Mở đầu

Thực tập Tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Một đứa con sinh ra khỏe mạnh, thông minh, hoàn thiện về mặt tinh thần và
thể chất là điều ao ước của biết bao bà mẹ. Tuy nhiên, không phải tất cả những đứa trẻ
sinh ra đều được bình thường, có những đứa trẻ sinh ra đã bị dị tật, dị dạng khiến
chúng không thể sống sót khi được sinh ra hoặc có thể sống nhưng lại trở thành gánh
nặng cho gia đình và xã hội. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ
dị tật bẩm sinh trên thế giới chiếm 1,73%. Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu cũng cho
thấy tỷ lệ dị tật bẩm sinh là 1,5 – 3%, trong đó 20 – 40% nguyên nhân là do các rối
loạn nhiễm sắc thể. Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp ở trẻ sinh ra sống phần lớn
có liên quan đến các nhiễm sắc thể 21, 18, 13 và nhiễm sắc thể giới tính. Đây cũng là
nguyên nhân của một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể thường gặp như hội
chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng Patau và một số hội chứng bất thường
của nhiễm sắc thể giới tính như Klinefelter, Turner. Vì vậy, chẩn đoán trước sinh
đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm các dị tật bẩm sinh để có thể can
thiệp ở giai đoạn bào thai nhằm giảm tỉ lệ trẻ sơ sinh mắc các rối loạn di truyền.
Với sự tiến bộ của y học, nhiều kỹ thuật chẩn đoán trước sinh đã ra đời. Từ
năm 1966, kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích nhiễm sắc thể đồ (karyotype), gọi tắt
là karyotyping, ra đời và được đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong lĩnh vực chẩn đoán
trước sinh. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như thời gian thực
hiện dài (14 – 21 ngày), thao tác phức tạp, tốn nhiều công lao động. Do đó, nhu cầu
xuất hiện các kỹ thuật khác nhanh hơn và giúp giảm đáng kể thời gian lo lắng cho các
bậc cha mẹ là cần thiết. Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence In Situ
Hybridization – FISH) đã được giới thiệu với độ nhạy cao và thời gian trả kết quả
ngắn hơn đáng kể. Ngay sau đó, một kỹ thuật mới khác đã ra đời, kết hợp các đặc tính
của PCR và đánh dấu huỳnh quang được gọi là kỹ thuật QF-PCR (Quantitative
Fluorescence Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật QF-PCR có nhiều ưu điểm vượt
trội hơn FISH là có thể tự động hóa cùng lúc nhiều mẫu, chi phí thấp hơn và tốn ít


GIỚI THIỆU SƠ NÉT VỀ CÁC RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ

1.1.

THƢỜNG GẶP
Bộ nhiễm sắc thể (NST) của người bình thường bao gồm 22 cặp NST thường
và 1 cặp NST giới tính, XX ở người nữ và XY ở người nam. Công thức NST hay còn
gọi là NST đồ (karyotype) được viết dưới dạng: 46,XX hoặc 46,XY. Bất kỳ một thay
đổi nào có liên quan đến số lượng hoặc cấu trúc NST so với công thức NST chuẩn
được gọi là rối loạn NST. Rối loạn NST là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến thai dưới ba
tháng bị chết lưu. Rối loạn NST có thể là do di truyền từ bố mẹ, hoặc đột biến trong
quá trình tạo noãn, tạo tinh trùng, thụ tinh và phát triển của phôi. Nhiều nghiên cứu
cũng cho thấy tỷ lệ rối loạn NST tăng lên rõ rệt theo tuổi của người mẹ.
Lệch bội, sự mất đi hoặc tăng thêm một hoặc một vài NST là nguyên nhân phổ
biến của rối loạn NST ở người. Một NST thêm vào gọi là “tam nhiễm sắc thể”
(trisomy) là nhóm chiếm nhiều nhất trong các bất thường NST (chiếm khoảng 90%)
và là một trong những nguyên nhân quan trọng của dị dạng bẩm sinh cũng như chậm
phát triển tâm thần vận động. Trisomy của NST 13 (hội chứng Patau), 18 (hội chứng
Edwards), và 21 (hội chứng Down) là một mối quan tâm lớn trong chẩn đoán trước
sinh bởi vì chúng là ba NST thường được tìm thấy với tần số cao ở các bất thường của
các ca sinh sống [26], [27]. Ngoài ra, sự không phân tách của các nhiễm sắc thể giới
tính trong quá trình giảm phân ở người gây ra một số nhiễm sắc thể bất thường như:
XO (hội chứng Turner), XXY (hội chứng Klinefelter),…Sự không phân tách cũng có
thể xảy ra trong nguyên phân gây ra các thể khảm ở các tế bào bình thường và lệch
bội.
1.1.1. Hội chứng Down
Hội chứng (HC) Down lần đầu tiên được mô tả bởi bác sĩ Iohn Langdon Down
vào năm 1887. Đến năm 1959, nguyên nhân về mặt di truyền của HC Down đã được
phát hiện là do thừa một NST số 21 trong bộ NST nên còn được gọi là trisomy 21. HC



Tổng quan tài liệu

Thực tập Tốt nghiệp

1.1.2. Hội chứng Edwards
HC Edwards được bác sĩ John Hilton Edwards mô tả lần đầu vào tháng 4/1960
trên tạp chí y học Lancet. HC Edwards xảy ra khi bệnh nhân bị thừa một NST số 18
nên còn gọi là trisomy 18, đây là trisomy phổ biến đứng hàng thứ hai sau HC Down
với tỉ lệ khoảng 1/3.000 trẻ sơ sinh [11].
Trẻ mắc HC Edwards thường có các đặc điểm kiểu hình như: đầu nhỏ, cằm
nhọn, trán hẹp, tai thấp, tay bất thường, ngón tay co quắp, chân khoèo,…và 90% trẻ
có dị tật tim đi kèm [2]. HC Edwards thường gây chết thai hoặc tử vong sớm sau sinh.
Khoảng 80% trẻ bị HC Edwards chết trong tuần đầu tiên sau sinh. Một số ít có thể
sống hơn một tháng. Khoảng 5 - 10% có thể sống hơn một năm tuổi [3].

Hình 1.3. Karyotype và hình ảnh tay bất thường của trẻ mắc HC Edwards.
(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9])
Nguyên nhân chủ yếu của HC này là do trong quá trình phát sinh giao tử ở bố
hoặc mẹ cặp NST 18 không phân ly tạo ra các tinh trùng hoặc trứng thừa một NST 18.
Khi tế bào sinh dục bất thường thụ tinh với tế bào sinh dục bình thường sẽ tạo nên
hợp tử có bộ NST bất thường. Khoảng 95% các trường hợp dạng trisomy 18 thuần và
khoảng 5% là thể khảm hoặc các thể phối hợp khác như chuyển đoạn [4].

5


Tổng quan tài liệu



1.1.4.1.

Hội chứng Klinefelter

Đây là HC rối loạn NST giới tính hay gặp nhất ở nam giới, chiếm tỉ lệ khoảng
1/500 – 1/1.000 ở các bé trai mới sinh ra [29]. HC này được bác sĩ Harry Klinefelter
mô tả lần đầu tiên vào năm 1942, nguyên nhân là do dư một nhiễm sắc thể giới tính X
nên có bộ nhiễm sắc thể là 47,XXY. Bên cạnh đó, HC Klinefelter còn có các dạng
khác như: thể khảm 47,XXY/46XY; 48XXXY; 48,XXYY và 49,XXXXY. Hầu hết
các bất thường NST này do hiện tượng không phân ly NST xảy ra ở bố hoặc mẹ.
Người mắc HC Klinefelter thường vô sinh, chỉ số IQ hơi thấp hơn bình thường,
phát triển các đặc điểm thiên về nữ giới như vú phát triển, lông mu mọc theo kiểu nữ,
ít râu, …

Hình 1.5. Karyotype và hình ảnh của người mắc HC Klinefelter [9].
1.1.4.2.

Hội chứng Turner

Nếu HC Klinefelter là rối loạn NST giới tính thường gặp nhất ở nam thì HC
Turner thường gặp nhất ở nữ, chiếm tỉ lệ khoảng 1/2.000 bé gái sơ sinh [16]. Năm 1938,
Henry Turner đã mô tả các triệu chứng chính của bệnh: lùn, thiểu năng sinh dục,

7


Tổng quan tài liệu

Thực tập Tốt nghiệp

biện pháp chăm sóc hay điều trị phù hợp và kịp thời. Các bước sàng lọc trước sinh
nên thực hiện gồm siêu âm thai, xét nghiệm Double test và Triple test.
1.2.1. Siêu âm thai
Siêu âm là phương pháp sàng lọc không xâm lấn đến thai nhi nên có thể
được xem là công cụ an toàn để phát hiện các dị tật của thai nhi.
Khi thai nhi được 11 tuần – 13 tuần 6 ngày tuổi, siêu âm cho phép đánh giá
tuổi thai và đo độ mờ da gáy (nuchal translucency – NT). Độ mờ da gáy là chiều rộng
lớn nhất của khoang dịch nằm giữa da và đốt sống cổ của thai nhi. Chỉ số bình thường
của NT là < 3mm, nếu NT ≥ 3mm là có nguy cơ cao [7]. Ngoài ra, siêu âm còn giúp
xác định xương mũi của thai nhi, nếu xác định không thấy xương mũi của thai nhi thì
nguy cơ trẻ mắc HC Down càng cao.
Vào tuần thứ 21 – 25 của thai kỳ, kết quả siêu âm có thể cho biết hầu hết các
bất thường về hình thái thai nhi như: sứt môi, hở hàm ếch, dị tật của các cơ quan khác,
…Đây là siêu âm quan trọng vì nếu cần đình chỉ thai kỳ thì phải thực hiện trước tuần
thứ 28 [35].
1.2.2. Xét nghiệm máu
Việc xác định nồng độ một số chất trong máu có thể giúp phát hiện các thai nhi
có nguy cơ bị dị tật như thai vô sọ, nứt đốt sống, một số rối loạn NST,…Có 2 xét
nghiệm tầm soát phổ biến là Double test được thực hiện ở quý 1 và Triple test ở quý 2
của thai kỳ. Giống như siêu âm, cả hai xét nghiệm Double test và Triple test là các xét
nghiệm không xâm lấn và không có ảnh hưởng đến mẹ và thai nhi.
1.2.2.1.

Xét nghiệm Double test

Xét nghiệm Double test là xét nghiệm sinh hóa lấy máu mẹ để thực hiện 2 xét
nghiệm: định lượng PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) và β-hCG
9



Nếu xét nghiệm Double test và Triple test có kết quả cho thấy thai có nguy cơ
cao bị một hoặc nhiều rối loạn NST thì cần tiến hành chẩn đoán trước sinh bằng các
thủ thuật xâm lấn như chọc ối hoặc sinh thiết gai nhau.


10


Tổng quan tài liệu

Thực tập Tốt nghiệp

CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH RỐI LOẠN NHIỄM

1.3.

SẮC THỂ
Một lĩnh vực đặc biệt quan trọng đối với y học cộng đồng là công tác chẩn
đoán trước sinh đối với các bất thường NST, nhất là khi việc kiểm soát dân số và phát
triển kinh tế cũng như dân trí khiến những người làm bố mẹ ngày càng quan tâm hơn
đến đứa con mà họ sẽ sinh ra. Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh là những
thủ tục chẩn đoán chuyên sâu có nguy cơ gây sẩy thai và tốn kém về mặt kinh tế nên
chỉ được khuyến cáo áp dụng cho những thai phụ có nguy cơ cao mang thai bị rối
loạn
NST. Do đó, các cặp vợ chồng nên được tư vấn và thảo luận kỹ trước khi quyết định
thực hiện các thủ thuật chẩn đoán.
1.3.1. Kỹ thuật thu mẫu tế bào thai nhi
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều phương pháp để thu nhận tế bào thai như
phương pháp chọc hút dịch ối (amniocentesis), sinh thiết gai nhau (chorionic villus
sampling – CVS), lấy máu thai nhi từ cuống rốn [28].

bánh nhau từ tử cung. Mẫu bánh nhau sẽ được lấy bằng catheter (một ống dài) hoặc
sử dụng kim chọc qua đường bụng hay đường âm đạo. Kỹ thuật này cho phép chẩn
đoán dị tật thai nhi sớm hơn chọc ối nhưng kèm theo rủi ro cao hơn (tỷ lệ sẩy thai
khoảng 1,9 – 2,1%) [8], [17].
1.3.1.3.

Chọc hút máu cuống rốn

Đây là kỹ thuật lấy máu thai nhi qua đường dây rốn dưới sự chỉ dẫn của siêu
âm, được thực hiện vào tuần thai 18. Kỹ thuật này ít được áp dụng hơn so với hai kỹ
thuật chọc ối và sinh thiết gai nhau vì khả năng tai biến cao như: sẩy thai, chảy máu
kéo dài, chảy máu từ thai sang mẹ, bất thường cấu trúc thai, thai chậm phát triển, nang
nước [2].
Các tế bào của thai nhi sau khi thu nhận bằng những kỹ thuật trên sẽ được sử
dụng cho các kỹ thuật di truyền để phân tích các bất thường của NST.
1.3.2. Kỹ thuật lập nhiễm sắc thể đồ (karyotype)
Năm 1952, kỹ thuật karyotype đã được sử dụng trong nghiên cứu di truyền tế
bào và đến nay qua nhiều đợt cải tiến, kỹ thuật này trở thành một công cụ không thể
thiếu trong việc phân tích các rối loạn di truyền ở người. Karyotype được các nhà
nghiên cứu đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán trước sinh những bất thường
của NST.
Karyotype dựa trên nguyên tắc khảo sát bộ NST của tế bào ở kỳ giữa
(metaphase) hoặc kỳ giữa sớm (pro-metaphase). Karyotype được thực hiện bằng cách
nuôi cấy tế bào trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt. Sau thời gian thích hợp, tế bào
được thu hoạch, trải lên lam sau đó tiến hành nhuộm GTG (Giemsa Trypsin Gbanding) để phân tích bộ NST.
12


Tổng quan tài liệu



Tổng quan tài liệu

Thực tập Tốt nghiệp

Hình 1.7. Hình ảnh minh họa kết quả FISH của thai nhi mắc hội chứng Patau.
(Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ)
1.3.4. Kỹ thuật QF-PCR
Khắc phục nhược điểm thời gian thực hiện dài của karyotype, chí phí cao và
tốn nhiều công thao tác của FISH, kỹ thuật QF-PCR đã ra đời và lần đầu tiên được áp
dụng để phát hiện các rối loạn NST vào năm 1993 [18]. Đến nay, kỹ thuật này đã trở
thành phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả và được ứng dụng ở nhiều nơi
trên thế giới.
1.3.4.1.

Khái niệm

Kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction)
được gọi là phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang định lượng, dùng để khuếch đại các
đoạn DNA ngắn đặc hiệu (STR), đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng
bằng điện di mao quản [23].
STR (short tandem repeat) hay microsatellite là các trình tự lặp lại song song
ngắn có tính đa hình rất cao do số lần lặp lại khác nhau giữa các cá thể. STR chứa
trình tự lặp lại gồm 2 – 6 nucleotide. STR cũng đặc trưng cho từng NST nên các NST
khác nhau chứa các trình tự STR khác nhau. Trong kỹ thuật QF-PCR, STR đóng vai
trò là các marker để khuếch đại một số locus nhất định trên các NST 13, 18, 21, X và
Y, qua đó xác định được số lượng các alen thông qua hình ảnh điện di. Ngoài ra, STR
được lựa chọn làm marker phải có mức độ dị hợp tử cao vì kết quả với nhiều alen
14



Tình hình ứng dụng kỹ thuật QF-PCR ở một số nước trên thế giới

Việc có nên thay thế kỹ thuật karyotype truyền thống bằng kỹ thuật QF-PCR
vẩn còn tranh cãi ở nhiều nơi trên thế giới. Tại Anh, kỹ thuật QF-PCR được sử dụng
độc lập để chẩn đoán rối loạn số lượng NST trước sinh mà không cần karyotype.
Trong khi đó, ở Mỹ và Canada, các kết quả QF-PCR phải được kiểm tra lại bằng
15


Tổng quan tài liệu

Thực tập Tốt nghiệp

karyotype. Ở Hà Lan, Thụy Điển và Phần Lan, những thai có nguy cơ do tuổi mẹ, xét
nghiệm sàng lọc huyết thanh dương tính và kết quả siêu âm có dấu hiệu gợi ý thì
được
đề nghị áp dụng kỹ thuật QF-PCR còn những thai có bất thường hình thái khi siêu âm
thì nên thực hiện karyotype [4].


16


Vật liệu – Phương pháp

2.1.

Thực tập Tốt nghiệp


Kit InstaGene Matrix (Bio Rad)
Hóa chất trong điện di mao quản



Kit Devyser Complete và Devyser Resolution (Devyser AB)




Hi-DiTM Formamide (Applied Biosystems)



GeneScan 500 ROX (Applied Biosystems)



Pop 7, 3500 (Applied Biosystems)



Buffer Anode, Cathode (Applied Biosystems)

560 SIZER ORANGE (Applied Biosystems)

17


Vật liệu – Phương pháp



Máy vortex (Eppendorf)



Máy khuấy từ (Heidolph)



Máy ủ nhiệt khô có lắc (Eppendorf)



Máy luân nhiệt theo chu kỳ Mastercycler Pro S (Eppendorf)



Hệ thống giải trình tự ABI 3500 (Applied Biosystems)



Phần mềm phân tích đoạn DNA GeneMarker (SoftGenetics)



Tủ mát 4OC (Sanyo)




19


Vật liệu – Phương pháp
2.2.

Thực tập Tốt nghiệp

PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Các bước chính trong quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR có thể tóm tắt theo

sơ đồ 2.1.
Ly trích DNA tổng số

Thực hiện phản ứng luân nhiệt – PCR

Điện di mao quản

Phân tích kết quả
Sơ đồ 2.1. Quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR
2.2.1. Phƣơng pháp ly trích DNA từ dịch ối bằng kit Instagen Matrix
Các bước chính được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất [6].
-

Sau khi nhận mẫu dịch ối, ly tâm 1.500 rpm trong 5 phút để kiểm tra chất
lượng mẫu. Nếu mẫu lẫn máu nhiều sẽ được chuyển sang bước cấy để nuôi
cấy tế bào ối.

-


Vật liệu – Phương pháp
-

Thực tập Tốt nghiệp

Vortex ở tốc độ cao. Ly tâm 12.000 rpm trong 2 phút.

Những bước chính trong ly trích DNA bằng kit InstaGene Matrix được tóm
tắt theo sơ đồ 2.2.
-

Mẫu dịch ối
Ly tâm

-

Ly tâm
Hút bỏ dịch
nổi

Bổ sung dung dịch InstaGene Matrix

Hút cặn dịch ối và rửa
với dung dịch PBS

Vortex
Spin

Vortex
-


5 µl
20 µl

Devyser Complete Mix 1 gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu
cho 14 marker đặc trưng trên các NST 13, 18, 21. Tương tự, Devyser Complete Mix 2
gồm các cặp mồi được đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu cho 19 marker đặc trưng trên
các NST 13, 18, 21, X, Y và đặc biệt trong đó có 2 marker là T1, T3 được sử dụng để
đếm số lượng NST X. Các marker được trình bày trong bảng 2.1. và 2.2.
Bảng 2.1. Các marker được sử dụng trong phản ứng PCR 1 [13].
Kí hiệu
13A
13B
13C
13D
13K
18B
18C

Vật liệu – Phương pháp

Tên Marker