ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.
Et Wils, Magnoliaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.
Et Wils, Magnoliaceae)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ngay từ những ngày đầu gia nhập nhóm nghiên cứu. Với vai trò là thành viên
cơ hữu dày kinh nghiệm, chị đã luôn tận tâm chỉ bảo, chia sẻ những kinh
nghiệm thực nghiệm quý báu và những khúc mắc trong cuộc sống với những


thế hệ học viên, sinh viên đi sau như tôi. Đặc biệt trong khoảng thời gian
chuẩn bị bảo vệ, chị đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học
nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh nói
riêng đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, cách tư duy, làm việc, tạo
nền tảng vững chắc giúp tôi thực hiện luận văn cũng như công việc của mình
sau này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới những người bạn lớp K51B
Công nghệ Sinh học, các anh chị, các bạn và các em sinh viên đã và đang là
thành viên trong nhóm Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi –
Lý sinh, Khoa Sinh học đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ với tôi những khi tôi gặp
khó khăn trong công việc và cuộc sống. Tôi rất may mắn có được những
người bạn, những người anh chị em thực sự như vậy.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm, ĐH
Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ và TS. Phương Thiện Thương, Viện
Dược liệu Trung ương đã cung cấp mẫu để chúng tôi thực hiện nghiên cứu
này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã luôn ủng
hộ và tin tưởng tôi, góp ý và tôn trọng những lựa chọn của tôi trong suốt
thời gian tôi học tập xa nhà, giúp tôi có một chỗ dựa vững chắc hoàn thành
những lựa chọn của mình.
Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí từ đề tài Trọng điểm
Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QGTĐ 10.28
Hà Nội, tháng 12 năm 2012
Học viên

1.2.2.

Nu i cấy tế bào......................................................................... 8

1.2.3.

Nu i cấy khối cầu đ bào ung hư (mu ice u r umor

spheroid)…………………........................................................................................ 10
1.2.4.
1.3.

M h nh in i o ...................................................................... 12
Mộ số ng ế bào ung hư ................................................................... 14

1.3.1.

D ng ế bào ung hư biểu m ruột kết ở người - HCT116..... 14

1.3.2.

D ng ế bào ung hư biểu m c tử cung ở người - Hela...... 14

1.3.3.

D ng ế bào ung hư biểu m ú ở người - MCF7 ................ 15

1.3.4.

D ng ế bào ung hư ú ở người - KPL4 ............................... 16


Hó chất sử dụng ................................................................................... 26

2.4.

Phương pháp hoạ hó à nhân nu i các ng ế bào in vitro............... 27

2.5.

Phương pháp hử độc ính MTS ............................................................ 28

2.6.

Phương pháp hử độc ính rên m h nh spheroi ................................. 30

2.7.

Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang ....................................... 31

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 33
3.1.

Kế u h o sá độc ính củ Hono io M gno o à Derrone rên m

h nh 2D……………. ................................................................................................. 33
3.1.1.

Với ng HCT116.................................................................. 33

3.1.2.

ăng rưởng của khối spheroid MCF7 ....................................................................... 56


3.3.

Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên hệ vi sợi actin ......... 59

3.4.

Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Derrone ên sự phosphory hó

Histon H3 tại vị rí Serine 10 .................................................................................... 62
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 66
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 68


Luận văn cao học

Danh mục bảng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao ......................................................................... 25
Bảng 2: Thiết bị sử dụng .......................................................................................... 26
Bảng 3: Hóa chất sử dụng ....................................................................................... 26
Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng..................................... 28
Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol,
Magnolol và Taxol ................................................................................................... 35
Bảng 6: Giá trị IC50 của Honokiol, Magnolol và Taxol với dòng HCT116 ............ 38
Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol và Taxol ................................... 39

Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol ............................................................................. 20
Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis ............................... 22
Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin ......................... 22
Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza................................................................. 24
Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng .................... 27
Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .................... 33
Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL
(phải) (100x)............................................................................................................. 33
Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL
(phải) (100x)............................................................................................................. 34

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
ix


Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái);
0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x)............................................................. 34
Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H)
.................................................................................................................................. 36
Hình 20: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Magnolol (M)
.................................................................................................................................. 36
Hình 21: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Taxol ......... 37
Hình 22: Tế bào Hela mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .......................... 38
Hình 23: Tế bào Hela sau 48h ủ Honokiol ở nồng độ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL

Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL
(phải) (100x)............................................................................................................. 46
Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H) ..48
Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M) .48
Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D) ....49
Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol .............. 49
Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25
ngày kể từ khi hạ giọt treo........................................................................................ 52
Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo ....... 53
Hình 43: Khối spheroid MCF7 ở mẫu ĐCSH sau 5 (a) và 7 (b) ngày, ủ với
Honokiol NĐ 5µg/mL sau 5 (c) và 7 (d) ngày và không tạo khối khi ủ Honokiol NĐ
10µg/mL (e) .............................................................................................................. 55
Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo ....56
Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 và 15
ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) ............................................ 56
Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 và 15
ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) ............................................ 57
Hình 47: Các khối spheroid dưới tác động của Honokiol trở nên lỏng lẻo về mặt
cấu trúc, các tế bào bên ngoài bong tróc ra khỏi khối từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt
treo (400x) ................................................................................................................ 57

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
xi


Luận văn cao học

Danh mục vi t t t


Acid deoxiribinucleic

ARN

Acid ribonucleic

c-FLIP

FLICE-like inhibitory protein

D

Derrone

ĐCDM

Đối chứng ung m i

ĐCSH

Đối chứng sinh học

DMEM

Du becco’s mo ifie E g e me ium

FBS

Huyế h nh h i bê – Fetal bovine serum


Human breast adenocarcinoma cell line
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-

MTS

carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium)

NĐ

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

Nồng độ

K19 Sinh học thực nghiệm
xiii


Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

NST

Nhiễm sắc thể

PBS

Đệm phosphate saline – Phosphate buffered saline


nhập lối sống có i m năng gây ung hư như hú huốc á í ận động à hực ph m
“Tây hó ”. Theo T chức Y tế thế giới – WHO có ho ng 12.7 triệu c ung hư à
7,6 triệu ca tử ong o ung hư được ghi nhận rong năm 2008 rong đó 56% số ca
à 64% rường hợp tử ong à ở các nước đ ng phá riển. Cũng heo dự báo của
WHO, tới năm 2020, số người mắc ung hư rên oàn cầu có hể ăng ên đến 15
triệu ca mới mỗi năm. Tỷ lệ chế o ung hư có hể chiếm 25% t ng số ca tử vong.
Theo số liệu c ng bố tại Hội th o Quốc gi ph ng chống ung hư năm 2010 Việt
N m có 126.300 c mắc mới. Căn bệnh n n y này đ ng ăng nh nh so ới 10 năm
rước [1].
Vốn à mộ đấ nước được hiên nhiên ưu đãi nằm rong ùng nhiệ đới gió
mù Việ N m có một th m thực vậ cùng phong phú à đ ạng với hơn 12.000
oài hực vật bậc c o hác nh u. Từ nhi u thế kỷ nay, thực vậ h ng chỉ à nguồn
cung cấp inh ưỡng cho con người mà c n à những phương huốc chữa bệnh hết
sức uý giá b o gồm thuốc chống ung hư nói riêng à các bệnh hác nói chung.
Bởi vậy, nghiên cứu m r các hợp chất từ nguồn ược liệu hiên nhiên có h năng
chữ ung hư à mộ hướng nghiên cứu được nhi u nhà hoa học à hầy thuốc đầu
ư ập rung nghiên cứu trong nhi u năm n y.
Trong u hướng này chúng i iến hành nghiên cứu hoạ ính háng u của
ba chất Hono io M gno o được ách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis
Rehd. Et wils, Magnoliaceae à Derrone được ách chiết từ cây V ng nem
Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp
cho nhóm Nghiên cứu Ung hư hực nghiệm, Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa
học Tự Nhiên Đại học Quốc gi Hà Nội nhằm mục đích:

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
1



Nguyên nhân sâu của những đặc điểm đặc rưng này à sự bất n của hệ gen
trong TBUT dẫn đến những biến đ i v mặt di truy n đồng thời cũng hỗ trợ các
chức năng rên. Ngoài r những nghiên cứu gần đây đ xuất hêm h i đặc rưng
hác củ ung hư b o gồm sự ái ập r nh r o đ i năng ượng à sự trốn ránh hệ
thống miễn dịch. Tuy nhiên cần những nghiên cứu sâu hơn để h i đặc rưng mới
này được c ng nhận rộng rãi [14].

Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
3


Luận văn cao học

Tổng quan

V mặ h nh hái TBUT có sự h y đ i há rõ né so ới tế bào b nh hường:
• V nhân: Nhân ăng ích hước đ ạng, nhi u hùy đặc biệ có những
nhân h ng lồ phân chi mạnh gọi à nhân uái nhân chi . Màng nhân
ày ên à đường vi n h ng đ u.
• V tỷ lệ giữ nhân à nguyên sinh chấ : Nhân o ên rong hi nguyên
sinh chất hẹp lại.
• V nguyên sinh chấ : Có nhi u t n hương hoái hó như nhi u hang,
hốc… Nguyên sinh chất chứ các chất chế tiết, thể ùi.
• Kh ng c n h năng ức chế tiếp úc nên ễ bong ra khỏi u.
V mặt chức năng TBUT biệ hó ém h ng hực hiện được những chức
năng b nh hường à ễ hoại tử. Đặc biệ chúng iế r các chất chỉ điểm được gọi

sinh à phân bào. Các ín hiệu này có hể xuất hiện do sự h y đ i củ các yếu
tố ngoại bào hoặc do sự h y đ i bên rong hệ thống truy n ín hiệu nội bào
dẫn tới sự ăng sinh à phân bào. Thậm chí rong một số rường hợp đặc biệt,
các ín hiệu ích hích phân bào có hể được tạo ra từ chính các TBUT. Khi đó
tế bào được ích hích phân chi h ng giới hạn. Quá r nh này iễn ra nhanh
à hoàn ất trong mộ ài giây h ng hể đ o ngược được. Trong cuộc đời một
con người có nhi u tế bào rong cơ hể có hể tr i u uá r nh hởi phá
nhưng h ng ph i tất c các ế bào đ u phá sinh bệnh. Đ số các ế bào hởi
phá hoặc h ng iến triển, hoặc chế đi hoặc bị cơ chế miễn dịch hiệu hó .
• Gi i đoạn húc đ y: Các ế bào rở nên “ c m” mộ cách bấ hường với
các ín hiệu ức chế phân bào. Trong các ế bào b nh hường, sự phân bào
hường được ích hoạt bởi các ín hiệu nhấ định; à ồn tại song song với
chúng à các ín hiệu ức chế phân bào. B nh hường h i cơ chế này cùng tồn
tại à phối hợp với nhau ở mức cân bằng ậy sự phân bào iễn ra n định
à có chức. Ở các TBUT h sự ngăn c n phân bào bị ê iệ hi đó ế bào sẽ
u n được chuyển từ ph G1 s ng S để tiến hành s o chép ADN à bước ào
mộ chu r nh ế bào mới bất kể các s i hỏng ADN có được khắc phục hay
h ng. Các ế bào s u gi i đoạn ăng rưởng này sẽ tiếp tục phá riển hành
các hối u ác ính.
• Gi i đoạn chuyển biến: Như đã biết, protein p53 giữ i r u n rọng
rong uá r nh b o vệ cơ hể chống lại sự ích ũy s i hỏng ADN có hể gây
nguy hiểm cho cơ hể. Khi p53 bị mất chức năng này h con đường apoptosis
của tế bào h ng hoạ động. V ậy tế bào hỏng có hể sống à iếp tục nhân
ên nh nh chóng. Những tế bào này có u hướng tạo r các hế hệ tế bào con

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
5


hác nh u rong cơ hể rước hi chúng rú ngụ ở vị rí mới à h nh hành hối
ung hư mới. Di căn heo đường bạch huyế hường gặp nhi u rong ung hư
biểu m có hể n ràn heo đường bạch huyết tại chỗ à đ i hi àm ắc, rồi

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
6


Luận văn cao học

Tổng quan

n đến mạch bạch huyế ùng. Trong phương hức i căn heo đường kế cận,
các TBUT đi heo mạch máu à hần kinh, theo lối í hi bị c n trở như ung
hư ạ ày n u ớp thanh mạc ào bụng đến buồng trứng… Di căn heo
đường máu hường gặp nhi u ở ung hư m iên ế . Khi đó ế bào ế húc ở
mao mạch à ăng rưởng ở đó. Như ậy kết qu i căn à sự h nh hành các
khối u thứ cấp ở vị rí có hể cách rất xa vị rí hối u nguyên phá b n đầu. Khi
ung hư đã iến triển đến gi i đoạn này h sự kiểm soá à đi u trị cực kỳ hó
hăn. Đây à gi i đoạn cuối cùng à nguy hiểm nhấ rong uá r nh phá riển
củ ung hư. Với khối u ành ính, gi i đoạn này h ng y ra. Các ế bào
trong khối u ành ính sinh s n chậm à bám ào các m iên ết tại chỗ, khối
u có r nh giới rõ ràng à h ng gây c m giác đ u cho người bệnh nếu ích
hước khối u h ng uá o h y chèn ép ào ây hần inh. Do đó hối u ành
h ng gây nguy hiểm cho người bệnh à ễ chữa trị [14, 32, 36].
Kể từ hi ung hư uất hiện, lịch sử oài người đã sử dụng à phá riển nhi u
phương pháp hác nh u để chống lại căn bệnh này như gi i phẫu, vậ ý rị liệu hó
trị liệu, miễn dịch trị liệu đi u trị hướng đích…

ách r hỏi cơ hể đem nu i cấy in vitro. S u đó chúng được ương ác ới các hợp
chất cần thử. Ưu điểm củ m h nh này à uy r được ính nguyên ẹn củ m
cũng như mối quan hệ giữa tế bào ới tế bào nhờ vậy mà nó có ính ương đồng cao
với đi u kiện in vivo. Tuy nhiên o những hó hăn trong hác biệt v mẫu mà
việc đánh giá hiệu qu của thuốc có nhi u sai số, do vậy việc sử dụng m h nh này
bị hạn chế à hó để áp ụng ào sàng ọc thuốc uy m ớn [4].

Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc
1.2.2. Nuôi cấy tế bào
Như đã biế các hử nghiệm độc ính b n đầu được tiến hành rên sinh
thiết khối u nu i cấy nhân ạo rong m i rường có hành phần h ng ác định, do
vậy uá r nh định ượng rấ hó hăn. Năm 1950, nhờ sự phá riển củ c ng nghệ
nu i cấy tế bào hành ạng đơn ớp 2D rong đĩ Pe ri hủy tinh hoặc nhựa, kết hợp

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
8


Luận văn cao học

Tổng quan

với sự phá riển củ m i rường có hành phần ác định v mặ hó học nên uy
r nh sàng ọc thuốc được tiến hành đơn gi n hơn rên các tế bào nu i cấy 2D này.
Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng ác định được mối
quan hệ đáp ứng li u giữ các ng ế bào hác nh u ới các nồng độ thuốc thử
hác nh u [39].
Các tế bào hi được phân ập đem nu i cấy in vitro hường phá riển hành

cầu nhỏ. S u đó các hối cầu nhỏ này được đư ào các đĩ nu i cấy chứ m i
rường nu i cấy ương ứng đã phủ một lớp giá đỡ bên ưới [11, 39].

Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư
Cấu rúc của một khối spheroid bao gồm:
• Lớp ng ngoài: Gồm kho ng từ 2-3 lớp tế bào sống phân chi mạnh
xếp hí nh u. Độ ày mỏng của lớp này ùy huộc từng ng ế bào hác

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
10


Luận văn cao học

Tổng quan

nh u ùy đi u kiện m i rường à ùy nguồn tế bào b n đầu ùng để tạo
spheroid.
• Lớp trung gian: Gồm những tế bào ẫn sống nhưng đã ngừng phân chi .
Các ế bào củ ùng này có hể h nhập để hành những tế bào củ ng
ngoài hoặc ng rong ùy thuộc đi u kiện nu i cấy (có mạch máu hoặc
h ng nồng độ g ucozơ pH…). V i r củ ùng này há u n rọng
rong các hí nghiệm đi u trị ung hư bằng hó chất, xạ trị.
• Lớp rong cùng: à õi hoại tử, bao gồm những tế bào đã chết, có nhân
kế đặc lại nên ánh sáng u ng học h ng hể uyên u được, ậy lớp
này có màu đen hi u n sá ưới ính hiển i. Độ ày mỏng của lớp này
ùy huộc ào ừng gi i đoạn hác nh u của uá r nh sinh rưởng khối
spheroid [34].