ix


MỞ ĐẦU



Xuất phát từ cơ sở khoa học thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ-Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo
bằng Lactobacillus”
Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu:
+ Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng
chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ.
+ Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA.

11


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Gama-Aminobutyric axit (GABA)
GABA là một axít amin có trong tự nhiên, ở thực vật bậc cao nhƣ khoai tây,
đậu tƣơng, lúa, gạo lứt còn nguyên phôi.
Trong cơ thể, GABA đƣợc phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ƣơng vào
khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhƣng đến năm 1960, GABA mới đƣợc đề
xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể. Ngoài não, GABA cũng có
mặt trong tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa. GABA có chức
năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [5]. Hoạt động của GABA cùng với
glutamate và aspartate thực hiện phần lớn hoạt động thông qua khe xináp trong hệ
thống thần kinh trung ƣơng [20, 51].
Một số vai trò của GABA với sức khỏe của con ngƣời:
- Giảm bớt trạng thái căng thẳng và bất an, giúp ngủ ngon và ngủ sâu hơn.
- Điều trị mất tự chủ tạm thời: có mối quan hệ giữa việc thiếu GABA và
hiện tƣợng mất tự chủ hành vi của một số bệnh nhân. Trong những trƣờng hợp này,
bổ sung thêm GABA có thể ngăn ngừa sự vô hiệu hóa hoạt động các tế bào thần
kinh tại não bộ, tránh khỏi sự mất tự chủ của bệnh nhân.

qua đƣợc hàng rào để vào trong não. Do vậy, GABA đƣợc tổng hợp trong não bằng
con đƣờng trao đổi chất đƣợc biết là “GABA shunt” (hình 2). Giai đoạn cuối của
con đƣờng này sinh ra GABA thông qua quá trình chuyển hóa L-glutamate bằng sự
phân cắt của enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích truyền tín
hiệu thần kinh [20, 22].
Khi lƣợng GABA đƣợc sinh ra vƣợt quá ngƣỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh sẽ
đƣợc một enzym gọi là gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm
giảm bớt [20]. Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde
succinic nhƣng vai trò cơ bản của enzyme này là phá hủy GABA. Ngoài ra, những
chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lƣợng lớn GABA ở trong
não [20]. Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin

13


B6 hay còn đƣợc gọi là pyridoxal-5’-phophate đƣợc xem nhƣ một cofactor [32].
Cofactor này mang semialdehyde succinic tạo thành GABA ở trong não.

Hình 2: Con đƣờng tổng hợp và phân hủy của GABA (GABA shunt) [40]
GABA đảm bảo duy trì hoạt động bình thƣờng của não bộ đặc biệt là các
neuron thần kinh. GABA đóng vai trò chính trong việc giảm bớt sự hoạt động của
các neuron thần kinh và ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền tín hiệu.
GABA ngăn cản các tín hiệu căng thẳng và bất an đến vùng thần kinh trung ƣơng
bằng việc chiếm giữ hoặc khống chế các vùng tiếp nhận tin của các tế bào này [20].
Do vậy, GABA giúp cho thƣ giãn thần kinh và cải thiện đƣợc tinh thần. Cho tới
nay, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã công bố GABA giúp cho con ngƣời
có giấc ngủ ngon và sâu, cải thiện khả năng mất tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài,
rối loạn tăng động thiếu chú ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trƣớc thời kỳ
kinh nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54].
1.4. Enzym tổng hợp GABA

dƣơng ra ngoài tế bào. Quá trình này sẽ tạo ra điện thế âm ở trên màng tế bào dẫn
tới vị trí này thƣờng xuyên ở trạng thái phân cực rất mạnh [20].

Hình 3: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAA [59]

15


Thụ thể GABAB có hai tiểu đơn vị là GABAB1 và GABAB2 (Hình 4). GABAB1
có vai trò nhận dạng phối tử bên ngoài tế bào còn GABAB2 có nhiệm vụ ở trên
màng tế bào và truyền tín hiệu. Thụ thể GABAB đƣợc ứng dụng nhƣ là đích để tìm
các loại thuốc trong điều trị dƣợc học và liên quan đến vai trò truyền tín hiệu về
khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm
[20].

Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [59]

Hình 5: Hoạt động của thụ thể trƣớc và sau khi gắn kết với GABA [52]
1.6. Sản xuất GABA từ vi sinh vật
Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đƣờng khác nhau chẳng
hạn: quá trình khử cacbon của axít glutamic nhờ phân cắt của GAD [11, 8], tách
chiết từ các loại ngũ cốc [24, 27], tạo điều kiện tối ƣu để hạt gạo nảy mầm cho hàm
lƣợng GABA gần 15,8 g/100 g gạo [36], kích thích GAD trong mầm gạo để có thể

16


chuyển hóa GABA đạt hiệu suất là 29 g/100 g mầm gạo [36] hoặc lên men đậu
tƣơng bằng vi sinh vật [9, 11, 37, 55]. Công nghệ sử dụng các vi sinh vật đặc biệt vi
khuẩn lactic là một phƣơng pháp tốt để sản xuất GABA [11, 19, 21, 26, 28, 42, 45,

Trong các thập kỉ qua, các nghiên cứu cơ bản mở ra một lĩnh vực nghiên cứu
mới đối với các chất có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc
từ thực phẩm.Việc sử dụng các chủng trên trong lên men tổng hợp GABA đã đƣợc
nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong thực tế. Hiện nay, việc lên men
Lactobacillus plantarum để tổng hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu dƣ thừa của
nông nghiệp đang là một hƣớng mới đầy tiềm năng. Hoạt động của GAD trong
Lactobacillus plantarum giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại pH thấp của môi trƣờng.
Sau khi hấp thụ L-glutamate từ các transpoter đặc hiệu, GAD sẽ xúc tác phản ứng
decarboxyl hóa L-glutamate trong tế bào chất, dẫn đến tiêu thụ một proton trong tế
bào, kết quả làm tăng độ pH của tế bào chất và tăng pH ngoại bào do chuyển đổi
L-glutamate thành GABA kiềm hơn [25, 14].
1.7. Cơ chất tham gia sản xuất GABA
Monosodium glutamate (MSG) đƣợc xem nhƣ là một cơ chất trong quá trình
sản xuất Axit gamma-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic [28]. MSG là một
dạng muối của glutamic axit. MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà đƣợc tìm
thấy trong đa số các thực phẩm. Đặc biệt các thực phẩm chứa hàm lƣợng protein
cao chẳng hạn nhƣ bơ, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau. Trong thực phẩm
thƣờng sử dụng MSG để tạo ra vị đã đƣợc biết tới khoảng 1200 năm về trƣớc. Với
vị đặc biệt của MSG đã có tên là “ Unami” trong ngƣời dân Nhật Bản. Nó đã có mặt
trên thị trƣờng cách đây hơn 100 năm. Nhiều loại thực phẩm đã tăng thêm hƣơng vị
bằng cho thêm MSG với hàm lƣợng cao. Trong sữa của các bà mẹ thì hàm lƣợng
MSG chiếm tỉ lệ cao nhất so với các axit amino. MSG trong một số loại thuốc cao
cấp đã chứng minh có thể hoạt hóa tế bào thần kinh ở chuột cống mới sinh. Tuy
nhiên, quá trình hoạt hóa tế bào thần kinh đã không xảy ra trong thực phẩm có
MSG. Ngoài ra, dựa vào vô số những chứng minh khoa học cũng đã công bố MSG
là một gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe con ngƣời mà nó có vai
trò nhƣ một phân tử truyền tín hiệu không chỉ ở trong thần kinh mà còn ở một số
các mô khác. Tuy nhiên, nếu quá trình tích lũy MSG vƣợt quá ngƣỡng trong các khe
xináp của tế bào thần kinh sẽ liên kết tạo ra những độc tố dẫn tới phá hỏng hoặc làm




TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt:
1. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa
học và kĩ thuật.
2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2007), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục.
3. Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sƣ phạm
Hà Nội.
4. Nguyễn Xuân Thắng (2002), Receptor màng tế bào và tác dụng của thuốc, NXB
Y học, Hà Nội.
Tiếng anh:
5.

Abe Y., Umemura S., Sugimoto K.I., Hirawa N., Kato Y., Yokoyama N.
Yokoyama T., Junichi I., Masao I (1995), “Effect of green tea rich in γ aminobutyric acid on blood pressure of Dahl salt-sensitive rats”, American
Journal of Hypertens 8(1), 74-79.

6.

Ali F.W.O., Abdulamir A.S., Mohammed A.S., Bakar F.A., Manap Y.A.,
Zulkifli A.H., Saari N (2009), “Novel, Practical and Cheap Source for Isolating
Beneficial gamma-Aminobutyric Acid-Producing Leuconostoc NC5 Bacteria”,
Research Journal of Medical Science,3(4). 146-153.

7.

Bautista G.M., Lugay J.C., Cruz L.J., Juliano B.O. (1964), “Glutamic acid
decarboxylase activity as a viability index of artificial dried and stored rice”,
Cereal Chem, 41. 188-191.

using ITS-PCR and partial 16S rDNA sequence analyses”, J. Microbiol.
Biotechnol,16. 68-76.
Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C. (2007), “Production of gamma-

12.

aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and
its neuroprotective effect on neuronal cells”, J. Microbiol Biotechnol, 17. 104109.
13.

Choi S. I., Lee J. W., Park S. M., Lee M. Y., Ji G. E., Park M. S., Heo T. R
(2006), “Improvement of γ-aminobutyric acid (GABA) production using cell
entrapment of Lactobacillus brevis”, J. Microbiol. Biotechnol, 16. 562-568.

14.

Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., De Angelis M., Giuliani G.,
Meloni

M., De Servi B., Gobbetti M. (2009), "Synthesis of gamma-

aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional
grape must beverage and dermatological applications", Appl Microbiol
Biotechnol, 86. 41-731.
Foester C.W., Foester H. F. (1973), “Glutamic acid decarboxylase in spores

15.

of Bacillus megaterium and its possible involvement in spore germination”, J.
Bacteriol, 114. 1090-1098.

(2010), “γ-Aminobutyric Acid (GABA) Accumulations in Rice During
Germination”, Chiang Mai J, 37(1). 124-133.

19.

Jeun J.H., Kim H.D., Lee H.S., Ryu B.H. (2004), “Isolation and
identification of Lactobacillus sp produced γ-aminobutyric acid (GABA) from
traditional salt fermented anchovy”, Kor. J. Food Nutr, 1. 72-79.

20.

Jin Z., Mendu S.K., Birnir B. (2011),

GABA is an effective

immunomodulatory molecule, Amino Acids, 45. 87-94.
21.

Kang M.S., Cho S.C., Kook M.C., Pyun Y.R., Choi C.I. (2006), “Novel
strains of Lactobacillus spp and method for preparing γ-aminobutyric acid using
the same”, Korea. Patent. 10-0549094.

22.

Kayahara H., Sugiura T. (2001), “Research on physiological function of
GABA in recent years-improvement function of brain function and antihypertension”, Japanese Journal of Food development, 36(6). 4-6.

23.

Kim S.H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J. (2007), “Cloning and


26.

Komatsuzake N., Shima J., Kawamoto S., Momose H., Kimura T. (2005),
“Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated
from traditional fermented foods”, Food Microbial, 22. 497-504.

27.

Kono I., Himeno K. (2000), “Changes in γ-aminobutyric acid content during
beni-koji making”, Biosci. Biotechnol. Biochem, 64. 617-619.

22


Kook M.C. (2010), “Enhanced Production of γ-Aminobutyric Acid Using

28.

Rice Bran Extracts by Lactobacillus sakei B2-16”, J. Microbiol. Biotechnol,
20(4).
29.

763-766.

Lee H.Y., Park J.H., Seok S.H., Choi S.A., Baek M.W., Kim D.J., Lee Y.,
Park J.H. (2004), “ Dietary intake of various lactic acid bacteria suppresses type
2 helper T cell production in antigen-primed mice splenocyte”, J. Microbiol.
Biotechnol, 14. 167-170.
Leroy F., De Vuyst L. (2004), “Lactic acid bacteria as functional starter

ripening”, J Dairy Sci, 81. 1486-1491.

36.

Ohtsubo S., Asano S., Sato K., Matsumoto I. (2000), “Enzymatic Production
of v-Aminobutyric Acid Using Rice (Oryza sativa) Germ”, Food Sci. Technol.
Res, 29. 208-211.

23