Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử
vi khuẩn Bacillus subtilis
Mô tả tài liệu:
Việt nam là một nước nông nghiệp có nghành chăn nuôi rất phát triển và có đóng
góp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất,
chất lượng sản phẩm và cải thiện môi trường chăn nuôi rất được quan tâm ở nước ta
hiện nay. Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm
của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để
sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều
kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đó sản xuất chế phẩm sinh học
cung cấp cho nghành chăn nuôi.

Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng
ngày càng phổ biến. Đặc biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
Nước ta là một nước nông nghiệp, ngành chăn nuôi rất phát triển. Với mục đích
tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo
vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các loại hoá chất độc hại và đặc biệt là
nhằm
hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, chế phẩm sinh học là một giải
pháp tối ưu để thực hiện mục đích này. Vì vậy, các nhà chăn nuôi đã rất chú ý đến vấn
đề sử dụng chế phẩm sinh học.
Chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật sống có lợi, người ta chọn lọc các vi
sinh vật có lợi có tính đối kháng cao để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng có lợi cho
hệ vi sinh vật đường ruột, khôi phục lại hoạt động bình thường, ức chế vi sinh vật có
hại cho vật nuôi. Ngoài ra, chế phẩm sinh học còn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và
khả năng tiêu hoá, cung cấp chất dinh dưỡng…
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc



Eubacteriales

Họ:

Bacillaceae

Giống: Bacillus


Loài:

Bacillus subtilis

2.1.3. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng
được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước….
Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng
10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis
rất hiếm.
Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào
sinh dưỡng Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).

2.1.4. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 –
3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông.
Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm.
Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng
chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000).

2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy

Với các vi sinh vật gây bệnh
Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số
lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi
khuẩn và nấm.
Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh
dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của
nấm bị ức chế.
Với đồng loại
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu
cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay
nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra
bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ.
Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất
sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết
những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá


vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang
hình thành bào tử tiêu thụ.
Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng
lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ
cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt.
Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt
những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến
khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004).
2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua
những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích
hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi…. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo
được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu
tạo chủ yếu là lipoprotein.
Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành
phần hoá học là protein và có sự tham gia của keratin đây là những lớp có khả năng
ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước, chúng có tác dụng
tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi.
Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất
đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở
trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương. 2004).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học, tính chất sinh lí.

2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử
Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều
glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoài ra còn có sự tham gia của keratin.
Nguyên sinh chất của bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển
hoá ở trạng thái không hoạt động. Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu
hoạt động.
Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic. Acid này chiếm
từ 5- 12% khối lượng khô của bào tử (acid này không bao giờ có trong tế bào sinh
dưỡng, nó được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm).
Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết.


2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử (Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự, 1998)
Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn
được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử.
Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hoá, nảy mầm và sinh trưởng:
Hoạt hoá
Sau khi cho bào tử Bacillus subtilis tồn tại ở trạng thái nghỉ 7 ngày, ta xử lí ở
60o

kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với
nhiệt độ.
Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới
dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài.
Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm
cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.
2.3. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và sự loạn khuẩn
2.3.1.Hệ vi sinh vật đƣờng ruột
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), ở ruột và dạ dày động vật khi mới sinh ra hoàn
toàn không có vi khuẩn, sau vài giờ từ khi chúng sinh ra mới thấy có sự xuất hiện của
một vài vi khuẩn và từ đó chúng bắt đầu sinh sản dần. Sau đó một vài vi khuẩn khác
sẽ
theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá, sống và sinh sôi nảy nở ở đó, chúng sẽ
biến đổi ít nhiều nhưng cơ bản chúng vẫn tồn tại cho đến khi con vật chết.
Thành phần, số lượng của vi sinh vật đường tiêu hoá phụ thuộc vào tuổi tác của
gia súc, cách nuôi dưỡng, chăm sóc…ngoài ra còn có các điều kiện vật lí, hoá học của
môi trường đường tiêu hóa.
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970) và nhiều tác giả khác, có thể chia hệ vi sinh vật
đường tiêu hoá ra làm 2 nhóm:
Nhóm vi sinh vật tuỳ nghi
Một số những vi sinh vật này là những vi sinh vật có hại, chúng thay đổi theo
điều kiện thức ăn, môi trường, đường tiêu hoá, khả năng đề kháng của cơ thể…như:
Samonella, Klebsiella, E. coli, Clostridium, Shigella, Staphylococus….
Đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm. Dưới những điều
kiện môi trường thích hợp chúng phát triển, sản sinh độc tố xâm nhập phá vỡ tế bào
đường ruột, gây tổn thương thành đường ruột nguy hại cho gia súc gia cầm.
Nhóm vi sinh vật bắt buộc 


Đây là những vi sinh vật chịu được độ pH thấp, chúng phát triển tốt trong đường


Nhóm này gồm những vi sinh vật sinh một số enzyme có khả năng phân huỷ các
chất trên: amylase, protease, glucanase, cellulase… gồm các vi khuẩn Lactic, Bacillus
subtilis, Isotrichs, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…
Theo Nguyễn Thị Vân Hương (1990), bổ sung chế phẩm Saccharomyces
boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm được hệ số chuyển biến thức ăn trên 1 kg
tăng trọng, làm tăng sức kháng bệnh của gà làm giảm tỉ lệ chết, từ đó góp phần làm
tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.
Đối với thú trưởng thành tiêu hoá chủ yếu nhờ enzyme thì sự xuất hiện của vi
sinh vật sản sinh enzyme cũng giúp thú tiêu hoá thức ăn tốt hơn. So với enzyme tổng
hợp, nguồn enzyme của các vi sinh vật tương đối lí tưởng, do có nhiều ưu điểm hơn so
với các nguồn từ động vật và thực vật như:
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh.



Nguồn nguyên liệu dễ nuôi cấy, dễ kiếm và rẻ tiền.
Các enzyme của vi sinh vật có hoạt tính cao. 
Ngoài ra, có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để đạt
được hiệu quả cao trong sản xuất (Trần Thị Minh Chiến, 2002).
2.3.3. Sự loạn khuẩn
Từ loạn khuẩn được Nissle đưa ra vào năm 1916. Ông cho rằng các vi khuẩn có
trong ruột người và gia súc luôn ở thế quân bình để đảm bảo cho sự tiêu hoá bình
thường của vật chủ.
Thế quân bình này dựa vào 2 cơ chế:
(1) Cùng tranh giành chất dinh dưỡng nào đó cần cho sự sinh trưởng của
chúng.
(2) Chúng có thể tiết ra chất có tính kháng đối với các vi khuẩn khác.
Các nguyên nhân gây loạn khuẩn:
Theo Tô Minh Châu (2004) thì có 3 nguyên nhân:

Năm 1989, Fuller định nghĩa probiotic như là thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có
tác động có lợi đến động vật chủ thông qua cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó.
Năm 1992, Havenar và cộng sự chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn
chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông mở rộng định nghĩa
probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hoặc hỗn hợp các vi sinh vật sống mà
chúng có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ
vi sinh vật bản xứ.
2.4.2.Chức năng sinh học của probiotic


Trung hoà độc tố, khử độc và phân huỷ một số thuốc có độc tính cao.
Kích thích hệ thống miễn dịch.
Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột
Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống
enzyme
Tổng hợp vitamine nhóm B và K ở manh tràng. 
2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis
Trong y học và chăn nuôi
Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng Đức
Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên (là các bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm
Bacillus subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy.
Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus
subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang.
Năm 1962,Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu
chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên
men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả.
1958 - 1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus
subtilis dùng trị bệnh đường ruột.
Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế
phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người.