ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƢ CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI


TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƢ CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ......................................3
1.1.1. Ung thƣ đại trực tràng là gì?.......................................................................3
1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thƣ đại trực tràng .............................................6
1.1.3. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thƣ đại trực tràng ...........................8
1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ.........................12
1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ ...............................................................12
1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh
học ung thƣ .........................................................................................................14
1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16
1.3.1. Proteomic là gì? ........................................................................................16
1.3.2. Công cụ nghiên cứu proteomics ...............................................................17
1.3.3. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng ........19
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................28
2.1. NGUYÊN LIỆU .............................................................................................28
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...............................................................................28
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................28
2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................29
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................29
2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng ....................................................................29
2.2.2. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford .....................................31
2.2.3. Điện di hai chiều.......................................................................................31
2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều ............................................33
2.2.5. Cắt và thủy phân spot ...............................................................................34


2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein .................................................35
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................37
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG ....................................37
3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN
DI HAI CHIỀU ......................................................................................................39


AFAP

Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial
Adenomatous Polypsis)

APC

Adenomatous Polyposis Coli

CHAPS

3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid

CHCA

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

CEA

Kháng nguyên phôi thai (Carcinoembryonic Antigen)

CK

Cytokeratin

cs

Cộng sự


HUPO

Tổ chức nghiên cứu hệ protein ngƣời
(Human Proteome Organisation)

IAA

Iodoacetamide

IEF

Điện di phân vùng đẳng điện (Isoelectric Focusing)

IPG

Gradient pH cố định (Immobilized pH gradient)

LC-MS/MS

Sắc k l ng kết nối với khối phổ
(Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry)


MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
MS

Khối phổ (Mass spectrometry)

PBS



TNM

Tumor – Lympho node – Metastases


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh
khác nhau

Bảng 2

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3

Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm

Bảng 4

Số lƣợng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều

Bảng 5

Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai
chiều của 5 bệnh nhân

Bảng 6

polyacrylamide 10% có SDS

Hình 5

Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1
từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng

Hình 6

Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên
bản gel điện di hai chiều

Hình 7

Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thƣ so với
mô bình thƣờng

Hình 8

Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều của
mẫu mô ung thƣ đại trực tràng so với mẫu mô đại trực tràng bình
thƣờng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng mã số 11781

Hình 9

Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân protein
T17B33 bằng enzyme trypsin

Hình 10


th i trc trng, chim khong 10% trong s cỏc loi ung th. S ca t vong do
ung th i trc trng trong nm 2008 l 610.000 ca trờn ton th gii, chim
khong 8% s lng t vong do ung th.
Ti Vit Nam, ung th i trc trng l loi ung th ng th nm trong cỏc
loi ung th thng gp, sau ung th d dy, phi, vỳ, vũm hng. Theo thng kờ
ca Bnh vin Ung Bu thnh ph H Chớ Minh, nm 2008, bnh vin cú 306 ca
bnh ung th i trc trng v con s ny ngy cng gia tng. Tớnh n thỏng 9 nm
2009, ó cú n trờn 220 bnh nhõn mi n iu tr ung th i trc trng ti õy
[54]. T l mc ung th i trc trng l 9% tng s bnh nhõn ung th [55].
Vic chn oỏn v phỏt hin sm ung th i trc trng cú

ngha rt quan

trng, giỳp lm tng hiu qu iu tr bnh, gim t l t vong do loi ung th ny
gõy ra. Thc t cho thy, nu phỏt hin khi u i trc trng giai on u v cha
tr kp thi thỡ t l sng sút ca bnh nhõn sau 5 nm s l 80 100%. Hin nay,
mt s phng phỏp xột nghim lõm sng ang c ỏp dng chn oỏn ung th
i trc trng nh chn oỏn hỡnh nh thụng quan ni soi, sinh thit, chp X quang,
xột nghim tỡm mỏu trong phõn, thm khỏm trc tip, s dng ch th CEA. Nhc
im ca cỏc phng phỏp ny l thng phỏt hin bnh giai on mun, phng
phỏp ni soi thng gõy khú chu cho bnh nhõn, xột nghim mỏu trong phõn cho
nhiu kt qu dng tớnh v õm tớnh gi nờn hiu qu chn oỏn v iu tr bnh
khụng cao. Vỡ vy, nhu cu t ra cho cỏc nh khoa hc l lm th no tỡm ra
c cỏc ch th sinh hc c trng chn oỏn, phỏt hin ung th i trc trng
giai on sm.

1


Luận văn thạc sĩ

Chng 1 TNG QUAN

1.1. TNG QUAN V UNG TH I TRC TRNG
1.1.1. Ung th i trc trng l gỡ?
Ung th l thut ng c s dng ch cỏc bnh liờn quan n vic cỏc t
bo phõn chia mt kim soỏt v cú th xõm ln cỏc mụ khỏc. Cỏc t bo ung th cú
th di cn ti cỏc phn khỏc ca c th thụng qua mỏu hoc h bch huyt.
Ung th khụng ch l mt bnh m bao gm nhiu bnh. Hin nay, cú hn
100 loi ung th khỏc nhau. Hu ht ung th c t tờn theo c quan hoc loi t
bo, ni ung th phỏt sinh. Vớ d ung th phỏt sinh t i trng c gi l ung th
i trng, ung th phỏt sinh t gan c gi l ung th gan [48].
Ung th l mt trong 8 nguyờn nhõn gõy cht i vi nhõn loi trờn ton th
gii. S lng ngi t vong do ung th cũn ln hn s lng t vong do nhim
HIV, lao v st xut huyt cng li. i vi cỏc nc cú nn kinh t phỏt trin, ung
th l nguyờn nhõn gõy t vong hng u. i vi cỏc nc ang phỏt trin, ung
th l nguyờn nhõn gõy t vong th hai, sau bnh tim mch [45]. Nm 2008, c
tớnh cú khong 12,66 triu ngi mc ung th v 7,56 triu ngi cht do cn bnh
ny. Trong ú 4 loi ung th l ung th phi, ung th vỳ, ung th d dy v ung th
i trc trng chim 2/5 tng s ca mc ung th trờn th gii [45].
Ung th i trc trng l loi ung th ph bin nht trong cỏc loi ung th
ng tiờu húa [28], bao gm ung th i trng v ung th trc trng c gi theo
tờn ca mụ, ni phỏt sinh ung th. i trng v trc trng l mt phn ca h tiờu
húa. i trc trng (hay cũn gi l rut gi) l phn cui ca ng tiờu húa ngi,
gm cú i trng (hay cũn gi l rut kt) v trc trng (hay cũn gi l rut thng).
i trng chia ra lm nhiu phn: manh trng, i trng lờn, i trng ngang, i
trng xung v i trng sigma (Hỡnh 1). Trc trng nm ngay trc hu mụn. Ung
th xy ra i trng gi l ung th i trng v ung th xy ra trc trng gi l

3


Nguyễn Thị Ngọc Hà

Hu ht cỏc trng hp ung th i trc trng l ung th biu mụ tuyn, chim
90 95% trong cỏc loi ung th i trc trng [21Error! Reference source not
found.]. iu ny cú ngha l t bo ung th c hỡnh thnh t cỏc t bo biu mụ
tuyn bt thng b mt lp lút bờn trong ca i trc trng. Mt s dng ung th
i trc trng khỏc, ớt gp hn l ung th bt u t cỏc t bo lympho v cỏc t bo
biu mụ vy.
Ung th i trc trng l ung th ph bin th ba trờn th gii ch sau ung th
phi v ung th vỳ. Nm 2008 c tớnh cú khong 1,24 triu ngi trờn th gii
c chn oỏn l mc ung th i trc trng, chim khong 10% trong s cỏc loi
ung th. S ca t vong do ung th i trc trng trong nm 2008 l 610.000 ca trờn
ton th gii, chim khong 8% s lng t vong do ung th [16, 45].
Ung th i trc trng thng gp cỏc nc phỏt trin nhiu hn cỏc nc
ang phỏt trin. Nm 2008, 60% cỏc ca c chn oỏn ung th i trc trng l
cỏc nc phỏt trin [16]. T l bnh nhõn mc ung th i trc trng cng tng lờn
cỏc khu cụng nghip v thnh th.
T l ung th i trc trng cỏc nhúm tui khỏc nhau l khỏc nhau. S lng
ngi mc ung th i trc trng nhúm tui trờn 75 tui l cao nht
(250/100.000/nm). Ung th i trng ớt xy ra tui di 45 tui v t l ny l
2/100.000/nm. nhúm tui t 45 n 54, t l mc ung th i trng l
20/100.000/nm. Nhúm tui t 55 n 64, t l mc ung th i trng l
55/100.000/nm. Nhúm tui t 65 n 74, t l ny l 150/100.000/nm [21Error!
Reference source not found., 30].
Ti Vit Nam, ung th i trc trng l loi ung th ng th nm trong cỏc
loi ung th thng gp, sau ung th d dy, phi, vỳ, vũm hng v bnh ny cú xu
hng ngy cng tng cao. Theo thng kờ ca Bnh vin Ung Bu TPHCM, nm
2007, bnh vin cú 218 ca bnh ung th i trc trng. Nm 2008 con s ny l 306
ca v tớnh n thỏng 9 nm 2009, ó cú n trờn 220 bnh nhõn mi n iu tr ung
th i trc trng [54]. Theo thng kờ ca Bnh vin K, t l mc ung th i trng

Nhiu nghiờn cu ó xem xột mi liờn quan gia hot ng th cht vi nguy
c mc ung th i trc trng. Hu ht cỏc nghiờn cu ch ra rng li sng ớt vn
ng cng lm tng nguy c mc ung th i trc trng. Khong 10% cỏc trng
hp mc ung th i trc trng c ch ra l cú liờn quan n thúi quen li vn
6


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

ng [22]. Mc nguy c s gim trung bỡnh l 40% n 50% nu c th cú mt
ch vn ng hp lý.
Ngoi ra, nguy c mc ung th i trc trng cng tng lờn nhng ngi hỳt
thuc. nhng bnh nhõn ung th i trc trng s dng thuc lỏ, nguy c tỏi phỏt
ung th i trc trng sau khi ct b polyp cng tng lờn.
Hu ht ung th i trc trng phỏt trin t polyp i trc trng. Do ú, vic
loi b cỏc polyp lnh tớnh l mt bin phỏp cú th phũng nga ung th i trc
trng. Cỏc polyp cú th phỏt trin thnh ung th khi cú s tn thng nhim sc th
xy ra cỏc t bo ti niờm mc ca i trc trng. Nhng tn thng ny to ra
nhng t bo bt thng. Cỏc t bo khi ó tớch ly cỏc tn thng nhim sc th thỡ
s phỏt trin khụng kim soỏt c hỡnh thnh ung th. Nh vy, polyp i trc
trng ban u l lnh tớnh, sau ú do s tớch ly cỏc tn thng v nhim sc th
nờn phỏt trin thnh ung th.
Cỏc nghiờn cu ch ra rng cú mi liờn h gia ung th i trng v chng
viờm i trng. Nguy c mc ung th i trng tng lờn sau 8 10 nm b viờm i
trng. Theo c tớnh hin nay, t l mc ung th i trng cú liờn quan n viờm
loột i trng l 2,5% sau 10 nm, 7,6% sau 30 nm v 10,8% sau 50 nm. Ngoi
ra, nguy c mc ung th i trng cng ph thuc vo v trớ v mc viờm loột i
trng [52].

li bt cp nhim sc th (Mismatch Repair Genes), bao gm cỏc gen MLH1,
MSH2, MSH6, PMS1, PMS2. Ngi cú hi chng HNPCC cú nguy c mc cỏc
bnh l ỏc tớnh ca i trc trng chim 70-80% trong sut cuc i. Ngoi ra t l
mc cỏc bnh l liờn quan n ni mc t cung bung trng, d dy, rut non, niu
qun, tuyn bó da chim 30-60% [49].
1.1.3. Cỏc h thng phõn loi giai on ung th i trc trng
Vic xỏc nh giai on ca ung th cho bit kớch thc ca khi u v mc
lan rng ca khi u kh i v trớ ban u cú

ngha rt quan trng, giỳp cho bỏc s

quyt nh liu phỏp phự hp nht iu tr ung th. Hin nay cú mt s h thng
phõn giai on ung th ang c s dng rng rói trờn th gii, bao gm phõn loi
theo Duke v phõn loi TNM.
H thng phõn loi theo Duke [12]

8


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

Nm 1932, Cuthbert E. Dukes, mt nh gii phu ngi Anh ó a ra h
thng phõn loi giai on cho ung th trc trng. Theo h thng phõn loi ny, ung
th trc trng c chia ra thnh 4 giai on:
Duke A: Khi u b gii hn thnh ca trc trng.
Duke B: Khi u xõm ln qua thnh ca trc trng nhng cha nh hng n
cỏc hch bch huyt.
Duke C: Khi u lan ti cỏc hch bch huyt cnh trc trng.


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

T1, T2, T3, T4: Kớch thc v/hoc phm vi ca khi u nguyờn phỏt.



N- Hch bch huyt vựng (Regional Lympho Nodes)


Nx: Khụng ỏnh giỏ c cỏc hch bch huyt vựng.



N0: Khụng cú hch bch huyt vựng liờn quan.



N1, N2, N3: Cú hch bch huyt vựng liờn quan (s lng hch bch

huyt).
M - Di cn (Distant Metastasis)


Mx: Khụng th ỏnh giỏ c mc di cn xa.




Cỏc t bo bt thng
c tỡm thy niờm
mc ca i trc trng
(ung th biu mụ ti
ch)

Tis N0 M0

100%

Giai on
I

Ung th ó hỡnh thnh
niờm mc i trc
trng v xõm ln ti
lp mụ bờn di lp
niờm mc ca i trc
trng

T12N0M0

8095%

Giai on
IIA

Ung th ó xõm ln
qua lp c ca i
trc trng v lan ti


Giai on
IIB

Giai on
IIIA
Giai on
IIIB

Hỡnh nh

11


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

Hỡnh nh

Kh nng
sng sút
sau 5 nm

Giai on

Mụ t

Giai on
IIIC


1.2. NGHIấN CU CH TH SINH HC I VI UNG TH
Ch th sinh hc (Biomarker) c nh ngha l cỏc phn t c tỡm thy
trong mỏu, trong cỏc loi dch ca c th hoc trong mụ, c trng cho mt quỏ trỡnh
sinh lý hoc cỏc giai on bnh lý. Ch th sinh hc cú th c ng dng xem xột
ỏp ng ca c th trong quỏ trỡnh iu tr bnh hay trong nhng iu kin c th.
Ch th sinh hc cũn c gi l cỏc ch th phõn t v cỏc phõn t tớn hiu [48].
1.2.1. Ch th sinh hc i vi ung th
Ch th sinh hc l mt trong cỏc cụng c quan trng c ng dng phỏt
hin ung th giai on sm, xỏc nh chớnh xỏc giai on bnh ỏp dng cỏc
bin phỏp iu tr thớch hp, tiờn lng bnh v theo dừi vic iu tr bnh cú hiu
qu hay khụng. Ch th sinh hc ung th l nhng phn t cú trong t bo hoc mụ
ung th, trong mỏu hay dch c th khỏc. Ch th sinh hc ung th cú th bao gm
nhiu loi phn t khỏc nhau nh ADN, mARN, cỏc yu t phiờn mó, th th trờn
b mt t bo hoc cỏc protein c tit ra. Ch th sinh hc gm 2 loi chớnh l ch
th t bo v ch th th dch. Ch th ung th dng t bo bao gm cỏc khỏng nguyờn
b mt cỏc t bo, cỏc th th hormone v th th yu t tng trng, nhng bin

12


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

i ADN, mARN, yu t phiờn mó ca t bo. Ch th ung th dng th dch bao
gm cỏc cht c phỏt hin nng bt thng cú mt trong huyt thanh, nc
tiu v cỏc loi dch khỏc ca c th [2]. Mt ch th ung th l tng l ch th cú
th d dng xỏc nh c, cho kt qu ỏng tin cy, cỏc xột nghim s dng loi
ch th ny cú c hiu v nhy cao, chi phớ thp. Ngoi ra, ch th ung th l

th i trc trng. Ngoi ra, cũn cú cỏc ch th c ng dng chn oỏn cỏc
bnh ung th khỏc nh khỏng nguyờn c hiu PSA (Postate Specific Antigen)
chn oỏn ung th tuyn tin lit v khỏng nguyờn ung th 125 (CA-125) thng
c s dng trong chn oỏn ung th bung trng [15].
- Ch th sinh hc c ng dng trong nghiờn cu tng tỏc thuc. Ch th
c ng dng ỏnh giỏ dc ng hc ca thuc, ỏnh giỏ tớnh hiu qu ca
thuc ti ớch tỏc dng (nh c ch enzyme, gn vi th th, kớch hot quỏ trỡnh
apoptosis) hoc phn ỏnh hiu qu trong iu tr thuc. Vớ d v loi ch th sinh
hc ny l gen mó húa cho enzyme thiopurine methyltranferase (TMPT) v iu tr
bng azathioprine trong bnh Crohn.
- Ch th sinh hc c ng dng d oỏn bnh. Ch th ny cú th s
dng d oỏn c nhng bnh nhõn cú th ỏp ng li c vi cỏc liu phỏp
iu tr. Vớ d v ch th ny l K-ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene) v th
th yu t sinh trng biu bỡ EGFR (Epidermal growth factor receptor). K-ras l
mt gen tin ung th, thng c tỡm thy t bin 50% cỏc trng hp ung th
a u tuyn cú kớch thc ln hn 1 cm v khong 40-50% ung th biu mụ i trc
trng [20].
- Ch th sinh hc c ng dng tiờn lng bnh, d oỏn tin trỡnh
phỏt trin ca bnh. Cỏc ch th ny s phn ỏnh kh nng di cn, mc lan rng
ca khi u. Cú nhiu loi ch th sinh hc c phỏt hin v xut ng dng trong
tiờn lng ung th nhng cỏc ch th ny u cha c thm nh [29].
1.2.2. Cỏc k thut sinh hc phõn t c ng dng nghiờn cu ch
th sinh hc ung th
Hin nay, i vi bnh ung th i trc trng, ni soi trc trng vn c coi
l phng phỏp vng trong chn oỏn bnh. Tuy nhiờn, õy l phng phỏp thm
khỏm trc tip, cú th gõy khú chu cho bnh nhõn. Mt phng phỏp khỏc hin
ang c s dng rng rói l xột nghim CEA. Protein ny thng c tỡm thy
trong mụ ca bo thai phỏt trin trong t cung. Nng trong mỏu ca protein ny
14


liờn quan n quỏ trỡnh phỏt sinh, hỡnh thnh ung th. u im ca k thut
proteomics l cú kh nng nghiờn cu c mc biu hin ca gen thụng qua
cỏc phõn t protein to ra.
15


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

S dng k thut metabolomics nghiờn cu tt c nhng cht chuyn
húa c to ra trong t bo, trong mụ. Mt s dng ung th to ra nhng bin i
v thnh phn v hm lng cỏc cht chuyn húa trong t bo. Cỏc cht chuyn húa
ny cú th tỡm thy trong cỏc mụ ung th, dch c th (c bit l nc tiu) [34].
1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIấN CU UNG TH I TRC TRNG

1.3.1. Proteomic l gỡ?
Proteomics l mụn khoa hc nghiờn cu sn phm ca h gen trong c th
hay chớnh l nghiờn cu cỏc protein c biu hin trong t bo, mụ hoc c th
trong nhng iu kin v thi gian xỏc nh [1]. Khụng ch dng li nghiờn c
u s tn ti ca protein ca mt t bo no ú, proteomics cũn i sõu nghiờn
cu tt c cỏc dng protein ó c ci bin, tng tỏc gia cỏc protein, cu trỳc
khụng gian v cỏc phc h cao hn ca protein.
Nghiờn cu proteomics ra i da trờn mt s thnh tu ó t c trong
sinh hc hin i nhng nm 90 ca th k trc. Ba bc phỏt trin quan trng
dn n s ra i ca proteomics bao gm s bựng n cỏc nghiờn cu v gen to
thnh c s d liu v trỡnh t gen v c s d liu trỡnh t protein; s ra i ca
cụng c tin sinh hc nhm tỡm kim cỏc c s d liu sinh hc; cui cựng l k
thut vi dóy phn ng oligonucleotid (oligonucleotide microarray) cú kh nng
nghiờn cu biu hin ca hng ngn gen. Nh vy, k thut proteomics ra i l