ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÝ THỊ LIỄU

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH SINH
TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH VÀ NHÂN NHANH CHỒI CÂY
BÌNH VÔI TÍM (Stephania rotunda Lour)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2011-2015

Thái Nguyên, năm 2015

Thái Nguyên, 2015



i
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực tập tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh họcCông nghệ Thực phẩm, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt được kết
quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh
học-Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt
nhất cho em trong suốt thời gian thực tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo Ngô Xuân Bình, cô giáo
Nguyễn Thị Tình và kĩ sư Lã Văn Hiền đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn
em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể
và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập; cảm ơn bạn bè đã giúp
đỡ em trong thời gian vừa qua.
Mặc dù bản thân đã cố gắng hết sức nhưng do thời gian thực hiện đề tài có hạn
nên bản khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến
đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Lý Thị Liễu


ii
DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) .....................................4

Bảng 4.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của
cây Bình vôi tím sau 40 ngày nuôi cấy. ...........................................................45


iv
DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 2.1: Cây Bình vôi tím (Stephania rotunda Lour) ...............................................5
Hình 2.2: Một số hình ảnh của cây Bình vôi tím ........................................................7
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến
khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi và ra rễ của cây Bình vôi tím. ..................27
Hình 4.1: Chồi cây Bình vôi tím trong MT bổ sung các nồng độ BA khác nhau sau
20 ngày nuôi cấy. ..............................................................................................36
Hình 4.2: Ảnh kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng tái sinh chồi
cây Bình vôi tím sau 20 ngày nuôi cấy. ...........................................................38
Hình 4.3: Chồi cây Bình vôi tím trong MT MS bổ sung nồng độ BA + GA3 khác
nhau sau 30 ngày nuôi cấy. ..............................................................................40
Hình 4.4: Chồi cây Bình vôi tím trong MT bổ sung tổ hợp BA + NAA với các nồng
độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. .................................................................42
Hình 4.5: Chồi cây Bình vôi tím trong MT bổ sung BA + IBA ở các nồng độ khác
nhau sau 40 ngày nuôi cấy. ..............................................................................44
Hình 4.6: Rễ cây Bình vôi tím trong MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) và IBA
ở các nồng độ khác nhau sau 40 ngày nuôi cấy. ..............................................46


v
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
BA


LSD

: Least Singnificant Difference Test

MS

: Murashige & Skoog (1962)

MT

: Môi trường

NAA

: α-Naphthalene acetic acid

WHO

: World Health Organization


vi
MỤC LỤC
Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ....................................................................2
1.2.1. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu đề tài ...........................................................................................2

2.6.2. Phương pháp nhân giống vô tính............................................................21
2.6.3. Phương pháp nhân giống in vitro. ..........................................................21
2.6.4. Phương pháp chế biến và sử dụng. .........................................................22
2.7. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới. ....................................22
2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .........................................................22
2.7.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................23
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...26
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .............................................................26
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................26
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................26
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu..............................................26
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ....................................................................26
3.4. Nội dung nghiên cứu .................................................................................27
3.5. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................27
3.5.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy invitro ....................................................27
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................27
3.5.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ...............................................................28
3.6. Xử lí số liệu ...............................................................................................32
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................33
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ, thời gian của HgCl2 đến khả
năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro. ..............................................33
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số auxin và cytokinin đến khả
năng tái sinh chồi cây Bình vôi tím ..................................................................35


viii
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh
chồi cây Bình vôi tím từ đoạn thân mang chồi ngủ. ........................................35
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh
chồi cây Bình vôi tím từ đoạn thân mang chồi ngủ .........................................37

giảm đau, an thần, gây ngủ rất hiệu quả, điều hòa hô hấp và điều hòa tốt đối với tim
mạch [13]. Hàm lượng hoạt chất này có trong củ Bình vôi tươi khoảng 0,12 – 0,3%.
Roemerin có tác dụng gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp. Cepharanthin được
coi là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch và làm giảm nhẹ một cách hữu hiệu
những tác dụng phụ của các thuốc chống ung thư. Thí nghiệm trên ống kính (in
vitro) đã xác minh cepharanthin ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư Hela và
Hela S3. Ngoài ra, Bun Sok-Siya và cs (2009) đã chiết xuất cepharanthin có tác
dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thư đại trực tràng và ung thư gan. Mặt khác, còn ức
chế sự phát triển của trực khuẩn lao. Ngoài công dụng điều trị bệnh, củ Bình vôi
còn được trồng làm cây cảnh được nhiều người ưa chuộng [6].
Tuy nhiên, từ trước đến nay người dân chỉ biết khai thác nguồn củ Bình vôi
từ tự nhiên mà ít có các nghiên cứu về trồng trọt và nhân giống. Trong khi Bình vôi
nhân giống bằng hạt được tạo ra từ quá trình thụ phấn giữa hoa đực và hoa cái [6].
Tuy nhiên cây cho hoa đực và cây cho hoa cái nằm khác gốc vì vậy việc thụ phấn
gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa phương pháp cắt phần đầu củ, củ thành từng mảnh
đem trồng không đem lại hiệu quả cao. Vì trong điều kiện thời tiết nóng ẩm mưa
nhiều của nước ta vi sinh vật hoạt động mạnh làm thối củ hàng loạt. Bên cạnh đó,
giá trị dược liệu củ Bình vôi đã được công bố dẫn đến việc khai thác ồ ạt làm cho số


2
lượng trong tự nhiên suy giảm nghiêm trọng. Vì vậy cây này hiện nay đang rất khan
hiếm và đã được đưa vào danh mục cần bảo tồn. Theo Nghị định số 32/2006, NĐCP ngày 30 tháng 3 năm 2006 của Chính phủ, trong danh mục “Thực vật rừng nguy
cấp, quý hiếm” thì các loài Bình vôi (Stephania sp.) được xếp trong nhóm IIA
(Thực vật rừng hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại) [6].
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì việc ứng dụng
nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi
cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều cao và
hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn.
Do đó, “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến

- Ý nghĩa trong thực tiễn:
Góp phần nhân nhanh tạo số lượng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo tồn
loài dược liệu quý theo Nghị định số 32/2006, NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006
của Chính phủ, đảm bảo chất lượng cung cấp nguyên liệu cho ngành y dược.


4
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về chi Bình vôi
2.1.1. Nguồn gốc
Chi Bình vôi (Stephania) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) có nguồn
gốc ở miền Đông, Nam Châu Á và Australia [17]. Ở Việt Nam, cây mọc hoang
tại nhiều vùng rừng núi, thường gặp trên các núi đá vôi.
2.1.2. Phân loại Chi
Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania
spp, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát
(Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê). Một số loài công bố ở Việt Nam:
Stephania glabra (Roxb) Miers, S. kuinanensis, S. Pierrei Diels, S. Sinica Diels,
S.rotunda Lour,…[46]. Trên thế giới, chi Bình vôi có hơn 40 loài. Ở Việt Nam,
chi Bình vôi có 13 loài với 4 loài đã có tên trong “Sách đỏ Việt Nam” [22].
Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2]
Giới (regnum)
Ngành
Phân lớp
Bộ (ordo)
Họ (familia)
Chi (genus)
Loài (Species)


Các loại Bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả ba miền Bắc,
Trung, Nam. Thường tập trung ở vùng núi đá vôi như Tuyên Quang, Cao Bằng,
Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa Vũng Tàu. Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo đặc tính sinh học.
Đặc điểm hình thái của một số loài Bình vôi [28], [47]:
Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một
nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm. Lá hình khiên, mọc cách. Phổ
biến ở các rừng thưa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,…
Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có kích
thước nhỏ hơn tất cả các loài khác. Hoa đực không có cánh hoa.


6
S. hainanensis H.S. Lo et Y. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu trắng
hoặc vàng nhạt.
S. cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác.
S. dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau
có màu tím hay tím hồng.
S. excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ
lệch một bên.
S. cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ.
S. sinica Diels: Giá noãn không có lỗ.
Stepphania viridiflavens H.S.Lo et Yang: Lá có phiến hình tam giác, cuống
lá bằng hoặc dài hơn phiến lá.
2.1.4. Giới thiệu về cây Bình vôi tím (Stephania rotunda Lour)
Cây Bình vôi tím được dân tộc Tày ở tỉnh Bắc Kạn thường gọi là “Cà tòm
đeng” có nghĩa là Bình vôi Đỏ, tên khoa học Stephania rotunada Lour, họ Tiết dê
Menispermaceae. Bình vôi tím là một loại dây leo giống như các loại Bình vôi khác.
Dưới gốc rễ hình thành củ, mọc bám vào vách đá. Củ Bình vôi tím nhỏ hơn Bình vôi
trắng. Vỏ củ màu nâu, dây màu tím phần thịt củ màu đỏ, nhựa dây cũng màu đỏ.
Phần dây leo và lá y hệt cây Bình vôi trắng, nhưng lá ngọn và lá non màu tím. Cây

dụng an thần, gây ngủ.


8
Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền Bình vôi được dùng dưới dạng
thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng. Liều
dùng: 3 - 6 g/ngày. Thuốc ngâm rượu gồm bột Bình vôi (1 phần) với rượu 40° (5
phần); mỗi ngày uống 5 - 15 ml [30]… Trong y học hiện đại, rotundin được dùng
làm thuốc an thần, giảm đau, điều trị một số trường hợp rối loạn tâm thần chức
năng, trạng thái căng thẳng thần kinh, mất ngủ do nguyên nhân tâm thần [11].
Các công trình khẳng định vai trò của Rotundin trong củ Bình vôi đã được
công bố như sau:
Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với GS.TS Đỗ Tất Lợi, Bonnet và
Bùi Đình Sang đã chiết xuất từ củ Bình vôi Stephania. Rotunda một hợp chất thuộc
nhóm alcaloid và đặt tên là rotundin. Năm 1965, chất này được xác định là L.
tetrahydropalmatin. Đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết xuất
được rotundin.
Năm 1999, tác giả Nguyễn Tiến Vững đã tổng kết các loài trong chi
Stephania trên thế giới gồm 164 hợp chất thuộc 8 nhóm hóa học khác nhau
(benzylisoquinolin, bis - benzylisoquinolin, protoberberin, aporphin, proaporphin,
hasubanan, morphinan, dibenzazonin) [45].
Năm 1999, theo Ngô Đại Quang tác đụng dược lý của rotundin đã được
nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc. Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và
suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một
số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và
an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp,
sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và
không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [17].
Phạm Thị Kim và cs bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện
Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tương

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và
nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức
nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau [15].
2.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
2.3.2.1 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu


10
tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm
của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân
hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi
gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [23].
2.3.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên
hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh
để thực hiện chức năng phân chia.
Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng.
2.4. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro
Trịnh Đình Đạt (2007) [7]: trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn sau:
2.4.1. Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục
đích là phải tạo được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Có thể vô trùng mẫu nuôi
cấy bằng một số chất có tác dụng diệt khuẩn như: CaOCl2, NaOCl, HgCl2,…[7].
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo: Tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao;

ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16 giờ chiếu
sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy,
người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân
cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo
thành cây từ phôi vô tính. Các nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết
hợp BA 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu
sau 80 ngày nuôi cấy [41].
2.4.4. Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra
rễ. Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh.
Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh
trưởng thuộc nhóm auxin, nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ


12
phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên
cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi. Theo kết quả nghiên cứu ảnh hưởng
của 2,4-D đến khả năng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh cho thấy nồng độ tốt nhất
cho sự hình thành rễ bất định sâm Ngọc Linh là 2,4-D 1,0 mg/l trong môi trường
MS bổ sung sucrose 50 mg/l [14].
2.4.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Là giai đoạn
chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó
phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất. Kết quả nghiên cứu khi chuyển
cây nghệ in vitro sang đất vườn và cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây vi giống
sinh trưởng và phát triển bình thường trong môi trường tự nhiên [37]. Cây con
tái sinh in vitro sang chậu nhựa có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ tỷ lệ 1:1 và
được làm thích nghi. Kết quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao [38].

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật, các thao tác với
mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Buồng cấy có hệ thống màng lọc
giúp lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt vi sinh vật
trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy. Để khử trùng dụng cụ
và môi trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương pháp: Khử trùng khô (bằng
nhiệt), khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc [26].
- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định
về ánh sáng và nhiệt độ [26].
2.5.3. Môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng
và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Thành
phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại
mẫu và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau:
2.5.4. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật


14
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.5.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a) Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo
điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều
kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [25].
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết
định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích
hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thường hay sử dụng
một số hoá chất như: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgCl2 0,1% … để khử trùng.

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi
cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật,
loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và
nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các
thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn
cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng. Ngoài ra, người ta còn bổ
sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,..) và một
số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…