BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID
MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN
VÀ CẦU NỐI TRIAZOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID
MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN
VÀ CẦU NỐI TRIAZOL


Học viên

Nguyễn Thị Thùy Dương


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. HISTON DEACETYLASE ..............................................................................2
1.1.1. Khái niệm, phân loại ...................................................................................2
1.1.2. Cấu trúc của HDAC ....................................................................................4
1.2.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự bất thƣờng hoạt động của HDAC .........4
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC ..........................................................................5
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC ................................................................5
1.2.2. Cơ chế tác dụng...........................................................................................8
1.2.3. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC .........................8
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC .....................................................................................................10
1.4. NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ CỦA CÁC TRIAZOL .20
1.5. NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ CỦA CÁC ISATIN .....23
Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................26
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ ..................................................................26
2.1.1. Hóa chất ....................................................................................................26
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................26
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................27
2.2.1. Tổng hợp hóa học .....................................................................................27
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp đƣợc ...........................28
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................28
2.3.1. Phƣơng pháp tổng hợp hóa học ................................................................28

13
1

C – NMR

: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C

H – NMR

: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H

AsPC-1

: Tế bào ung thƣ tụy ngƣời

Dd

: Dung dịch

HAT

: Histon acetyltranferase

HDAC

: Histon deacetylase

HDI, HDIs

: Histon deacetylase Inhibitor(s)


: Acid suberoylanilid hydroxamic

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

SW620

: Tế bào ung thƣ đại tràng

TSA

: Trichostatin A


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1:

Enzym HDAC: phân loại, số lƣợng acid amin, vị trí, chức năng sinh
lý và cấu trúc tinh thể ............................................................................. 3

Bảng 1.2:

Một số chất ức chế HDAC đang đƣợc thử lâm sàng ............................... 7

Bảng 1.3:

Khả năng ức chế HDAC của các saccarin của N-hydroxybenzamid .... 16


Số liệu phân tích phổ 13C-NMR ............................................................ 48

Bảng 3.6:

Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-f bằng
phƣơng pháp huỳnh quang .................................................................... 49

Bảng 3.7:

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ in vitro của các chất
IVa-f ...................................................................................................... 50

Bảng 3.8:

Kết quả docking của các chất IVa-f với HDAC2 ................................. 51

Bảng 4.1.

So sánh hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-f và 20a-f ..... 60


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:

Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thƣ ............5

Hình 1.2:



Hình 1.10: Công thức của CRA-024781/ PCI-24781/Abexinostat .........................19
Hình 1.11: Các nucleosid có vòng triazol ...............................................................21
Hình 1.12: Các chất kết hợp giữa 3-phenylpyrazolopyrimidin và 1,2,3-triazol ......21
Hình 1.13: Các 4-aryl-5-cyano-2H-1,2,3-triazol .....................................................22
Hình 1.14: Các phân tử nhỏ giống Lavendustin ......................................................22
Hình 1.15: Các chất kết hợp giữa 2,3,4,6-tetra-O-acetyl- β-D -glucopyranosyl azid
với propynyl 3-[3-(aryl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl] propionat . ...................23
Hình 3.1:

Mô hình tƣơng tác của IVd với HDAC2 ..............................................51

Hình 4.1:

Phổ hồng ngoại của IVe ........................................................................54


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1:

Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic ..............................................14

Sơ đồ 1.2:

Tổng hợp acid triazol-hydroxamic .......................................................15

Sơ đồ 1.3:

Tổng hợp các 4-aryl-1,2,3-triazol .........................................................20


Quy trình tổng hợp chất IVd ................................................................39

Sơ đồ 3.8:

Quy trình tổng hợp chất IVe .................................................................41

Sơ đồ 3.9:

Quy trình tổng hợp chất IVf .................................................................42

Sơ đồ 4.1:

Cơ chế phản ứng Click .........................................................................52

Sơ đồ 4.2:

Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-f………….…………………………53


ĐẶT VẤN ĐỀ
Histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT) là các enzym
quan trọng tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen. Nhiều nghiên cứu cho
thấy sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá
trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thƣ [23, 53]. Do đó,
các HDAC là mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung
thƣ hiện nay [21, 29, 47]. Trong số các loại chất ức chế HDAC đã đƣợc tổng hợp và
công bố cho đến nay, các dẫn xuất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt
một dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®),
đã đƣợc FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u lympho da tế bào T (CTCL).
Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các N-hydroxybenzamid, trong số đó có

hóa, điện tích dƣơng bị trung hòa, nhiễm sắc thể đƣợc tháo xoắn, quá trình tổng hợp
protein diễn ra và đặc tính của gen đƣợc biểu hiện. Trong tế bào, quá trình acetyl
hóa này đƣợc điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltranferase (HAT) và histon
deacetylase (HDAC) [2, 17, 26, 43].
Hiện nay ngƣời ta đã biết đến 18 HDAC, chia làm 4 nhóm (bảng 1.1). Nhóm
I, II và IV gồm 11 thành viên, đƣợc coi là những HDAC “kinh điển” là những
enzym phụ thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở
đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelate với Zn2+
nhƣ các acid hydroxamic. Ngƣợc lại nhóm III là những sirtuin không bị ức chế
bởi những hợp chất nhƣ vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào
NAD+ [34].

2


Bảng 1.1: Enzym HDAC: phân loại, số lượng acid amin, vị trí, chức năng sinh lý
và cấu trúc tinh thể
Phụ thuộc Zn2+
Nhóm

I

IIA

HDAC1
HDAC2
HDAC3
HDAC8
HDAC4


347

SIRT1

747

SIRT2
SIRT3
SIRT4
SIRT5

389
399
314
310

SIRT6

355

SIRT7

400

IIB
IV

III

Vị trí

Nhân TB/
Điều hòa sự ô xy hóa và hệ
Bào tƣơng
thống tự miễn
Nhân TB
Thực bào
Ty thể
Chu trình u rê, quá trình chuyển
Ty thể hóa năng lƣợng, điều chỉnh ATP,
sự trao đổi chất, sự chết và
Ty thể
truyền tín hiệu tế bào.
Nhân TB
Quá trình chuyển hóa năng
lƣợng
Nhân TB
Sự chết của tế bào

3

X-ray
Crystal

Có

Có

Không
Có
Không

Nhƣ đã trình bày trong phần khái niệm, hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới
sự tích điện trên phần đầu amin của histon, từ đó gây tác động lên quá trình phiên
mã. Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn tới sự
hình thành khối u. Chẳng hạn, mối tƣơng quan giữa hoạt động của HDAC và sự tạo
thành khối u đƣợc thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thƣ bạch cầu tiền tủy bào cấp
tính (APL). Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã
không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thƣ
(oncoprotein). Ngoài ra trong các tế bào ung thƣ ngƣời ta còn thấy sự hoạt động quá
mức của HDAC nhƣ ung thƣ buồng trứng (HDAC1-3), ung thƣ dạ dày (HDAC2);
ung thƣ phổi (HDAC1) [18, 24].

4


Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến
nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu
trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chƣơng trình, kể cả sự di chuyển, sự
xâm lấn và sự tạo mạch. Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học
của tế bào ung thƣ đƣợc tóm tắt ở hình 1.1 [10, 18, 24, 45].

Hình 1.1: Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thư
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC (HDIs) có thể phục hồi lại sự biểu hiện gen, ức chế
sự phát triển và sống sót của tế bào ung thƣ. Khả năng chống ung thƣ của các chất
ức chế HDAC bắt nguồn từ khả năng tác động lên nhiều chu trình tế bào đã bị biến
đổi ở các tế bào ung thƣ. Trong hầu hết các trƣờng hợp, sự hoạt hóa các chƣơng
trình biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào theo chƣơng trình
là chìa khóa cho tác dụng chống ung thƣ của HDIs. Thêm vào đó, sự hoạt hóa của
chuỗi phản ứng miễn dịch và sự ức chế tạo mạch cũng đóng vai trò quan trọng trong

Pha thử
Chất

Nhóm

Đích HDAC

nghiệm lâm
sàng

Vorinostat

Nhóm I, II, IV

FDA đã phê
duyệt

(SAHA,Zolinza)
Panobinostat (LBH589)

Nhóm I, II, IV

FDA đã
phê duyệt

Belinostat (PXD101)

Nhóm I, II,IV

II


Dacinostat
(LAQ824,
NVP-LAQ824)
Pracinostat (SB939)
Romidepsin
Các peptid vòng (Depsipeptid,FK228)
Apicidin

phê duyệt
II

HDAC 1, 2, 11

II

HDAC1,9,11

II

Rocilinostat (ACY-1215)

HDAC6

II

Valproic acid (VPA)

Nhóm I




1.2.2. Cơ chế tác dụng
Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thƣ do tác động lên nhiều giai
đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính.
Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thƣ của HDIs là thúc đẩy
sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào.
Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế tạo mạch cũng là vai trò rất
quan trọng của HDIs, gián tiếp ức chế sự phát triển in vivo của khối u (hình 1.2) [3, 26].

Hình 1.2: Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC
1.2.3. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC
Phần mang dƣợc tính của các chất ức chế HDAC thông thƣờng bao gồm:
- Nhóm gắn với kẽm (ZBG): tƣơng tác với Zn2+ ở vị trí hoạt động của các
enzym HDAC: acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton. Với các chất
ức chế HDAC có nhóm hydroxamic, ion Zn2+ tạo 2 liên kết phối trí với 2 nguyên tử
oxy của nhóm hydroxamic.
- Vùng cầu nối sơ nƣớc: là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hay
vòng, có thể no hoặc không no.
- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt: thƣờng là
vòng thơm hoặc peptid vòng, sẽ tạo tƣơng tác với 1 vành nhỏ trên miệng túi trong cấu
tạo của kênh enzyme HDAC đƣợc tạo nên từ vài vòng xoắn protein [1, 26, 36, 44].

8


Khi phân tích cấu trúc tia X của một đồng đẳng của HDAC, protein giống
HDAC (HDLP), kết hợp đƣợc với SAHA hay TSA, và gần đây khi nghiên cứu
HDAC8 ở ngƣời, ngƣời ta đã xác định đƣợc ZBG tƣơng tác với một ion Zn2+ của vị
trí hoạt động có dạng túi (Zn2+ ở đáy của túi) [36]. Cầu nối sơ nƣớc đƣa ZBG đến vị

các vòng aminoacid có thể tham gia tƣơng tác quan trọng với các nhóm nhận diện
bề mặt hoặc các nhóm lân cận. Phần nhận diện bề mặt tại trung tâm hoạt động của
HDAC chấp nhận một hệ vòng khá đa dạng, từ indol, bemzofuran, quinolin,
benzodioxol… Nhóm nitơ trong cấu trúc của phần nhân thơm R có thể tạo liên kết
hydro với các nhóm aminoacid trong cấu trúc túi, tăng tƣơng tác với mép túi tại
trung tâm hoạt động của enzyme HDAC, do đó tăng hoạt tính của các chất ức chế
HDAC. Vì vậy, các nghiên cứu khảo sát dẫn chất ức chế HDAC bằng cách thay đổi
nhóm khoá hoạt tính (thay thế vị trí phenyl bằng các nhân thơm nhƣ benzothiazol,
phenylthiazol, isoxazol...) trong SAHA có tính khả quan cao.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC
Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất,
với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol.
Trichostatin A ((R)-TSA) là chất đầu

tiên đƣợc phân

lập từ

Streptomyceshygroscopicus đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu

10


với HDAC (Ki=3,4nM), có tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào
trong bệnh bạch cầu Friend, và đóng vai trò nhƣ chất ngăn cản sự di căn trong ung
thƣ đại tràng. Tuy nhiên việc sản xuất ra TSA rất tốn kém với hiệu suất thấp (trải
qua 20 bƣớc với hiệu suất 2%) nên việc nghiên cứu ra các chất ức chế HDAC thay
thế TSA đang đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, TSA chủ yếu đƣợc
dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra HDIs mới [8].

với IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm. Đồng phân vị trí
của WR301801 là WR301826 (1b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác
dụng mạnh tƣơng đƣơng SAHA [52].
Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đƣờng mới,
nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếp
tục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm amino
của vòng phenyl (hình 1.6). Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl
đƣợc acyl hóa bằng những nhóm cồng kềnh, tác dụng ức chế nhiều týp HDAC tăng.

12


Tác dụng mạnh nhất thu đƣợc với dẫn chất 1a-5 (hình 1.6). IC50 của dẫn chất này
với HDAC2, HDAC3 thấp dƣới mức 0,2 nM. Kết quả thử độc tính trên 5 dòng tế
bào ung thƣ tụy công bố với 1a, 1b, 1a-2 cho thấy các dẫn chất này đều có IC50 nhỏ
hơn 3 M [30].

Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic
Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic,
nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski cũng đồng thời tiến hành thiết kế và tổng
hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA (hình1.7) [30].
Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC
(HDAC1, 2, 3, 8, 10, 6). Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenyl
thứ 2 hoạt tính giảm, nhƣng khi nhóm -NH2 này đƣợc acyl hóa bằng những nhóm
aminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại đƣợc tăng cƣờng. Điều này chứng
tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhận
nhiều nhóm có kích thƣớc lớn. Kết quả này cũng gợi ý các tƣơng tác đƣợc tạo lập
thêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đã
làm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất. Một số acid biphenyl-hydroxamic
cũng cho độc tính trên 5 dòng tế bào ung thƣ tụy thử nghiệm nhƣng tác dụng không

thấm qua màng tế bào của chất này, dẫn đến độc tính tế bào thấp hơn so với 3a. Có
thể các dẫn chất acyl hóa của 3b sẽ cải thiện cả tác dụng trên HDAC và tế bào, tƣơng
tự nhƣ với các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic (1).

14


Hình 1.8: Các acid isoxazol-hydroxamic
Cũng nhằm mục tiêu tìm ra cầu nối và nhóm khóa hoạt động thích hợp, các nhà
khoa học tại Viện Parker H. Petit thuộc Viện Công nghệ Georgia đã thiết kế và tổng
hợp dãy các dẫn chất hydroxamic chứa vòng triazol (4, sơ đồ 1.2) [30].

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4).
*Tác nhân và điều kiện: (a) CuI, Hunig base, THF, nhiệt độ phòng; (b) dd NH2OH, KCN,
THF/MeOH (1/1), khuấy đều.

Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC cho thấy cầu nối giữa phần
hydroxamic và triazol 5, 6 carbon là tối ƣu. Tuy nhiên, không thấy có quy luật rõ
ràng khi so sánh hai dẫn chất có cùng nhóm khóa hoạt động Ar và khác nhau về độ
dài cầu nối. Với nhóm Ar cồng kềnh, dẫn chất 5C thƣờng có tác dụng ức chế
HDAC mạnh hơn trong khi những chất có Ar nhỏ, dẫn chất 6C thƣờng biểu thị hoạt
tính trên HDAC mạnh hơn. Khi so sánh với SAHA, rất nhiều dẫn chất triazol chứng
tỏ có ái lực mạnh hơn với HDAC. Đánh giá in vitro, 4 dẫn chất 4t, 4v, 4y, 4w gây
độc đối với dòng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến của ngƣời DU145 với IC50 thấp nhất
đến 2,25 µM, tƣơng đƣơng với SAHA (hình 1.9) [44].

15


Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic Cấu nối

H
H
H
H
H
H
NO2
I
Ph
H
NO2
I
Ph
I
Ph
H
H

-(CH2)2CONH-(CH2)3CONH-(CH2)4CONH-(CH2)5CONH-(CH2)5CONH-(CH2)2CONH-(CH2)2CONH-(CH2)2CONH-(CH2)2CONH-(CH2)3CONH-(CH2)3CONH-(CH2)3CONH-(CH2)3CONH-(CH2)4CONH-(CH2)4CONH-(CH2) 2CONHCH2-(CH2)4CONHCH2-

16

Vị trí nhóm
hydroxamic
meta
meta
meta
meta
meta
para

3,40±0,84
0,193±0,082