ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƯ CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI


TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƯ CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..................................... 3
1.1.1. Ung thư đại trực tràng là gì?.................................................................... 3
1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng ........................................... 6
1.1.3. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng .......................... 8
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ ....................... 12
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thư ............................................................ 12
1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh
học ung thư ..................................................................................................... 14
1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16
1.3.1. Proteomic là gì? .................................................................................... 16
1.3.2. Công cụ nghiên cứu proteomics ............................................................ 17
1.3.3. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng ........ 19
Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 28
2.1. NGUYÊN LIỆU .......................................................................................... 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 28
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................ 28
2.1.3. Thiết bị.................................................................................................. 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................ 29
2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng.................................................................. 29
2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ................................... 31
2.2.3. Điện di hai chiều ................................................................................... 31
2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều .......................................... 33
2.2.5. Cắt và thủy phân spot ............................................................................ 34


2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein ............................................... 35
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 37
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................... 37
3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN
DI HAI CHIỀU .................................................................................................. 39


AFAP

Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial
Adenomatous Polypsis)

APC

Adenomatous Polyposis Coli

CHAPS

3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid

CHCA

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

CEA

Kháng nguyên phôi thai (Carcinoembryonic Antigen)

CK

Cytokeratin

cs

Cộng sự


HUPO

Tổ chức nghiên cứu hệ protein người
(Human Proteome Organisation)

IAA

Iodoacetamide

IEF

Điện di phân vùng đẳng điện (Isoelectric Focusing)

IPG

Gradient pH cố định (Immobilized pH gradient)

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ
(Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry)


MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
MS

Khối phổ (Mass spectrometry)

PBS



TNM

Tumor – Lympho node – Metastases


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh
khác nhau

Bảng 2

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3

Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm

Bảng 4

Số lượng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều

Bảng 5

Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai
chiều của 5 bệnh nhân

Bảng 6

polyacrylamide 10% có SDS

Hình 5

Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1
từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng

Hình 6

Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên
bản gel điện di hai chiều

Hình 7

Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thư so với
mô bình thường

Hình 8

Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều của
mẫu mô ung thư đại trực tràng so với mẫu mô đại trực tràng bình
thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng mã số 11781

Hình 9

Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân protein
T17B33 bằng enzyme trypsin

Hình 10


th i trc trng, chim khong 10% trong s cỏc loi ung th. S ca t vong do
ung th i trc trng trong nm 2008 l 610.000 ca trờn ton th gii, chim
khong 8% s lng t vong do ung th.
Ti Vit Nam, ung th i trc trng l loi ung th ng th nm trong cỏc
loi ung th thng gp, sau ung th d dy, phi, vỳ, vũm hng. Theo thng kờ
ca Bnh vin Ung Bu thnh ph H Chớ Minh, nm 2008, bnh vin cú 306 ca
bnh ung th i trc trng v con s ny ngy cng gia tng. Tớnh n thỏng 9 nm
2009, ó cú n trờn 220 bnh nhõn mi n iu tr ung th i trc trng ti õy
[54]. T l mc ung th i trc trng l 9% tng s bnh nhõn ung th [55].
Vic chn oỏn v phỏt hin sm ung th i trc trng cú ý ngha rt quan
trng, giỳp lm tng hiu qu iu tr bnh, gim t l t vong do loi ung th ny
gõy ra. Thc t cho thy, nu phỏt hin khi u i trc trng giai on u v cha
tr kp thi thỡ t l sng sút ca bnh nhõn sau 5 nm s l 80 100%. Hin nay,
mt s phng phỏp xột nghim lõm sng ang c ỏp dng chn oỏn ung th
i trc trng nh chn oỏn hỡnh nh thụng quan ni soi, sinh thit, chp X quang,
xột nghim tỡm mỏu trong phõn, thm khỏm trc tip, s dng ch th CEA. Nhc
im ca cỏc phng phỏp ny l thng phỏt hin bnh giai on mun, phng
phỏp ni soi thng gõy khú chu cho bnh nhõn, xột nghim mỏu trong phõn cho
nhiu kt qu dng tớnh v õm tớnh gi nờn hiu qu chn oỏn v iu tr bnh
khụng cao. Vỡ vy, nhu cu t ra cho cỏc nh khoa hc l lm th no tỡm ra
c cỏc ch th sinh hc c trng chn oỏn, phỏt hin ung th i trc trng
giai on sm.

1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà


1.1.1. Ung th i trc trng l gỡ?
Ung th l thut ng c s dng ch cỏc bnh liờn quan n vic cỏc t
bo phõn chia mt kim soỏt v cú th xõm ln cỏc mụ khỏc. Cỏc t bo ung th cú
th di cn ti cỏc phn khỏc ca c th thụng qua mỏu hoc h bch huyt.
Ung th khụng ch l mt bnh m bao gm nhiu bnh. Hin nay, cú hn
100 loi ung th khỏc nhau. Hu ht ung th c t tờn theo c quan hoc loi t
bo, ni ung th phỏt sinh. Vớ d ung th phỏt sinh t i trng c gi l ung th
i trng, ung th phỏt sinh t gan c gi l ung th gan [48].
Ung th l mt trong 8 nguyờn nhõn gõy cht i vi nhõn loi trờn ton th
gii. S lng ngi t vong do ung th cũn ln hn s lng t vong do nhim
HIV, lao v st xut huyt cng li. i vi cỏc nc cú nn kinh t phỏt trin, ung
th l nguyờn nhõn gõy t vong hng u. i vi cỏc nc ang phỏt trin, ung
th l nguyờn nhõn gõy t vong th hai, sau bnh tim mch [45]. Nm 2008, c
tớnh cú khong 12,66 triu ngi mc ung th v 7,56 triu ngi cht do cn bnh
ny. Trong ú 4 loi ung th l ung th phi, ung th vỳ, ung th d dy v ung th
i trc trng chim 2/5 tng s ca mc ung th trờn th gii [45].
Ung th i trc trng l loi ung th ph bin nht trong cỏc loi ung th
ng tiờu húa [28], bao gm ung th i trng v ung th trc trng c gi theo
tờn ca mụ, ni phỏt sinh ung th. i trng v trc trng l mt phn ca h tiờu
húa. i trc trng (hay cũn gi l rut gi) l phn cui ca ng tiờu húa ngi,
gm cú i trng (hay cũn gi l rut kt) v trc trng (hay cũn gi l rut thng).
i trng chia ra lm nhiu phn: manh trng, i trng lờn, i trng ngang, i
trng xung v i trng sigma (Hỡnh 1). Trc trng nm ngay trc hu mụn. Ung
th xy ra i trng gi l ung th i trng v ung th xy ra trc trng gi l

3


Luận văn thạc sĩ


90 95% trong cỏc loi ung th i trc trng [21Error! Reference source not
found.]. iu ny cú ngha l t bo ung th c hỡnh thnh t cỏc t bo biu mụ
tuyn bt thng b mt lp lút bờn trong ca i trc trng. Mt s dng ung th
i trc trng khỏc, ớt gp hn l ung th bt u t cỏc t bo lympho v cỏc t bo
biu mụ vy.
Ung th i trc trng l ung th ph bin th ba trờn th gii ch sau ung th
phi v ung th vỳ. Nm 2008 c tớnh cú khong 1,24 triu ngi trờn th gii
c chn oỏn l mc ung th i trc trng, chim khong 10% trong s cỏc loi
ung th. S ca t vong do ung th i trc trng trong nm 2008 l 610.000 ca trờn
ton th gii, chim khong 8% s lng t vong do ung th [16, 45].
Ung th i trc trng thng gp cỏc nc phỏt trin nhiu hn cỏc nc
ang phỏt trin. Nm 2008, 60% cỏc ca c chn oỏn ung th i trc trng l
cỏc nc phỏt trin [16]. T l bnh nhõn mc ung th i trc trng cng tng lờn
cỏc khu cụng nghip v thnh th.
T l ung th i trc trng cỏc nhúm tui khỏc nhau l khỏc nhau. S lng
ngi mc ung th i trc trng nhúm tui trờn 75 tui l cao nht
(250/100.000/nm). Ung th i trng ớt xy ra tui di 45 tui v t l ny l
2/100.000/nm. nhúm tui t 45 n 54, t l mc ung th i trng l
20/100.000/nm. Nhúm tui t 55 n 64, t l mc ung th i trng l
55/100.000/nm. Nhúm tui t 65 n 74, t l ny l 150/100.000/nm [21Error!
Reference source not found., 30].
Ti Vit Nam, ung th i trc trng l loi ung th ng th nm trong cỏc
loi ung th thng gp, sau ung th d dy, phi, vỳ, vũm hng v bnh ny cú xu
hng ngy cng tng cao. Theo thng kờ ca Bnh vin Ung Bu TPHCM, nm
2007, bnh vin cú 218 ca bnh ung th i trc trng. Nm 2008 con s ny l 306
ca v tớnh n thỏng 9 nm 2009, ó cú n trờn 220 bnh nhõn mi n iu tr ung
th i trc trng [54]. Theo thng kờ ca Bnh vin K, t l mc ung th i trng
5



hp mc ung th i trc trng c ch ra l cú liờn quan n thúi quen li vn
6


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

ng [22]. Mc nguy c s gim trung bỡnh l 40% n 50% nu c th cú mt
ch vn ng hp lý.
Ngoi ra, nguy c mc ung th i trc trng cng tng lờn nhng ngi hỳt
thuc. nhng bnh nhõn ung th i trc trng s dng thuc lỏ, nguy c tỏi phỏt
ung th i trc trng sau khi ct b polyp cng tng lờn.
Hu ht ung th i trc trng phỏt trin t polyp i trc trng. Do ú, vic
loi b cỏc polyp lnh tớnh l mt bin phỏp cú th phũng nga ung th i trc
trng. Cỏc polyp cú th phỏt trin thnh ung th khi cú s tn thng nhim sc th
xy ra cỏc t bo ti niờm mc ca i trc trng. Nhng tn thng ny to ra
nhng t bo bt thng. Cỏc t bo khi ó tớch ly cỏc tn thng nhim sc th thỡ
s phỏt trin khụng kim soỏt c hỡnh thnh ung th. Nh vy, polyp i trc
trng ban u l lnh tớnh, sau ú do s tớch ly cỏc tn thng v nhim sc th
nờn phỏt trin thnh ung th.
Cỏc nghiờn cu ch ra rng cú mi liờn h gia ung th i trng v chng
viờm i trng. Nguy c mc ung th i trng tng lờn sau 8 10 nm b viờm i
trng. Theo c tớnh hin nay, t l mc ung th i trng cú liờn quan n viờm
loột i trng l 2,5% sau 10 nm, 7,6% sau 30 nm v 10,8% sau 50 nm. Ngoi
ra, nguy c mc ung th i trng cng ph thuc vo v trớ v mc viờm loột i
trng [52].
Cỏc yu t di truyn
Trng hp ung th i trc trng liờn quan n bnh s ung th trong gia
ỡnh ch chim khong 20% trong tt c cỏc trng hp mc bnh. Trong ú, ch cú

mc cỏc bnh lý liờn quan n ni mc t cung bung trng, d dy, rut non, niu
qun, tuyn bó da chim 30-60% [49].
1.1.3. Cỏc h thng phõn loi giai on ung th i trc trng
Vic xỏc nh giai on ca ung th cho bit kớch thc ca khi u v mc
lan rng ca khi u khi v trớ ban u cú ý ngha rt quan trng, giỳp cho bỏc s
quyt nh liu phỏp phự hp nht iu tr ung th. Hin nay cú mt s h thng
phõn giai on ung th ang c s dng rng rói trờn th gii, bao gm phõn loi
theo Duke v phõn loi TNM.
H thng phõn loi theo Duke [12]

8


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

Nm 1932, Cuthbert E. Dukes, mt nh gii phu ngi Anh ó a ra h
thng phõn loi giai on cho ung th trc trng. Theo h thng phõn loi ny, ung
th trc trng c chia ra thnh 4 giai on:
Duke A: Khi u b gii hn thnh ca trc trng.
Duke B: Khi u xõm ln qua thnh ca trc trng nhng cha nh hng n
cỏc hch bch huyt.
Duke C: Khi u lan ti cỏc hch bch huyt cnh trc trng.
Duke D: Khi u di cn ti cỏc b phn khỏc trờn c th nh thn, gan,
phi
Cho ti nay, trờn th gii xut hin mt vi ci bin cho h thng phõn loi
Duke. Tuy nhiờn, h thng phõn loi ny gn nh ang c thay th bng h thng
phõn loi chi tit hn, ú l h thng phõn loi TNM.
H thng phõn loi TNM




N- Hch bch huyt vựng (Regional Lympho Nodes)


Nx: Khụng ỏnh giỏ c cỏc hch bch huyt vựng.



N0: Khụng cú hch bch huyt vựng liờn quan.



N1, N2, N3: Cú hch bch huyt vựng liờn quan (s lng hch bch

huyt).
M - Di cn (Distant Metastasis)


Mx: Khụng th ỏnh giỏ c mc di cn xa.



M0: Khụng cú di cn xa.



M1: Cú di cn xa.
nhiu loi ung th, cỏc cỏch phi hp TNM ny tng ng vi mt trong 5

Tis N0 M0

100%

Giai on
I

Ung th ó hỡnh thnh
niờm mc i trc
trng v xõm ln ti
lp mụ bờn di lp
niờm mc ca i trc
trng

T12N0M0

8095%

Giai on
IIA

Ung th ó xõm ln
qua lp c ca i
trc trng v lan ti
lp mng bao quanh
i trc trng

T3N0M0

7275%

Giai on
IIIB

Hỡnh nh

11