ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------   ------

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2008


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------   ------

BÙI THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES
SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:

60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008
Tác giả

Bùi Thị Hà


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Những chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN..................................................................3
1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên............................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn..................................................4
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn...............................................5
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn....................................................................6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI... ...........8
1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy.....................................8
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)..................................9
1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................10
1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)............................................10
1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces..........................................11

2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB.....................33
2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR...................34
2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose......................................35
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu.....................................................................36

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè......................37


3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn.............................................................38
3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn............................38
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao..........................41
3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2....42
3.3.1. Đặc điểm hình thái......................................................................42
3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy........................................................................43
3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................45
* Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon...............................................45
* Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp .........................................................46
* Khả năng chịu muối...........................................................................46
* Khả năng sinh enzym ngoại bào........................................................47
3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1..............................48
3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1....................50
3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn...........52
3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp.....................................52
3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon.....................................................54
3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ..........................................................56
3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử........57
3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn..........57
3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR..................58
Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

: Khuẩn ty khí sinh

HTKS

: Hoạt tính kháng sinh

HTKN

: Hoạt tính kháng nấm

MT

: Môi trƣờng

KHVQH

: Kính hiển vi quang học

KHVĐT

: Kính hiển vi điện tử

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

RNA

: Ribonucleic Acid


Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1...................................47
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm
kiểm định.........................................................................................................48
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis....50
Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52
Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng
lên men khác nhau...........................................................................................53
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS
của 2 chủng R2 và Đ1.....................................................................................55
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2
chủng R2 và Đ1...............................................................................................56


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh.............................38
Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu.................39
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm.........................40
Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn.....................42
Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2................................42
Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1...............................43
Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng...........................44
Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn.......................................47
Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2....49
Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS ............54
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS.........55
Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS.............57
Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn.........................58
Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.....59



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-22. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có
hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè.
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng
dụng.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
* Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Thái Nguyên.
- Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên.
* Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV
kiểm định.
2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
từ các mẫu đất khác nhau.
3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một
số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng
tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-4amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể
gây bệnh cho người, động vật [7].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng
0,2

1 m đến 2

3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22].

Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một
trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm
mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5

50 m, dễ

quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.

Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện
thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN,
nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy
sợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên
trong chứa các bào tử nang [7].
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty
khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ
khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất
trong phân loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF),
dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có
hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của
cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ,
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành
dạng lông [9].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-6Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu
protein với độ dày khoảng 300

400 A0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào

tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ,
pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những
tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-7trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30],
[32], [35] [36].
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành
4 nhóm chính [6], [8].
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinose và galactose.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so
với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom
và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm
sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).
Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote
ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong
khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25

45% [11].

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có

RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng. RA cho những cuống
sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn. S cho những cuống sinh bào tử phát triển
mạnh và xoắn.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




-9xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp
xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau
về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì
vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ
tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh
học phân tử [45].
1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)
Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng
20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc
định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:
- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần
peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào.
- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt
xích của PG.
- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân
loại cơ bản cho các chi đó.

Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh
lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số.
Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau
giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình
thái, sinh lý, sinh hóa.
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ
vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay
được sử dụng.
- Công thức của Sokal và Michener (SSM )

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên