ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG
CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN
NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG
CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN
NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B
Chuyên ngành

: Sinh học thực nghiệm

Mã số

: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. BS. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện
để tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân
đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội
108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Sinh học Tế bào và lãnh
đạo Khoa Sinh học đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và
nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ,
giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

Học viên

Trần Thị Thanh Huyền


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tình hình dịch tễ học bệnh ung thƣ gan. ......................................... 3
1.1.1. Dịch tễ học trên thế giới. ................................................................ 3
1.1.2. Dịch tễ học tại Việt Nam. ............................................................... 4
1.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ gan. .................... 5
1.3. Mối liên quan giữa nhiễm HBV với ung thƣ gan. ........................... 7

3.1. Đặc điểm các nhóm nghiên cứu. ..................................................... 33
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới. ............................................................ 33
3.1.2. Đặc điểm về một số chỉ số cận lâm sàng thông thường. ............ 33
3.2. So sánh nồng độ HBV–ADN giữa các nhóm nghiên cứu. ............ 36
3.3. Xác định mức độ biểu hiện GP73. .................................................. 38
3.3.1. Xác định mức độ biểu hiện gen mARN GP73. .......................... 43
3.3.2. Xác định mức độ biểu hiện gen protein GP73............................ 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc mới và tần suất tử vong của một số bệnh ung
thư điển hình trên thế giới (Globocan – 2012). ...........................................................3
Hình 1.2: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc mới và tần suất tử vong của một số bệnh ung
thư điển hình ở Việt Nam (Globocan – 2012). ...........................................................4
Hình 1.3: Các nguyên nhân gây ung thư ....................................................................5
Hình 1.4: Cấu trúc của GP73 và sGP73 ...................................................................12
Hình 2.1: Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman ..........28
Hình 3.1: So sánh nồng độ HBV-ADN giữa các nhóm bệnh gan............................36
Hình 3.2: Kết quả giải trình tự gen GP73 ................................................................44
Hình 3.3: Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang trong Realtime PCR của gen GP73 và gen
nội chuẩn ABL. .........................................................................................................44
Hình 3.4: So sánh mức độ biểu hiện của mARN GP73 giữa các nhóm bệnh nhân và
nhóm người khỏe mạnh.............................................................................................46
Hình 3.5: So sánh mức độ biểu hiện của mARN GP73 giữa các nhóm nghiên cứu.
...................................................................................................................................47
Hình 3.6: Đường cong ROC của mARN GP73 và AFP ..........................................47
Hình 3.7: Nồng độ protein GP73. ............................................................................49
Hình 3.8: So sánh mức độ biểu hiện của protein GP73 giữa các nhóm bệnh nhân và


: Alpha Feto Protein

bp

: base pair

cADN

: complementary ADN

dNTP

: deoxyribonucleotide triphosphate

ADN

: Acid deoxyribonucleic

ABL

: Abelson

ARN

: Acid ribonucleic

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn

: Healthy control (Nhóm người khỏe mạnh)

LC

: Liver cirrhosis (Xơ gan)

M-MLV

: Moloney Murine Leukemia Virus

mARN

: Messenger ARN

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Real Time PCR

: Real Time Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi
trùng hợp tính theo thời gian thực)

RT- PCR

: Reverse transcriptase Polymerase chain Reaction (Phản
ứng chuỗi trùng hợp sử dụng enzyme phiên mã ngược)

RT


HBsAg (+) ở người lớn khoẻ mạnh từ 10 – 20% có nơi lên tới 26%. Như vậy, với
dân số hơn 90 triệu người, ước tính có hơn 10 triệu người đang mang HBV mạn
tính ở nước ta và nguy cơ phát sinh ung thư gan ở những người này là rất lớn.
Ung thư gan thường được chẩn đoán xác định ở giai đoạn muộn. Nguyên nhân
chẩn đoán ung thư gan muộn là do sự hạn chế về các phương pháp phát hiện hiện
nay. Các phương pháp chẩn đoán và sàng lọc ung thư gan hiện chủ yếu dựa vào xét
nghiệm định lượng AFP trong máu, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner),
chụp cộng hưởng từ. Tuy nhiên, AFP chỉ có độ nhạy 60-70%, trong khi đó siêu âm
chỉ có khả năng phát hiện được khối u gan có kích thước từ 2cm trở lên. Điều này
có nghĩa cần tiếp tục tìm kiếm các công cụ mới hỗ trợ cho phương pháp chẩn đoán
đang có.
GP73 (Golgi protein 73 hay còn được gọi là GOLM1- Golgi Membrane
Protein 1) là một protein xuyên màng golgi type II, có trọng lượng phân tử bằng 73
kDa. Chức năng của nó cho đến nay chưa được xác định rõ ràng. Các nghiên cứu
gần đây cho thấy, GP73 là một marker có tiềm năng hỗ trợ cho chẩn đoán sớm và
sàng lọc. Thậm chí khi so sánh giá trị của GP73 với AFP trong chẩn đoán ung thư

1


gan, một số tác giả còn cho thấy, mặc dù có độ đặc hiệu thấp hơn nhưng GP73 lại
có độ nhạy cao hơn so với AFP. Đặc biệt, khi so sánh đường cong ROC cho thấy
GP73 có giá trị tiên lượng HCC tốt hơn AFP. Với các lý do đó chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài ”Nghiên cứu giá trị của GP73 trong chẩn đoán ung thƣ tế bào
gan trên bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B” với các mục tiêu như sau:
1. Xác định mức độ biểu hiện gen của GP73 trên các nhóm bệnh nhân bệnh
gan do HBV: ung thư gan, xơ gan, viêm gan B mãn tính, và nhóm người khỏe
mạnh.
2. So sánh giá trị chẩn đoán ung thư gan của nồng độ GP73 và AFP huyết
tương.

đứng hàng thứ 5 ở nữ giới với tần suất là 6,2/100.000 dân.

Hình 1.2: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc mới và tần suất tử vong của một
số bệnh ung thƣ điển hình ở Việt Nam (Globocan – 2012).
Tại Bệnh viện Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh, mỗi năm tiếp nhận khoảng
500 ca ung thư gan mới. Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam có đến
10.000 ca mắc bệnh mới, và trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan

4


hàng đầu thế giới. Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn muộn
nên việc chữa trị không còn hiệu quả [51].
Do ung thư gan thường đa ổ và đa vị trí nên ngay trong những trường hợp ung
thư gan khu trú có phẫu thuật, chỉ khoảng 30-40% bệnh nhân sống được thêm 5
năm, còn trung bình là khoảng 3 năm.
Một nghiên cứu gần đây dựa trên các số liệu hiện có và sử dụng các thuật
toán để tính toán tiên lượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính tăng từ 6,4 triệu
người năm 1990 lên khoảng 8,4 triệu năm 2005 và tiên lượng đến năm 2025 là 8
triệu. Đó là kết quả của chương trình tiêm chủng để phòng nhiễm HBV. Trong khi
đó tỷ lệ xơ gan và ung thư gan do HBV lại có xu hướng tăng cao: năm 1990 là
21.900 đối với xơ gan, 9.400 đối với ung thư gan thì đến năm 2025 các số liệu
tương ứng là 58.650 và 25.000. Tỷ lệ tử vong do HBV tăng từ 12.600 năm 1990 và
có thể lên tới 40.000 ở năm 2025 [51].
1.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ gan.
Hình thành khối ung thư tế bào gan là một quá trình gồm nhiều giai đoạn và bị
tác động bởi nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
một số yếu tố khiến một người có nguy cơ mắc ung thư gan cao hơn những người
khác.


nguyên nhân chủ yếu gây ung thư gan tại các nước châu Á và châu Phi thì viêm gan
C lại là nguyên nhân chính gây ung thư gan tại Mỹ, Anh, Canada và Úc [23, 41].
Xơ gan: Xơ gan là bệnh mãn tính của gan, gây hủy hoại các tế bào gan và
thay thế bằng các tổ chức xơ hóa, các mô sẹo (scar tissue), khiến các tế bào mô gan

6


không thể thực hiện chức năng vốn có của nó. Hình thành xơ gan đã được chứng
minh là một phần quan trọng trong việc phát triển thành ung thư gan [40, 36]. Hầu
hết (80-90%) những người tiến triển thành ung thư gan đều đã xuất hiện các triệu
chứng của xơ gan [21]. Xơ gan có thể do các nguyên nhân chủ yếu như lạm dụng
rượu bia, viêm gan B, viêm gan C mãn tính, viêm gan nhiễm mỡ không do rượu.
Các nguyên nhân này cũng là các yếu tố liên quan mật thiết đến hình thành khối u
tại gan.
Lạm dụng rượu bia: Sử dụng rượu là một nguy cơ đã được chứng minh làm
gia tăng nguy cơ gây ung thư gan [25, 5]. Một nghiên cứu tổng quan hệ thống và
phân tích gộp thực hiện trên 19 nghiên cứu thuần tập chỉ ra rằng những người uống
3 cốc rượu mỗi ngày có nguy cơ mắc ung thư gan cao hơn 16% những người không
uống rượu, còn với những người uống trên 6 cốc rượu mỗi ngày thì tỷ lệ này lên đến
22% [4].
Bên cạnh đó, thuốc lá cũng được chỉ ra là một nguyên nhân trực tiếp dẫn tới
ung thư gan. Trên nhiều nghiên cứu, nguy cơ tương đối giữa hút thuốc lá và ung thư
gan, giữa những người đang hút thuốc lá so với người không hút thuốc vào khoảng
1,2 đến 2 lần. Nguy cơ tương đối này thậm chí còn cao hơn khi so sánh giữa người
nghiện thuốc lá nặng so với người hút ít [11]. Ngoài ra, sử dụng thực phẩm chứa
aflatoxins [38], lạm dụng anabolic steroids [2], có bệnh nhiễm sắc tố sắt mô
(Hemochromatosis) [3], béo phì và tiểu đường [37, 58] là những yếu tố nguy cơ
khác có thể gây ung thư gan; các chất mốc trong lạc, đậu cũng đã được chứng minh
có mối liên quan mật thiết với hình thành ung thư gan.

Chẩn đoán ung thư gan hiện nay bao gồm các khám xét lâm sàng, các xét
nghiệm cận lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh và mô bệnh học.
1.4.1. Khám lâm sàng.
Triệu chứng lâm sàng của ung thư gan thường nghèo nàn và không đặc hiệu.
Các triệu chứng này có thể không phát hiện được khi khối u còn nhỏ. Ung thư gan
thường gặp trên nền xơ gan nên có thể có những triệu chứng của xơ gan như chán
ăn, sợ mỡ, mệt mỏi. Bệnh nhân có thể gầy sút, vàng da, rối loạn tiêu hóa… Khi u đã
to, có thể xuất hiện các dấu hiệu như tức hay đau hạ sườn phải, xuất huyết dưới da,

8


phù, cổ trướng… Tuy nhiên, khi đã có những triệu chứng lâm sàng thì bệnh đã vào
giai đoạn muộn.
1.4.2. Xét nghiệm cận lâm sàng.
Một số các xét nghiệm chức năng đông máu, men gan, bilirubin máu,
protein, albumin máu… là những xét nghiệm không đặc hiệu chỉ có giá trị trong
đánh giá chức năng gan.
AFP (alpha-fetoprotein): là một protein trong huyết thanh, xuất hiện ở thời kỳ
bào thai và chỉ tồn tại sau khi trẻ ra đời khoảng 3 đến 4 tuần. Đối với người lớn,
bình thường nồng độ của AFP trong máu thấp dưới 10ng/ml. Khi bệnh nhân bị
HCC, lượng AFP tăng cao. Tuy nhiên, sự tăng nồng độ AFP trong máu phải đạt đến
mức có ý nghĩa là trên 400ng/ml. Ở mức 200 ng/ml độ nhạy của nó giảm đáng kể
(22%). Đối với những khối u nhỏ dưới 3cm đường kính thì AFP có độ nhạy thấp chỉ
đạt 25% [47]. Ngoài ra, AFP có thể tăng lên trong ung thư đường mật trong gan và
một số di căn từ ống tiêu hóa. Với những lý do này, AFP không còn phải là một dấu
hiệu hữu ích cho chẩn đoán HCC đặc biệt là với việc sàng lọc[18] [29].
1.4.3. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh

 Siêu âm

Chụp cắt lớp vi tính tuy có những ưu điểm đáng kể trong chẩn đoán HCC như
độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện những u nhỏ, đánh giá sự lan
tràn của khối u nhưng giá thành cao, độc hại do tia xạ và phải sử dụng thuốc cản
quang nên có thể gây ra tai biến khi sử dụng thuốc, đồng thời phương tiện thiết bị
phải tốt để chụp được đúng các thì.
 Chụp cộng hưởng từ (MRI)
Phương pháp này cho phép phát hiện được các khối u nhỏ hơn 2cm với độ
nhạy 81%. Sau tiêm đối quang từ (Gadolinium, Ferrit) có thể đánh giá được huyết
động của khối u.
Hình ảnh của HCC trên MRI:
- Khối u giảm tín hiệu trên T1 và tăng tín hiệu trên T2, có thể thấy đồng tín hiệu
trên T1 hoặc tăng tín hiệu trên T1 do chảy máu trong khối.
- Sau tiêm thuốc: tăng tín hiệu trên cả T1 và T2, thải thuốc nhanh.
- Có giả vỏ và có các vách xơ trong khối.

10


MRI còn giúp đánh giá được mạch máu của gan, các liên quan giữa tổn thương
với mạch máu trên các mặt phẳng khác nhau. MRI là một phương pháp tốt để chẩn
đoán, là phương pháp an toàn vì không sử dụng tia X. Tuy nhiên, nhược điểm vẫn là
phương tiện chẩn đoán có giá thành cao nên chưa được áp dụng rộng rãi trong điều
kiện Việt Nam ta hiện nay.
 Chụp động mạch gan
Hiện nay ít dùng để chẩn đoán HCC, thường được tiến hành cùng với nút hóa
chất động mạch gan để điều trị.
 Chụp nhấp nháy phóng xạ (Scintigraphy)
Sử dụng đồng vị phóng xạ có thể đánh giá được huyết động và ghi lại độ tập
trung của nó ở gan. Trong HCC là hình khuyết thuốc (ổ lạnh) nếu dùng 99mTc Sulfur
Colloid và hình tăng giữ thuốc nếu dùng

là 3042bp, 400 amino acid, khu trú trong phạm vi phức hệ Golgi. GP73 được biểu
hiện trong các tế bào biểu mô người. mARN của GP73 được phát hiện lần đầu tiên
năm 2000 khi người ta khảo sát mức độ biểu hiện gen trên một bệnh nhân viêm gan
dạng tế bào khổng lồ (hợp bào) [31]. Tiếp theo đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh
GP73 có biểu hiện ở mức độ thấp trên các tế bào gan bình thường, trong khi đó tăng
rất cao trên các bệnh nhân viêm gan cấp tính, mạn tính và xơ gan [45].
GP73 là một protein được khu trú trong tế bào tuy nhiên nó được biểu hiện
mạnh mẽ trên các mô ngoại bào và gen mã hóa của nó tăng điều hòa trong các bệnh
gan không ác tính. Tuy nhiên, gần đây có rất nhiều nghiên cứu cho thấy GP73 là
một dấu ấn phân tử có giá trị cao trong chẩn đoán ung thư gan. [45]

.

Hình 1.4: Cấu trúc của GP73 và sGP73
GP73 chứa một đầu tận cùng Nitơ ở trong nội bào với một vùng dịch mã cố
định (myristoylation) tiếp theo là vùng xuyên màng và một vùng ngoại bào có
đầu tận cùng Cacbon có kích thước lớn. Đầu tận cùng Nitơ chứa 2 đoạn xoắn
dạng lò xo và được nitơ hóa. Đầu tận cùng Cacbon có tính axit cao và chưa
rõ chức năng [17].

12


Hiện nay, vai trò sinh học và chức năng sinh hóa của GP73 vẫn chưa được
xác định rõ ràng. Có lẽ GP73 có vai trò cấu trúc trong phức hệ Golgi hoặc tham gia
vào con đường vận chuyển và biến đổi các sản phẩm tiết của nó. Thực tế, phân tích
trình tự của protein này cho thấy chúng không có cấu trúc chức năng đặc biệt.
Luminal coiled-coil domain (phần trình tự đầu N-tận cùng) của nó là cần và đủ cho
sự thu hồi của nó trong phức hệ Golgi, tuy vậy hoạt tính acid ở đầu tận cùng C cho
đến nay vẫn chưa rõ về mặt chức năng [48, 17]. Các nghiên cứu gần đây về gen

bệnh nhân bị xơ gan, 789 bệnh nhân bị HCC, 61 bệnh nhân có tổn thương gan ác
tính khác và 622 bệnh nhân mang 14 loại ung thư khác nhau, tác giả đã cho thấy
rằng biểu hiện của GP73 trong huyết tương của bệnh nhân HCC nhiễm HBV cao
hơn đáng kể so với nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính, nhóm bệnh nhân không
bị bệnh về gan và nhóm người khỏe mạnh với độ nhạy và độ đặc hiệu của GP73 là
76,9% và 97,4% so với AFP là 58,2% và 85,3%. Biểu hiện của GP73 tăng lên đáng
kể ở nhóm bệnh nhân HCC so với nhóm người khỏe mạnh, và biểu hiện của GP73
giảm xuống đối với những bệnh nhân HCC sau khi đã phẫu thuật cắt bỏ khối u và
nó lại tăng lên đối với trường hợp khối u tái phát [46, 65].
1.5.3. Điều hòa biểu hiện gen GP73.
Dựa trên mô hình nhiễm adenovirus in vitro và trên các nghiên cứu sơ bộ ở
các mẫu sinh thiết của bệnh nhân viêm gan dạng tế bào khổng lồ, một số nghiên cứu
đã chỉ ra rằng gan của các bệnh nhân này GP73 biểu hiện mạnh ở các tế bào đa
nhân [26, 31]. Nghiên cứu của Kladney và cộng sự cho thấy ở những bệnh nhân
viêm gan cấp mức độ biểu hiện của GP73 tăng, nó được thấy trên cả bệnh nhân
viêm gan cấp nhiễm virus viêm gan và bệnh nhân không nhiễm virus viêm gan [32].
Kladney cũng đã nghiên cứu và quan sát trên mô hình nhiễm Adenovirus gây ra
mức độ biểu hiện của GP73 trong các tế bào gan HepG2 và HepG3B. GP73 được
biểu hiện nhanh chóng trong mô hình nghiên cứu này, dựa trên sự có mặt của
protein E1A Adenovirus, điều đó gợi ý cho việc điều hòa ở mức độ phiên mã. Các
tế bào HepG2 2.2.15 ban đầu được chuyển ổn định ở toàn bộ hệ gen HBV vào trong
các tế bào HepG2. Chúng được biểu hiện ở mức độ mARN, và hỗ trợ hình thành
các hạt nhiễm HBV trong in vitro. GP73 biểu hiện mạnh trong các tế bào HepG2
2.2.15, trong khi đó các tế bào HepG2 và HepG2T14 không hỗ trợ hình thành hạt
nhiễm HBV thì GP73 lại không biểu hiện [33].

14


1.5.4. Ý nghĩa của GP73 trong chẩn đoán HCC.