ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----o0o-----

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến:
- TS. Đỗ Tuấn Đạt, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1
- PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học,
trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
Là những người Thầy đã tận tình quan tâm dạy bảo cùng những kinh nghiệm
quý báu và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Sinh học - trường Đại
học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giảng dạy và dìu dắt tôi
trong suốt quá trình học tập vừa qua.
Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã
động viên, giúp đỡ và chia sẻ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành nhiệm vụ học tập của
mình.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Học viên

Staphyloccus

aureus

và

Hemophilus

influenza,

trong

đó

Staphyloccus aureus là nguyên nhân thường gặp và rất nguy hiểm, gây nên suy


hô hấp, thiếu oxy và diễn biến nặng sau 2-3 ngày sau khi nhiễm bệnh................24
1.9. Vắcxin cúm......................................................................................................24
1.10. Một số dạng vắcxin cúm...............................................................................28
1.11. Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm..............30
Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..........................................................32
2.1. VẬT LIỆU.......................................................................................................32
2.1.1. Tế bào.......................................................................................................32
2.1.2. Mẫu thử nghiệm.......................................................................................32
2.1.3. Môi trường và hóa chất............................................................................32
2.1.4. Trang thiết bị và dụng cụ..........................................................................34
2.2. PHƯƠNG PHÁP.............................................................................................35
2.2.1. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy
hoại 50% tế bào).................................................................................................35

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng Error: Reference source
not found.......................................................................................................................8
Bảng 1.2. Các ca nhiễm cúm A (A/H5N1) được xác định ở các nước 2003-2015
Error: Reference source not found.............................................................................22
Bảng 1.3. Báo cáo tổng kết giám sát cúm mùa năm 2014 Error: Reference source
not found.....................................................................................................................23
Bảng 2.1. Công thức pha môi trường MEM..............................................................35
Bảng 2.2. Công thức pha môi trường DMEM...........................................................35
Bảng 2.3. Công thức pha môi trường LH3E..............................................................36
Bảng 2.4. Pha loãng mẫu thử nghiệm và kháng nguyên chuẩn.................................39
Bảng 3.1. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác
nhau (lần 1).................................................................................................................54
Bảng 3.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghịêm khác
nhau (lần 2).................................................................................................................54
Bảng 3.3. Kết quả chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với các điều kiện thử nghiệm khác
nhau (lần 3).................................................................................................................54
Bảng 3.4. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1.....56
Bảng 3.5. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1.....56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hạt vi rút cúm Error: Reference source not found........................4
Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm B Error: Reference source not found..........................6
Hình 1.3. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 Error: Reference source not found..............6
Hình 1.4. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 Error: Reference source not found..............6
Hình 1.5. Hình ảnh vi rút cúm A/H5N1 Error: Reference source not found.............7
Hình 1.6. Vi rút cúm A/H5N1 và quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào, nhân
lên thành vi rút mới.....................................................................................................16
Hình 1.7. Lưu hành của cúm A, cập nhật đến 17/9/2015 (thông qua các mẫu hô hấp

quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1.....................71
Hình 3.17. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1..........................................................................72
Hình 3.18. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1........................................................................73



MỞ ĐẦU
Bệnh cúm đã và đang đe dọa toàn cầu. Trong ba thế kỷ qua, cứ
khoảng 10 đến 40 năm, thế giới lại chứng kiến một đại dịch cúm. Trước khi
có vắcxin, mỗi đợt dịch có hàng triệu người chết. Năm 1918 chứng kiến đại
dịch cúm nghiêm trọng nhất lịch sử thế giới, thậm chí còn được cho là đại
dịch kinh hoàng nhất trong các loại bệnh dịch. Tác nhân gây dịch là vi rút
cúm A/H1N1 đã gây tổn thất chưa từng thấy. Dịch cúm gia cầm A/H5N1
xuất hiện từ giữa tháng 12/2003 tại Hàn Quốc, sau đó lan rộng ra một số
nước châu Á trong đó có Việt Nam. Từ đầu tháng 4/2009, Mexico đã thông
báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1. Vi rút này nhanh chóng lan ra rất nhiều
quốc gia trên thế giới và đã có thời điểm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG)
phải đưa ra các cảnh báo coi đây như là một đại dịch cúm mới. Gần đây nhất,
vào năm 2013, trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên được thông báo ở
Trung Quốc và đang tiếp tục dấy lên một mối lo ngại cho châu Á nói riêng
cũng như toàn Thế giới nói chung về một căn nguyên cúm mới nguy hiểm
đối với sức khoẻ con người.
Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo
nên gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40%
quốc gia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm. Do vậy,
phát triển các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp
bách hiện nay. Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho người ở Việt
Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng

Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài,
genom là ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút
cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành
phổ biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn nguyên gây
nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và
thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống
nhau về cấu trúc. Thể vi rút có chiều ngang từ 80-120 nm, và thường có hình gần
như tròn, ngoài ra vi rút cũng có thể hiện diện một số dưới dạng hình sợi. Thể vi rút
cúm được cấu tạo từ một vỏ vi rút bao gồm 2 loại glycoprotein, quấn quanh một
phần nhân trung tâm. Phần nhân trung tâm chứa bộ gene RNA và các protein khác
có chức năng đóng gói và bảo vệ thể RNA này. Đối với 1 vi rút, thông thường bộ
gene không chỉ có 1 mảnh nucleic acid; thay vào đấy, sẽ chứa 7 hoặc 8 mảnh RNA
có chiều âm và phân đoạn. Vi rút cúm A có bộ gene mã hoá cho 11 protein trên 8
đoạn RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1,
M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 và PB2.
1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm
Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có
hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm. Các hạt virion
của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từ
màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein
dạng trần không được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, ở typ A và B
có 8 đoạn ARN(-) với tổng khối lượng 5x10 6, còn ở typ C có 7 đoạn. Trong virion
có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình
phiên mã vì genom ARN chuỗi (-). Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit
đối xứng xoắn.

3


Hình 1.1. Cấu trúc hạt vi rút cúm Error: Reference source not found

khỏi tế bào.
Vi rút typ A có 16 loại gai H và hầu hết các loại gai này có ở vi rút gây
nhiễm ở động vật (chim, gà, vịt, ngỗng, gà tây, lợn ngựa và một số loại động vật có
vú khác). Ba loại gai H quan trọng có ở vi rút gây bệnh cho người là H1, H2 và H3.
Trước đây có H0 và HW (H lợn), nhưng về sau 2 gai này được coi là H1.
Có 9 loại gai N, trong đó N1 và N2 là quan trọng nhất vì gây bệnh cho
người.

5


Hình 1.2. Hình
ảnh vi rút cúm
B Error:
Reference
source not
found.
cúm

Vi

rút

B

với

virion dạng hình
cầu điển hình với đường kính hạt vi rút thay đổi từ 80- 120nm. Bên ngoài vỏ bao
ngoài hạt vi rút là các gai ngắn dài khoảng 12nm rõ nét bám xung quanh. Nhuộm

Error:

Reference source not found
Vi rút cúm A/H5N1 với hình dạng và kích thước thay đổi: hình cầu, hình
que, đường kính hạt vi rút khoảng 100nm, dài đến 1μm. Các gai ngắn sắp xếp đều
trên bề mặt hạt vi rút với chiều dài của gai khoảng 17nm. Nhuộm PTA 0,25%
(thước đo 100nm).
1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa
Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7
đoạn gen ( không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu nhờ
kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc gen
của vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1,
đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7
cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúm
PR8/34 và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982 Error: Reference
source not found. Vi rút R8/34 có 13.588 nucleotit.

7


Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng Error: Reference source
not found
Phân
đoạn
ARN

Protein

TLPT
(kDa)

2341

759

30-60

2

PB1

86 500

2341

757

30-60

3

PA

84 200

2233

716

30-60


56 101

1778

1565

566

498

8


6

NA

M1

50 087

1413

27 801

7

454

100


14 216

Phân tử có cấu trúc tetramer,
thủy phân bằng protease, cho
phép vi rút tiến qua lớp niêm
mạc tới các tế bào của đường hô
hấp trong quá trình nhiễm trùng.
Loại bỏ phân tử axit sialic của
phân tử HA từ các virion mới
được tổng hợp, làm lộ HA ra
ngoài, tăng khả năng nhiễm
trùng.
M1: là kháng nguyên đặc hiệu
typ, có chức năng ổn định vrrus,
điều khiển hoạt tính ARNprotease và tham gia vào quá
trình lắp rắp vi rút (70%).
M2: kênh ion.
Là protein không cấu trúc, kết
thúc quá trình tổng hợp protein
của tế bào túc chủ, chỉ có trong
tế bào nhiễm vi rút.

Đoạn ARN đơn của vi rút cúm C mã hóa cho protein liên kết haemaglutininesteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt động hòa mạng
của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở vi rút cúm A và B những đặc tính
do các đoạn gen riêng biệt mã hóa. Chiều dài của các đoạn gen và các protein mã
hóa được liệt kê trong bảng trên. Đoạn gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm

9



10


rút, loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả 2 dạng: Dạng tiền thân
không phân tách HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit (HA 1 có
trọng lượng 47.000 dalton và HA2- 29.000 dalton). Quá trình phân tách là điều kiện
quyết định để vi rút có khả năng lây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả
năng lây truyền Error: Reference source not found. HA chính là đoạn gen đầu tiên
của vi rút cúm được xác định trình tự. HA 1 có từ 319 đến 326 axit amin và HA 2 có
từ 221 đến 222 axit amin. Tùy thuộc vào các phân typ HA, số lượng các axit amin
bị phân tách giữa HA1 và HA2 là 1 đến 6. HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt
virion vi rút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy
bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị.
Tuy nhiên, xử lý vi rút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng
nguyên và cấu trúc ba chiều, có khả năng hòa tan trong nước và chứa toàn bộ HA 1
cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA 2 Error: Reference
source not found . Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị
phân tử. Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân typ (Tyr- 98, Tyr –
153, His – 183, Glu – 190, Leu – 194) . Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ thể khác nhau
giữa khí quản người (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số lượng các phân tử
có thể chuyển từ loài này sang loài khác và có thể bị giới hạn . Sự phân tác HA 0
thành HA1 và HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do vậy cần thiết đối với
hoạt tính gây nhiễm của vi rút. Những HA đó đều chứa chuỗi R-X-K-/R-R ở cầu
nối peptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một proteaza của mạng transGolgi . HA chỉ có arginnine đơn ở cầu nối peptit không bị phân tách khi nuôi cấy
trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ bị phân tách bởi tpypsin ngoại sinh.
Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA có arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phân
tách do proteaza Error: Reference source not found. Nhiều nghiên cứu cho rằng vị
trí phân tách có liên quan đến độc tính vi rút và chủng vi rút độc lực có chứa kiểu
nhận biết furin trong khi chủng vi rút không độc lực chỉ chứa arginine đơn . Tuy

vỏ ngoài của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H chồi lên
khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARNpolymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza của
vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn đơn, (-)
của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5 ’ của mARN có

12


gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ.
Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử mARN mới hoàn thiện
của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân.
Kết quả quá trình phiên mã từ 8 đoạn ARN genom (-) tạo ra 10 phân tử
mARN, bởi vì đoạn 7 và 8 mỗi đoạn phiên mã tạo ra 2 phân tử mARN. 6 phân tử (1
– 6) dịch mã cho ra 6 protein, còn 2 phân tử (7 – 8) do có 2 khung đọc nên mỗi
phân tử tạo ra 2 phân tử protein. Điều này được thực hiện không phải do sử dụng
mARN đa gen (polycistronic) thật sự như ở prokaryota, bởi vì riboxom ở eukaryote
chỉ nhận diện bộ ba khởi đầu AUG nằm sát đầu 5’ của mARN.
Như vậy từ 1 ARN đã cho ban đầu, chúng chỉ tạo ra được 1 protein. Hai
đoạn 7 và 8 tiến hành phiên mã cho ra 2 mARN có chiều dài đủ. Mỗi trường hợp
tổng hợp một loại protein bổ sung cho dịch mã từ mARN đã được chế biến nhờ bộ
máy cắt ghép (splicing) của tế bào chủ. Giống như các gen chồng lớp, một lần nữa
đây là ví dụ cho thấy các vi rút ARN đã tận dụng tối đa genom nhỏ bé của mình như
thế nào.
Khác với đa số vi rút ARN, protein cấu trúc sau khi được tổng hợp lại được
chuyển vào nhân và quá trình lắp rắp ribonucleoprotein xảy ra trong nhân. Các
glycoprotein HA và NA được tổng hợp trên mạng lưới nội chất hạt sau đó được di
chuyển tới các vùng chuyên biệt trên màng sinh chất. Protein M cũng di chuyển đến
màng và liên kết với màng nhờ gai HA và NA. Ribonucleoprotein và ARNpolymeraza cũng từ nhân di chuyển ra tế bào chất rồi tới màng sinh chất, nơi đã có
protein M và các gai HA, NA. Virion ra khỏi tế bào chất theo lối nảy chồi với sự
tham gia của neuraminidaza. Nếu enzyme này bị ức chế thì virion không được giải

là nguyên nhân gây ra các vụ dịch nhỏ, tản phát Error: Reference source not found.

14


15


Hình 1.6. Vi rút cúm A/H5N1 và quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào,
nhân lên thành vi rút mới
1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào
Vi rút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các vi rút cúm
có thể được nuôi trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên
phát. Việc nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản
xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên
phát (PMKC) hay thận chó Madin- Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập
vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy 100% trong
phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và MRC-5 là
57,1%.
Sự phát triển của vi rút trên nuôi cấy tế bào và tạo các đám hoại tử trong một
số dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận gà.
Ngoài ra nếu sử dụng các dòng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ sung để
hoạt hóa các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của vi rút.
1.6. Kỹ thuật di truyền ngược
Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên trong
nhân của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của
ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp
vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein
polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bản
diễn ra tại đây, vARN sợi (-) không thể trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein mà