HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------oOo-------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT
HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG
TẠI VIỆN HUYẾT HỌC-TRUYỀN MÁU TW
Sinh viên thực hiện

:

Lê Thị Bích Liên

Ngành

:

Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn

:

ThS. Trần Công Hoàng
TS. Dương Quốc Chính
Viện Huyết học-Truyền máu TW
TS. Nguyễn Hữu Đức

Em xin gửi lời cảm ơn với tình cảm chân thành đến tập thể cán bộ Khoa Di truyền
và Sinh học phân tử, đặc biệt là ThS.Vũ Thị Bích Hường, CN. Nguyễn Thị Hồng Vân và
CN. Kim Thị Ngọc Vân. Các anh chị đã luôn nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, thông cảm và
tạo điều kiện cho em được học tập, thực hành các kỹ năng thí nghiệm.
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm
khoa Công nghệ sinh học cùng toàn thể các thầy cô giáo đã truyền đạt cho em những kiến
thức vô cùng bổ ích và quý báu trong suốt bốn năm em học tập tại trường.
Cuối cùng cho em được gửi lời cảm ơn đến tất cả người thân trong gia đình, bạn bè
đã luôn dành tình cảm, ủng hộ, tạo điều kiện tốt nhất để em học tập và hoàn thành tốt
công việc trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Sinh viên

MỤC LỤC

3


DANH MỤC HÌNH

4


DANH MỤC BẢNG

5




1.2.

Mục đích và yêu cầu

1.2.1.

Mục đích
 Xây dựng được quy trình nuôi cấy dài hạn cho bệnh nhân ĐUTX nghiên cứu

tại NIHBT
 Bước đầu khảo sát các bất thường di truyền ở bệnh nhân ĐUTX.
1.2.2.

Yêu cầu
7


 Xây dựng quy trình nuôi cấy dài hạn để áp dụng thường quy cho bệnh nhân

đa u tuỷ xương tại NIHBT
 Thử nghiệm quy trình trên các mẫu nghiên cứu thu thập tại NIHBT
 Xác định tỷ lệ bệnh nhân có bất thường NST

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về bệnh lý Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM)
Đa u tủy xương là bệnh lý ác tính dòng tương bào (Plasma cells) đặc trưng bởi sự
tăng sinh và tích lũy bất thường các tế bào dòng tương bào trong tủy xương, thuộc tuỷ
xương với sự có mặt của tổn thương xương, tăng tương bào non, xuất hiện protein đơn



gặp là chuyển đoạn nhiễm sắc thể xảy ra ở vùng chuyển đổi Ig trên nhiễm sắc thể 14q32.
Đa số các đột biến gene đều do những sai sót xảy ra ở một trong ba quá trình biến
đổi gene đặc hiệu của tế bào B: quá trình tái tổ hợp ba đoạn gene VDJ, quá trình tái tổ hợp
chuyển đổi Ig hoặc đột biến soma quá mức. Những bất thường di truyền không phải đa
bội thường liên quan đến tiên lượng không tốt gồm các chuyển đoạn liên quan đến IgH,
nhân đoạn 1q, mất đoạn 1p và mất đoạn nhiễm sắc thể 13. Các gen liên quan đến các
chuyển đoạn IgH là MMSET và FGFR3 ở 4p16, cyclin D3 ở 6p21, cyclin D1 ở 11q13, cMAF ở 16q23, MAFA ở 8q24 và MAFB ở 20q11. Trong các nghiên cứu trung tâm, tần
suất của các chuyển đoạn gene IgH trong ĐUTX khoảng 55% - 70% (Avet-Loiseau H và
cộng sự, 2002). Cho đến nay, các nghiên cứu đã phát hiện ra 7 dạng đột biến gene chuỗi
nặng IgH, gặp trong khoảng 40% các trường hợp ĐUTX. Trong giai đoạn sớm của bệnh
thường gặp bốn dạng bất thường di truyền: các chuyển đoạn gene IgH chủ yếu do những
sai sót xảy ra trong quá trình tái tổ hợp chuyển đổi hoăc đột biến soma quá mức của các tế
bào B tại trung tâm mầm và được gọi là các chuyển đoạn IgH nguyên phát, đa bội với các
trisomie, mất đoạn nhiễm sắc thể 13, và rối loạn điều khiển gene cyclin D.
Các bất thường di truyền như đột biến N-RAS, K-RAS và FGFR3 trong những trường
hợp có chuyển đoạn t(4;14), các chuyển đoạn gene MYC, bất hoạt hoặc mất gen p53 là
những sự kiện xảy ra trong quá trình tiến triển của bệnh, và được gọi là chuyển đoạn IgH
thứ phát. Ngoài ra, một số các đột biến và chuyển đoạn liên quan đến hoạt động của
đường truyền tín hiệu tế bào NF-κB (NFκB pathway) chống lại sự chết theo chương trình
cũng đóng một vai trò quan trọng trong sự phát sinh bệnh lý ĐUTX.
Bảng 1.1. Một số bất thường di truyền trong ĐUTX
Bất thường di truyền

Tỷ lệ (%)

del(13q)

50%


cytokine và các yếu tố tăng trưởng có khả năng thúc đẩy quá trình tăng sinh mạch máu,
quá trình tồn tại, phân chia và tăng sinh cũng như phát triển khả năng kháng thuốc của các
tế bào ĐUTX. Một số cytokine như IL-1, IL-5, TNFα, TNF-β có khả năng làm tăng hoạt
động huỷ cốt bào đồng thời ức chế tạo cốt bào gây nên tình trạng tiêu xương, huỷ xương
và gãy xương bệnh lý.
2.4. Tiên lượng
Theo Durie - Salmon dựa trên sự kết hợp các yếu tố liên quan đến khối lượng u là
một cách đánh giá tiên lượng bệnh, tuy nhiên nhược điểm của phân loại giai đoạn theo hệ
thống này là sự phụ thuộc vào nhiều chỉ số, vốn phụ thuộc lẫn nhau, cũng như khó khăn
khi xác định chính xác số lượng xương bị tổn thương. Thời gian sống trung bình khoảng
60 tháng với BN giai đoạn IA; 14,5 tháng với những BN giai đoạn IIIB (có sự kết hợp với
giai đoạn suy thận)
Tiên lượng của BN ĐUTX phụ thuộc vào tuổi, mức độ hoạt động của BN, bất
thường, NST.

Nhiễm sắc thể
Bất thường nhiễm
sắt thể

Nguy cơ cao

Nguy cơ trung
bình

Nguy cơ thấp

-

del(17p)


t(6;14)

-

thêm 1p21
11


Sống trung bình

2 năm

5 năm

7-8 năm

% bệnh nhân

15%

20%

45%

(Theo Rajkumar SV. Multiple myeloma)
2.5. Nhiễm sắc thể
2.5.1. Khái niệm
Nhiễm sắc thể (NST) là cơ sở vật chất của hiện tượng di truyền ở cấp độ tế bào, nằm
trong nhân tế bào, cấu tạo chủ yếu từ DNA và protein histon, có khả năng tự nhân đôi và
biến đổi hình thái cấu trúc, có hoạt động mang tính chu kỳ trong quá trình phân bào.

a.

Tâm động (Centromere)

Tâm động là nơi 2 chromatid dính vào nhau, nơi để NST trượt trên thoi vô sắc trong
quá trình phân bào. Mỗi nhiễm sắc thể có một tâm động, là điểm thắt eo chia nhiễm sắc
thể thành 2 vai, chiều dài của 2 vai phụ thuộc vào vị trí tâm động.
Vai ngắn hơn gọi là vai p và vai dài hơn gọi là vai q. Người ta thành lập chỉ số tâm động
(centrmere index – Ic) để xác định vị trí của tâm động và kiểu hình NST.

Ic =
Dựa vào vị trí của tâm động có thể phân biệt hình thái các nhiễm sắc thể:
13


-

Tâm giữa (metacentric): tâm động ở chính giữa chia 2 vai bằng nhau.

-

Tâm cận giữa (submetacentric): tâm động ở gần chính giữa.

Tâm đầu (acrocentric): tâm động ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc, 2 vai
không bằng nhau.
-

Tâm mút (telocentric): tâm động nằm ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể.

-

146 cặp nucleotide với 1 vòng. Giữa hai nucleosome kế tiếp nhau là một đoạn ADN và 1
phân tử histon. Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép AND dài khoảng 60 nucleotid.
Chuỗi nucleosome tạo thành sợi cơ bản có chiều ngang 11 nm. Sợi cơ bản cuộn
xoắn bậc 2 tạo thành sợi nhiễm sắc có đường kính khoảng 30 nm gọi là sợi solenoid
(solenoid fiber).
Sợi nhiễm sắc lại xếp cuộn lần nữa tạo nên sợi có cấp độ đường kính khoảng 300
nm chứa các vòng bên (looped domains). Các sợi có đường kính 300 nm xoắn tiếp lại
thành cromatit có đường kính khoảng 700 nm. NST tại kỳ giữa của phân bào ở trạng thái
kép có 2 cromatit nên đường kính có thể đạt đến 1400nm. Với cấu trúc cuộn xoắn, chiều
dài NST có thể thu ngắn từ 15000 – 20000 lần. Sự thu gọn cấu trúc không gian của NST
thuận lợi cho sự phân li và tổ hợp các nhNST trong quá trình phân bào, đảm bào sự duy
trì ổn định cấu trúc qua các thế hệ tế bào và cơ thể. Ngoài protein histon, trong NST còn
có nhiều protein axit điều hòa hoạt động của gen.

15


Hình 2.5 Cấu trúc siêu hiển vi của nhiễm sắc thể
()

2.6. Kỹ thuật di truyền nuôi cấy dài hạn tế bào trong bệnh lý ĐUTX
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích công thức nhiễm sắc thể được ứng dụng đầu
tiên để phân tích các biến đổi di truyền trong bệnh ĐUTX. Việc phát hiện bộ nhiễm sắc
thể bất thường không những phản ánh sự tăng sinh cao mà còn cho thấy sự phát triển
không phụ thuộc vào các tế bào đệm tủy xương của các tế bào plamo ác tính. Tuy nhiên,
do đặc tính kém tăng sinh và dẫn đến chết theo chương trình của tương bào ác tính khi
tách ra khỏi vi môi trường tủy xương nên việc phân tích công thức nhiễm sắc thể tủy
xương thường cho kết quả bình thường (âm tính giả). Khi sử dụng kỹ thuật nuôi cấy dài
hạn có bổ sung các cytokine như IL-6, IL-4 và GM-CSF thì tỷ lệ phát hiện bất thường
nhiễm sắc thể được cải thiện và có thể lên đến 40%.

Bộ nhiễm sắc thể người có 46 NST, chia thành 23 cặp, gồm 22 cặp NST thường ký hiệu
từ 1 đến 22 và 1 cặp NST giới tính là XX ở nữ và XY ở nam.

(A)

(B)
Hình 2.7 46, XX (A); 46, XY (B)

17


Việc xác định và phân loại từng NST được thực hiện dựa trên các đặc điểm sau của mỗi
NST:
Chiều dài NST:

2.7.1.1.

Căn cứ xếp số thứ tự NST là theo nguyên tắc chiều dài giảm dần. Căn cứ vào chiều dài và
chỉ số tâm của NST (tỷ lệ phần trăm giữa độ dài cánh ngắn và độ dài toàn bộ NST), NST
chia thành 7 nhóm, kí hiệu là A, B, C, D, E, F và G:
-

Nhóm A (NST 1-3): NST kích thước lớn NHẤT, tâm giữa hoặc gần giữa.
Nhóm B (NST 4-5): kích thước lớn và không phân biệt được về chiều dài,
tâm gần giữa.
Nhóm C ( NST 6-12 và NST X) : kích thước trung bình, tâm giữa hoặc gần
giữa, khó phân biệt giữa các NST với nhau.
Nhóm D (13-15): kích thước trung bình, tâm đầu, có vệ tinh gắn vào cánh
ngắn.
Nhóm E ( 16-18): kích thước khá nhỏ, tâm giữa ( NST 16), tâm lệch ( NST

viết trước ( trừ xen đoạn hoặc chuyển đoạn liên quan tới ba NST trở lên).
2.7.2. Các bất thường NST và ký hiệu:
19


Đến nay có rất nhiều loại bất thường NST đã được mô tả, sau đây là một số kí hiệu bất
thường hay gặp.
del (deletion): mất đoạn
der (derivative chromosomes): hậu quả các bất thường tạo ra ( do chuyển đoạn, do cấu tạo
lại).
dup (duplication) : Nhân đoạn
i (isochromosome) và ider( isoderivative chromosomes) là đẳng NST: NST có 2 cánh
bằng nhau.
Ins (insertion) : chèn đoạn
inv (inversion): đảo đoạn có hai điểm gãy trên một NST và đoạn giữa đảo một vòng 180°
rồi nối trở lại.
mar ( marker chromosomes): chỉ một NST bất thường nhưng không rõ nguồn gốc các
phần của NST đó.
r (ring chromosome): NST hình nhẫn
ter : Đầu tận cùng (cũng có thể được viết pter hoặc qter để mô tả đầu tận cùng của nhánh
ngắn hoặc nhánh dài).
+ / - : Được đặt trước số NST chỉ thêm (+) hoặc bớt (-) NST đó. Nếu được đặt sau ký
hiệu cánh NST : tăng thêm hoặc giảm chiều dài cánh.
Ví dụ: 47, XY, +21: bộ NST nam, thừa NST 21.
46, XX, 5q-: bộ NST nữ có 46 NST, trong đó độ dài của cánh dài NST số 5 ngăn hơn
bình thường.
t : Chuyển đoạn (translocation): hai NST bị gãy và trao đổi phần không tâm cho nhau
ví dụ: t(8;21)(q22;q22): NST số 8 bị gãy ở vị trí 8q22, NST 21 bị gãy ở 21q22, hai đoạn
cuối rời nhau sẽ trao đổi với nhau (hình 3)



Máy ly tâm centrifuge

Eppendorf (Đức)

2

Cân phân tích

Mettler (Đức)

3

Tủ lạnh sâu -20°C, tủ lạnh 4°C

Sanyo (Nhật)

4

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Esco (Mỹ)

6

Ống Heparin Sodium

7

Chai nuôi cấy vô trùng

T

Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1

Môi trường RPMI 1640

Gibco

3

Huyết thanh bào thai bê

Gibco hoặc Biowest

4

Kháng sinh: Streptomicin – Penecillin

Gibco

Acid acetic 5 %

5
6

Demecolcine Solution 10µg / ml

Loại bỏ dịch nổi cách cặn 0,5 ml.
(3) Tái huyền dịch và cho 10 ml nhược trương, trộn nhẹ rồi ủ ở tủ ấm 37 0C trong 20

phút.

23


(4) Cho 0,5 – 1 ml dung dịch Cornoy II. Trộn nhẹ nhàng. Cho ở nhiệt độ 37 0C thêm 2 -

5 phút.
(5) Ly tâm ở 1000 vòng/10 phút lấy cặn, hút bỏ dịch nổi phía trên. Cho 8 – 10 ml

Cornoy II vào trộn đều. Và chờ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
(6) Ly tâm ở 1000 vòng/ 10 phút. Tái huyền dịch thích hợp.
(7) Lặp lại bước 6 đến khi cặn tế bào màu trắng.
 Nhỏ tiêu bản

-

Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn 100 0, chuyển
sang ngâm nước cất để lên giá lam, lau lam cho sạch.

-

Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để nghiêng 20 – 30 0
trên giấy thấm

-



Chuẩn bị hóa chất:
+) Cốc 1: pha trypsin 1g/50ml nước muối 0,9%
+) Cốc 2: pha 100ml huyết thanh bào thai bê 2%
+) Cốc 3: Nước muối 0,9%
24


+) Cốc 4: Nước muối 0,9%
+) Cốc 5: Pha Giêm sa 10% trong đệm Ph 6,8
+) Cốc 6: Đệm pH 6,8
-

Tiến hành kĩ thuật
+) Nhúng lam trong cốc 1 từ 3-4 phút
+) Chuyển lam sang cốc 2 trong 30 giây
+) Chuyển lam sang cốc 3 trong 15 giây
+) Chuyển lam sang cố 4 trong 15 giây
+) Chuyển lam sang cố 5 trong 10 phút
+) Chuyển lam sang cố 6 trong 15 giây
+) Rửa dưới vòi nước chảy
+) Sấy khô trong tủ sấy 60°C

3.4.4. Phân tích kết quả
Lam sau khi nhuộm Giêmsa sẽ được quét trên hệ thống Metafer, và phân
tích bằng phần mềm Ikaros (MetaSystems, Đức). Sau đó phân tích về số lượng và
cấu trúc NST. Đối với mỗi mẫu bệnh nhân, trung bình 20 tế bào được phân tích.

25