Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT THU NHẬN VÀ TÁCH DÒNG TRỌN VẸN
CÁC PHÂN ðOẠN HA, NA VÀ M CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
Nguyễn Nam Thắng1, Phạm Ngọc Khái1, ðinh Duy Kháng2, Lương Xuân Hiến1
1
2

Trường ðại học Y Thái Bình
Viện Công nghệ sinh học
TÓM TẮT
Các biến ñổi di truyền trên các phân ñoạn HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 có thể làm thay ñổi các
ñặc tính kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc, ñộc lực và khả năng gây bệnh của virus. Nghiên
cứu này trình bày một phương pháp mới ñể khuếch ñại và tách dòng trọn vẹn các phân ñoạn HA, NA và M của
virus cúm A/H5N1. Mẫu RNA của virus cúm A/H5N1 ñược sử dụng ñể khuếch ñại trọn vẹn các phân ñoạn
HA, NA và M bằng kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) hai bước. Kỹ thuật
ñược thực hiện với 3 cặp mồi ñặc hiệu ñược thiết kế trên vùng 3’UTR và 5’UTR không dịch mã (UTR untranslated region) của các phân ñoạn tương ứng. Sản phẩm khuếch ñại ñược ñiện di kiểm tra và tinh sạch từ
thạch agarose, sau ñó ñược gắn với vector pJET1.2/blunt ñể tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA của
chủng virus A/H5N1 nghiên cứu. Mười một mẫu bệnh phẩm virus A/H5N1 thu thập từ gia cầm và người ñược
tách RNA làm khuôn thử nghiệm ñể ñánh giá ñộ tin cậy của phương pháp. Sau khi tối ưu hóa, kỹ thuật RTPCR ñã ñược ứng dụng ñể khuếch ñại các phân ñoạn HA, NA và M từ 11 mẫu khuôn RNA của virus cúm
A/H5N1. Kết quả ñiện di cho thấy sản phẩm khuếch ñại của mỗi phân ñoạn của hệ gen là một băng ñơn nhất
có thể quan sát rõ ràng trên thạch agarose. Sau khi tinh sạch, sản phẩm RT-PCR ñược gắn vào vector
pJET1.2/blunt và chọn lọc tái tổ hợp. Kết quả giải trình tự cho thấy tất cả các trình tự nucleotide ñã tách dòng
có ñộ tương ñồng cao với trình tự của phân ñoạn tương ứng của virus A/H5N1. Kỹ thuật khuếch ñại và tách
dòng trọn vẹn các phân ñoạn HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 phân lập từ người và gia cầm ñã ñược xây
dựng thành công và có thể ứng dụng trong các nghiên cứu về virus cúm A/H5N1 ở mức ñộ phân tử.
Từ khóa: Cúm gia cầm, A/H5N1, HA, NA, M, RT-PCR, tách dòng

ðẶT VẤN ðỀ
Virus cúm A có hệ gen bao gồm 8 phân ñoạn
RNA ñơn âm, mã hóa 11 protein của virus. Do có

chủng cúm A/H5N1 gây bệnh ñể làm nguồn nguyên
liệu kiến tạo vaccine thế hệ mới là cần thiết. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp
khuếch ñại và tách dòng trọn vẹn các phân ñoạn
HA, NA và M của virus cúm A/H5N1 từ một số
chủng phân lập tại Việt Nam, nhằm tạo ra các
plasmid tái tổ hợp có chứa trình tự gen HA, NA và
M. Các plasmid này có thể sử dụng ñể giải trình tự
nhằm tìm hiểu các biến ñổi di truyền của virus cúm
A/H5N1 và lưu giữ bảo quản lâu dài ñể sử dụng
trong các nghiên cứu khác.
425


Nguyễn Nam Thắng et al.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tạo plasmid tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào khả
biến E. coli

Thiết kế mồi

DNA tinh sạch từ thạch agarose ñược sử dụng ñể
tạo plasmid tái tổ hợp với bộ sinh phẩm CloneJET PCR
Cloning kit (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản
xuất, mô tả vắn tắt với các bước như sau:

Sử dụng trình tự nucleotide của các phân ñoạn HA
(H5), NA (N1) và M của virus cúm A/H5N1 ñã ñược
công bố trên GenBank và so sánh các trình tự bằng


Tổng hợp cDNA (complementary DNA)
Năm µl RNA tách chiết ñược sử dụng làm khuôn
ñể thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với bộ sinh
phẩm RevertAid™ H Minus First Strand cDNA
Synthesis Kit (Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản
xuất. Phản ứng sao mã ngược ñược thực hiện với mồi
ñặc hiệu Uni12: 5’- AGCAAAAGCAGG -3’
(Hoffmann et al., 2001).
Phản ứng khuếch ñại phân ñoạn HA, NA và M và
kiểm tra
Thực hiện ñồng thời với hai hệ thống: PCR Master
mix 2X (Fermentas) và TripleMaster PCR System
(Eppendorf). Phản ứng ñược thực hiện trong ống 0,2 ml
với tổng thể tích là 50 µl và sử dụng máy luân nhiệt
Mastercycler gradient (Eppendorf). Sau khi xác ñịnh
ñược các ñiều kiện tối ưu, phản ứng khuếch ñại phân
ñoạn HA, NA và M của virus A/H5N1 ñược thực hiện
với 11 mẫu cDNA của các chủng virus cúm A/H5N1
thu thập từ các nguồn khác nhau.
Sản phẩm PCR từ khuôn cDNA của các chủng
ñược ñiện di trên thạch agarose 0,8%, sau ñó ñược phân
lập và tinh sạch từ thạch với bộ sinh phẩm QIAquick
gel extraction kit (Qiagen).
426

4. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 22oC trong 5 phút. Sử
dụng 2,5 µl hỗn hợp phản ứng ñể biến nạp vào tế bào
E. coli TOP10 theo phương pháp hóa học và nuôi
cấy trên thạch LB (Luria-Bertani Broth), qua ñêm.


Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011
và M của virus cúm A ñã công bố trên GenBank bằng
các phần mềm chuyên dụng, 3 cặp mồi ñã ñược thiết
kế trên vùng 3’ UTR và vùng 5’ UTR ñể có thể
khuếch ñại trọn vẹn 3 phân ñoạn tương ứng nói trên.
Trình tự các mồi ñược trình bày ở bảng 1.
Phản ứng PCR
Phản ứng PCR khuếch ñại các phân ñoạn HA,
NA và M của virus H5N1 ñược thử nghiệm ñồng
thời với Mastermix 2X và TripleMaster PCR
System. Kết quả thử nghiệm cho thấy hiệu quả
khuếch ñại của TripleMaster PCR System tốt hơn
so với PCR Mastermix 2X. Do ñó TripleMaster
PCR System ñược lựa chọn ñể khuếch ñại phân

ñoạn HA, NA và M của virus H5N1 từ các mẫu
bệnh phẩm.
Sau khi thử nghiệm trong các ñiều kiện khác
nhau, thành phần phản ứng và chương trình nhiệt tối
ưu ñã ñược xác ñịnh. Thành phần phản ứng bao
gồm: 5 µl 10X HighFidelity buffer, 1 µl 10 mM
dNTP (deoxyribonucleotide triphosphates), 0,5 µl
TripleMaster Polymerase mix, mồi xuôi và mồi
ngược mỗi loại 30 pmol, 4 µl cDNA và bổ sung
nước siêu sạch cho ñủ thể tích là 50 µl. Chương trình
nhiệt gồm các bước: biến tính ban ñầu ở 94oC trong
2 phút; tiếp theo là 40 chu kỳ (94oC: 20 giây; 60oC:
20 giây; 72oC: 2 phút 30 giây); giai ñoạn kéo dài
chuỗi sau cùng thực hiện ở 72oC trong 10 phút.

1 - 29

58.7

N1R-1398

AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAYMAAYTAC

1398 - 1367

55.2

MF-1

AGCRAAAGCAGGTAGATRTTGAAARATGA

1 - 29

57.3

MR-1027

AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCCA

1027 - 1000

53.9

Ký hiệu: M=A/C; R=A/G; S=G/C; Y=C/T; K=G/T; V=A/G/C; H=A/C/T; D=A/G/T; B=C/G/T; N=A/G/C/T; Tm: Nhiệt ñộ nóng
chảy của mồi

8

9 10

11

2,00
1398 bp
0,75
0,25
kb

M NC PC

1

2

3

4

5

6

7

8


dụng ñể tạo plasmid tái tổ hợp với bộ sinh phẩm
ClonJETTM PCR cloning theo hướng dẫn của nhà
sản xuất.

Plasmid tái tổ hợp ñược biến nạp vào tế bào E. coli
TOP10 và nuôi cấy trên thạch LB có ampicillin, ở
37oC, qua ñêm. Plasmid pJET1.2/blunt có chứa gen
kháng ampicillin nên những tế bào E. coli dung nạp
plasmid thì mới có khả năng phát triển trên môi trường
có bổ sung ampicillin. Ngoài ra, trên plasmid này còn
chứa gen tổng hợp enzyme giới hạn eco47IR gây chết
tế bào vi khuẩn. Vị trí gắn với sản phẩm PCR nằm ở
giữa gen này. Vì vậy, những chủng vi khuẩn có thể phát
triển ñược trên môi trường thạch LB có bổ sung
ampicillin ñều có plasmid tái tổ hợp.
Phản ứng colony PCR ñược thực hiện ñể lựa chọn
các khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen mong
muốn. ðối với mỗi mẫu, tiến hành kiểm tra từ 5 - 8
khuẩn lạc ñể lựa chọn các khuẩn lạc mang plasmid tái
tổ hợp chứa trình tự DNA cần tách dòng (Hình 2).

Gen NA

Gen HA

Gen M

Hình 2. Sản phẩm colony PCR ñể lựa chọn các khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen HA, NA và M của virus cúm H5N1.

Bảng 2. ðộ tương ñồng cao nhất (max identity) của các


98

99

4

98

98

99

5

97

98

98

6

98

97

98

7


11

99

99

99

428

Các khuẩn lạc có kết quả colony PCR dương tính
ñược nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung
ampicillin, qua ñêm và tách chiết DNA plasmid. DNA
của tất cả các mẫu plasmid ñều ñược giải trình tự và so
sánh với các trình tự gen trên GenBank bằng chương
trình BLAST. Kết quả so sánh cho thấy tất cả các trình
tự gen ñã tách dòng ñều có ñộ tương ñồng cao với trình
tự gen tương ứng của các chủng virus H5N1 ñã công bố
(Bảng 2). Hai mươi bảy trình tự nucleotide của các
phân ñoạn gen HA, NA và M của các chủng virus
H5N1 thu thập từ gia cầm ñã ñược ñăng ký trên
GenBank (các mã số ñăng ký từ CY095680 ñến
CY095706).
BÀN LUẬN
Giải trình tự toàn bộ hệ gen là phương pháp tốt
nhất ñể có thể hiểu rõ các ñặc ñiểm di truyền của virus
H5N1, tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém và



tương ñối cao (54 - 58oC), ñảm bảo tính ñặc hiệu của
mồi, hạn chế các sản phẩm phụ khi thực hiện phản
ứng PCR. ðể phản ứng khuếch ñại gen có hiệu quả tốt
nhất, chúng tôi ñã tiến hành thử nghiệm phản ứng ở
các ñiều kiện khác nhau và ñã xác ñịnh ñược chương
trình nhiệt (nhiệt ñộ, thời gian gắn mồi; thời gian kéo
dài chuỗi; số chu kỳ khuếch ñại) và thành phần phản
ứng (nồng ñộ dNTP; nồng ñộ mồi; nồng ñộ enzyme)
tối ưu cho phản ứng.

Việc khuếch ñại và tách dòng trọn vẹn các phân
ñoạn gen HA, NA và M của virus cúm H5N1 là tiền
ñề cung cấp nguyên liệu gen và trình tự nucleotide
cho các nghiên cứu di truyền phân tử liên quan ñến
ñặc tính kháng nguyên, tính kháng thuốc, khả năng
lây nhiễm, ñộc lực, khả năng gây bệnh, sự tiến hóa
và các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của virus
cũng như ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất vaccine,
phát triển các sinh phẩm chẩn ñoán dựa trên kỹ thuật
miễn dịch.

Sau khi ñiện di và tinh sạch từ thạch agarose,
DNA ñược gắn vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp
vào tế bào E. coli TOP10. Vector pJET1.2/blunt có
hiệu quả biến nạp cao với tế bào E. coli TOP10 và
sau khi nuôi cấy mỗi tế bào E. coli có thể tạo ra 300 700 bản sao. Việc lựa chọn các khuẩn lạc có chứa
plasmid tái tổ hợp có thể thực hiện bằng phản ứng
colony PCR hoặc sử dụng enzyme giới hạn. Các
phân ñoạn gen của virus H5N1 có kích thước lớn
(trên 1000 bp) và có ñộ biến ñổi cao nên nếu dùng

cầm H5N1 ở khu vực phía Bắc Việt Nam” do
Trường ðại học Y Thái Bình chủ trì. Chúng tôi xin
ñược bày tỏ lòng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Văn
Cảm - nguyên Giám ñốc Trung tâm Chẩn ñoán thú y
Trung ương và TS. Lê Thị Quỳnh Mai - Giám ñốc
Trung tâm Cúm Quốc gia ñã cung cấp các mẫu RNA
của virus A/H5N1.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of
haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine
to regulate the growth of avian influenza viruses in
tissueculture. Virus Res 79(1-2): 177-185.
Bouvier NM, Palese P (2008) The biology of influenza
viruses. Vaccine 26 Suppl 4: D49-53.

429


Nguyễn Nam Thắng et al.
Bright RA, Shay DK, Shu B, Cox NJ, Klimov AI (2006)
Adamantane resistance among influenza A viruses isolated
early during the 2005-2006 influenza season in the United
States. JAMA 295(8): 891-894.
Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, Rayner JM,
Vijaykrishna D, Zhang JX, Zhang LJ, Guo CT, Cheung
CL, Xu KM, Duan L, Huang K, Qin K, Leung YH, Wu
WL, Lu HR, Chen Y, Xia NS, Naipospos TS, Yuen KY,
Hassan SS, Bahri S, Nguyen TD, Webster RG, Peiris JS,
Guan Y (2006) Establishment of multiple sublineages of
H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic

Nature 444(7117): 378-382.

DEVELOPMENT OF AMPLIFYING AND CLONING METHOD FOR FULL-LENGTH
HA, NA AND M SEGMENTS OF INFLUENZA A/H5N1VIRUS
Nguyen Nam Thang1, Pham Ngoc Khai1, Dinh Duy Khang2, Luong Xuan Hien1, ∗
1
2

Thaibinh Medical University
Institute of Biotechnology
SUMMARY
Genetic variation in HA, NA and M segments of influenza A virus may alter antigenic characteristics,
transmissibility, drug resistibility, virulence, and pathogenicity. In this study, a novel method for amplifying and
cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus is described. RNA templates of influenza
A/H5N1 virus were used for amplification of full-length HA, NA and M segments by two step RT-PCR method.
The method was carried out with 3 specific primerpairs designed based on consensus sequences of the 3’ UTR
and 5’ UTR by multiple aligment of each segment. The DNA amplifications were examined by electrophoresis
and eluted from agarose gel, then ligated with pJET1.2/blunt vector to generate recombinant plasmids. RNA
templates extracted from 11 isolates of H5N1 virus collected from poultry and humans were tested to evaluate the
accuracy of the method. After optimization, the RT-PCR method was used to amplify all HA, NA and M
segments from RNA templates of 11 influenza H5N1 isolates. Electrophoresis result showed that all
amplifications of HA, NA and M segments were clearly visualized on agarose gel. After gel-elution, the
amplifications were inserted into pJET1.2/blunt vector. Sequencing results indicated that all of the sequences from
the clones have high nucleotide identity with the corresponding H5N1 sequences. The method for amplifying and
cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus isolated from poultry and humans was
successfully developed and could be applied for study of influenza H5N1 virus at the molecular level.
Keywords: A/H5N1, avian influenza, cloning, HA, NA, M segment, RT-PCR

∗