ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN HỮU THUẦN ANH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR
LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE
Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO

(Solanum hainanense Hance)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT

HUẾ - 2016


Công trình được hoàn thành tại: Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa
học, Đại học Huế và Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài
nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huê (2011-2014).
Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc
PGS.TS. Cao Đăng Nguyên

Phản biện 1: ............................................................................................................
............................................................................................................
Phản biện 2: ............................................................................................................
............................................................................................................
Phản biện 3: ............................................................................................................
............................................................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp

uất phát từ đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh
ưởng c a một số elicitor lên khả năng t c lũy solasodine ở tế
bào in vitro c a cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).

p

dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù tạo nguồn nguyên liệu
cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự nhiên

1


cho các nghiên cứu trong ĩnh vực y học. Các kết quả của đề tài sẽ
àm cơ sở cho việc xây dựng

qui trình sản xuất solasodine từ sinh

khối tế ào để ứng dụng trong ĩnh vực dược phẩm sau này.
M c tiêu c a đề t i
Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi
cấy in vitro tế bào của cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance).
ng a

oa ọc v t

c tiễn
: Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung

cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về khả năng t ch ũy
solasodine trong tế bào cà gai leo khi nuôi cấy có bổ sung các

C ương 1.
T NG QUAN T I LIỆU
1.1. SẢN
TẾ

UẤT C C H P CHẤT THỨ CẤP TỪ NU I CẤY

O THỰC VẬT
Nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các

hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương iệu và màu nhuộm mà
không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp
bằng phương pháp h a học. Ưu điểm của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết
một tỷ lệ lớn ượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy.
Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm một ượng nhỏ
(nhỏ hơn 1% trọng ượng khô) và độc lập cao trong thời kỳ sinh lý và
phát triển của thực vật. Mặc dù hợp chất thứ cấp dường như không
được thừa nhận vai trò trong việc duy trì quá trình sống cơ ản của
thực vật - nơi mà chúng được tổng hợp, chúng có vai trò quan trọng
trong sự tương tác giữa thực vật với môi trường.
1. . ỨNG D NG CHẤT KÍCH KH NG ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ
NĂNG TÍCH LŨY H P CHẤT THỨ CẤP TRONG NU I CẤY
TẾ

O THỰC VẬT
Elicitor thực vật có thể được định nghĩa như à một chất cơ

bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì
khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp. Sự

alkaloid ức chế acetylcholinsterase - một enzyme quan trọng trong
việc truyền xung động thần kinh. Gần đây, so asodine được biết như
một tác nhân hóa trị liệu mới cho điều trị ung thư đặc biệt là ung thư
da.

4


C ương
ĐỐI TƯ NG, NỘI DUNG V PHƯ NG PH P NGHI N CỨU
.1. ĐỐI TƯ NG NGHI N CỨU
Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in
vitro.
. . NỘI DUNG NGHI N CỨU
- ác định khả năng sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế
bào cà gai leo.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor đến khả năng
sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo:
+ Nồng độ elicitor: MeJA (25-250 µM, 1-5 g/L YE, 50-250
µM SA)
+ Thời gian nuôi cấy: 7 tuần
+ Thời điểm cảm ứng: 7-21 ngày
- Khảo sát sơ ộ hoạt tính sinh học của dịch chiết solasodine
n khả năng ức chế co agenase.
- Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế
bào in vitro của cây cà gai leo.
. . PHƯ NG PH P NGHI N CỨU
. .1. P ương p

p nuôi cấy

a sin

2.3.2.1. Chi t Soxhlet
2.3.2.2. Sắc ký lỏng hiệ
2323
. . .

ă g cao

ức ch collagenase của solasodine
l số liệu
T

t t sơ đồ t

ng iệ

Cây cà gai leo in vitro
Nuôi cấy callus
Nhân callus
Nuôi cấy tế ào
ử ý các elicitor khác nhau
Thăm dò nồng độ elicitor
Thăm dò thời điểm ổ sung elicitor
Thu sinh khối tế ào
Tách chiết so asodine
Định ượng
Thử nghiệm hoạt t nh sinh học

6

Nồng độ MeJA
GI
(µM)
Tươi
Khô
25
3,89b
0,37b
1,30
d
bc
50
3,38
0,35
1,13
100
3,57c
0,34c
1,19
150
2,96e
0,36bc
0,99
f
bc
200
2,40
0,34
0,80
250


Solasodine (mg/g)
127,5c
159,0a
138,0b
98,0e
38,0f
36,5f
123,5d
23,5g

ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ của cây tự nhiên 1 năm tuổi

3.2.1.2. Thời gian nuôi cấy

8


Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM
MeJA

Hình 3.6. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
50 µM MeJA

3.2.1.3. Thờ đ ểm cảm ứng
Dựa vào kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ MeJA lên
khả năng t ch ũy so asodine trong tế bào cà gai leo, 50 µM MeJA
được chọn để khảo sát thời điểm cảm ứng trong nuôi cấy tế bào.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời điểm xử ý MeJA 50 µM


0,84
0,99
1,13

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung MeJA 50 µM lên khả năng t ch
ũy so asodine của tế bào cà gai leo
T ời điể (ng y)
7
14
21
ĐC

H

lượng ( g g)
108,5b
79,5c
74,5d
159,0a

ĐC: bổ sung MeJA 50 µM vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy

3.2.2. Ản
3.2.2.1. Nồ

ưởng c a dịch chiết nấm men
độ dịch chi t nấm men

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo


4,98f

0,45bc

ĐC: Tế bào không xử lý elicitor

10

1,66


Bảng 3.6. Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà
gai leo
Nồng độ YE (g L)

H

lượng ( g g)
125,5d
165,0c
220,5a
198,0b
112,0e
123,5d
23,5f

1
2
3

8,79a
14
8,41a
21
5,66b
ĐC
8,80a

o (g)
Khô
0,45a
0,36b
0,35b
0,48a

GI
2,93
2,80
1,89
2,93

ĐC: 3 g/L YE được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng
t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo
T ời điể (ng y)
7
14
21
ĐC

150
200
250
ĐC

K ối lượng tế
Tươi
12,03a
8,05b
7,61bc
5,99bc
5,21c
4,98c

o (g)
Khô
0,81a
0,68ab
0,64ab
0,53bc
0,51c
0,45c

GI
4,01
2,68
2,54
2,00
1,74
1,66

khoảng 1,5 lần và 3 g/L YE khoảng 1,1 lần.
3.2.3.2. Thời gian nuôi cấy

13


Hình 3.11. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA
150 µM.

Hình 3.12. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
150 µM SA.

3.2.3.3. Thờ đ ểm cảm ứng
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA
của tế bào cà gai leo
T ời điể
(ng y)
7
14
21
ĐC

K ối lượng tế
Tươi
8,12c
8,90b
9,13a
7,61d

o (g)

117,0b
101,5c
82,5d
245,0a

ĐC: SA 150 μM được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy.

3.2.4. Ản
3.2.4.1. Nồ

ưởng kết hợp c a các elcitor
độ các elicitor

3.2.4.1.1. Kết hợp hai elicitor
Chúng tôi chọn nồng độ thích hợp nhất của chất này kết hợp
với các nồng độ khác nhau của chất kia để tìm hiểu ảnh hưởng phối
hợp chúng

n sinh trưởng và t ch ũy so asodine của tế bào cà gai

leo. Cụ thể như sau: 50 µM MeJA kết hợp với YE (1-5 g/L) hoặc SA
(50-250 µM); 3 g/L YE kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc SA
(50-250 µM); 150 µM SA kết hợp với MeJA (25-250 µM) hoặc YE
(1-5 g/L). Các elicitor được bổ sung vào môi trường vào lúc bắt đầu
nuôi cấy.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng kết hợp của từng cặp elicitor
ũy so asodine của tế bào cà gai leo
Elicitor
K ối lượng tế o (g)
SA

0,45d
ĐC

15

n sinh trưởng và tích

GI

Solasodine
(mg/g)

1,52
1,72
1,79
2,58
1,97
1,66

186,0b
165,5e
173,0c
197,5a
170,5d
123,5f


3.2.4.1.2. Kết hợp ba elicitor
Bảng 3.14. Ảnh hưởng kết hợp của 3 elicitor
solasodine của tế bào cà gai leo

GI

Solasodine
(mg/g)

1,61
1,41
1,35
1,66

153,0c
160,0b
180,5a
123,5b

3.2.4.2. Thời gian nuôi cấy
Nồng độ xử lý kết hợp của 2 chất SA 150 µM và YE 3 g/L
cho hàm ượng solasodine cao nhất đã được sử dụng để nghiên cứu.

Hình 3.15. Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA
150 µM và YE 3 g/L

Hình 3.16. Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung
150 µM SA và 3 g/L YE

16


3.2.4.3. Thờ đ ểm cảm ứng
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến
khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo
T ời điể (ng y)
7
14
21
ĐC

Solasodine (mg/g)
11,8b
51,0c
46,0d
197,5a

ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi
cấy

3.3. Khảo s t sơ ộ hoạt tính c a solasodine từ dịch chiết tế bào
cà gai leo
Bảng 3.17. Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên
collagenase
Chiều dài cột
gel an đầu
(mm)

Chiều dài cột
gel sau 24 giờ
(mm)

Chiều cao cột

1. Kh trùng:
- Ethanol 70% trong 1 phút
- HgCl2 0,1% trong 8 phút
- Rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng
2. Tạo cây in vitro từ đoạn thân có mắt lá trong
môi trường S0
Cây cà gai leo in vitro
3. Tạo callus từ đoạn thân, đoạn rễ và cuống
lá của cây in vitro trên môi trường S1
Tạo callus
4. Nhân callus trong môi trường S2
Nhân callus
5. Nuôi 3 g callus trong 50 mL môi trường
S2 (không agar) tốc độ lắc 120 vòng/phút
6. Nuôi 20 mL dịch tế bào trong 50 mL môi
trường S3 tốc độ lắc 150 vòng/phút
Nuôi tế bào huyền phù
7. Bổ sung 150 µM salicylic acid vào môi
trường S3 lúc bắt đầu nuôi cấy tế bào, tốc độ
lắc 150 vòng/phút, 4 tuần.
Tăng sinh so asodine
8. Tách chiết solasodine từ tế bào theo
p ương p p Sox let.
9. Địn lượng dịch chiết solasodine bằng sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
10. c định hoạt tính trên cột collagen gel.
Dịch chiết solasodine

Hình 3.20. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao
từ tế bào in vitro của cây cà gai leo ở quy mô phòng thí nghiệm

Thời điểm xử lý elicitor cũng à một yếu tố quan trọng ảnh
hưởng đến khả năng sinh trưởng và t ch ũy các sản phẩm thứ cấp của
tế bào thực vật. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sinh
trưởng và tích lũy solasodine của tế bào ở các thời gian xử lý elicitor
khác nhau đều giảm so với xử lý ở thời điểm an đầu của quá trình
nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như kết quả
nghiên cứu của Chong và cs (2005) về ảnh hưởng của các elicitor

19


khác nhau và thời điểm bổ sung elicitor vào mẫu nuôi cấy tế bào
Morinda elliptica.
4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN
4.2.1. Ản

ưởng c a nồng độ dịch chiết nấm men

Không giống như khi xử lý bằng MeJA, khi bổ sung YE vào
môi trường nuôi cấy, sinh khối tươi và khô thu được đều cao hơn so
với đối chứng không bổ sung elicitor. Có nghiên cứu cho rằng, khi bổ
sung vào môi trường nuôi cấy, YE có vai trò hoạt động như một
nguồn nitrogen và dưới áp lực dinh dư ng này có thể cũng đ ng một
vai trò quan trọng trong sinh trưởng và kích thích tế bào thực vật tăng
cường sản xuất hợp chất thứ cấp. Từ kết quả nghiên cứu của chúng
tôi cho thấy, cả sinh khối và hàm ượng solasodine của tế bào cà gai
eo đều tăng ở nồng độ thích hợp (2-4 g/L). Kết quả nghiên cứu của
chúng tôi tương tự như kết quả nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên
một đối tượng khác của họ cà là S. melongena.
4.2.2. Ản

cao hơn đối chứng khoảng 1,5 lần sau 28 ngày (5,16 g so với 3,39 g),
trong khi đ hàm ượng so asodine cao hơn đối chứng khoảng 13,5
lần (89,03 µg/g khô so với 6,5 µg/g khô).
Kết quả phân tích hàm ượng solasodine trong tế bào cà gai
leo cho thấy sự t ch ũy tăng dần khi bổ sung SA từ 50-150 μM, sau
đ giảm mạnh ở 200-250 μM SA. Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên
khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn
cả MeJA và YE.
4.3.2. Ản

ưởng c a thời gian x lý salicylic acid

Tương tự với khi xử lý MeJA, thời gian xử lý bằng SA càng
dài thì càng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào cây cà gai leo.
Thời gian cảm ứng ngắn (7 ngày) ít ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế
bào. Tế ào đối chứng có thời gian cảm ứng dài nhất, do đ sinh khối
chỉ được 7,61 g tươi và 0,68 g khô.
Ảnh hưởng của thời gian xử lý SA lên khả năng tổng hợp
so asodine cũng tương tự như đối với MeJA và YE, thời gian cảm
ứng càng dài khả năng t ch ũy so asodine càng cao. Kết quả khảo sát
cho thấy xử ý 150 μM SA vào thời điểm 7-21 ngày sau khi nuôi cấy
không đủ thời gian cảm ứng để tế bào có thể sản xuất một ượng
solasodine cao. Xử lý SA ngay từ lúc bắt đầu nuôi cấy vẫn cho kết

21


quả tốt nhất, cao hơn các trường hợp khác từ 2-3 lần.
4.4. ẢNH HƯỞNG PHỐI H P CÁC ELICITOR
Nhìn chung, xử lý kết hợp các elicitor ở các nồng độ khác

4,98 g/bình, sinh khối khô đạt 0,45 g/ ình và hàm ượng solasodine
đạt 123,5 mg/g khối ượng khô, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng 5,3
lần.
2. Ảnh hưởng của các e icitor đến khả năng t ch ũy
solasodine trong tế bào in vitro của cây cà gai leo:
2.1. Hàm ượng so asodine t ch ũy cao nhất khi tế bào cà gai
eo được xử lý 150 µM salicylic acid ở thời điểm bắt đầu nuôi cấy
(245 mg/g khối ượng khô).
2.2. Khi bổ sung các elicitor riêng lẽ hay phối hợp,
so asodine tăng dần từ tuần thứ 2-3, đạt cực đại ở tuần thứ 4 và sau
đ giảm dần từ tuần 5-7.
3. Solasodine từ tế bào huyền phù cà gai leo có khả năng kháng vi m,
thể hiện qua khả năng ức chế collagenase của chúng.
4. Đề xuất quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in
vitro tế bào của cây cà gai leo có xử lý 150 µM salicylic acid từ
nguồn cây tự nhiên.
ĐỀ NGHỊ
1. Nghiên cứu cải thiện sản xuất solasodine từ tế bào cà gai leo
trong hệ lên men bioreactor.
2. Nghiên cứu cơ chế tác động của elicitor đến con đường
chuyển hóa solasodine trong tế bào cà gai leo.

23