ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Thị Tâm Tiến

NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH
HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP. KCTC 9161

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỖ THỊ TUYÊN
PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2013
i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị
Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng
dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trƣởng khoa, Phụ
trách Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên đã hƣớng dẫn, quan tâm
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tâp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công
nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều
kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian cho tôi thực hiện đề tài.

1.4.1. Đại cƣơng về Actinoplanes ...............................................................................9
1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 .............................................................. 10
1.4.3. Ứng dụng Actinoplanes trong sản xuất acarbose ............................................11
1.5. Nghiên cứu hoạt chất acarbose trên thế giới ......................................................12
1.5.1. Nghiên cứu về sản xuất acarbose ....................................................................12
1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật ..........................................16
1.5.3. Các phƣơng pháp tinh sạch và thu nhận acarbose ..........................................17
1.5.4. Nghiên cứu sản xuất acarbose trong nƣớc ......................................................20
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................23
2.1. Vật liệu và hóa chất ............................................................................................23
2.1.1. Chủng giống ....................................................................................................23
2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................23
2.1.3. Môi trƣờng ......................................................................................................23
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ..........................................................................................24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................25
2.2.1. Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật .................................................................25

iii


2.2.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes
sp. KCTC 9161..........................................................................................................25
2.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy ..................................................................26
2.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy .................................26
2.2.5. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy .................................26
2.3. Gây đột biến bằng NTG .....................................................................................26
2.4. Sắc ký lớp mỏng TLC ........................................................................................27
2.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose .....................................27
2.6. Tách chiết và tinh sạch acarbose ........................................................................28
2.6.1. Tách chiết và tinh sạch sơ bộ ..........................................................................28

3.4.2.2. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose .............................. 51
3.4.3. Tinh sạch và thu nhận acarbose ......................................................................52
3.4.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase .......................................................................55
3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose ...................................................................56
3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose .............................................................59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................60
Kết luận .....................................................................................................................60
Kiến nghị ...................................................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................61
PHỤ LỤC .................................................................. Error! Bookmark not defined.

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ............................................23
Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng ......................................24
Bảng 2.3. Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu ........................................................25
Bảng 3.1. Khối lƣợng chế phẩm qua các bƣớc tinh sạch acarbose ...........................55

vi


MỞ ĐẦU
Đái tháo đƣờng (ĐTĐ) hiện nay là một vấn đề sức khỏe mang tính chất toàn cầu,
ảnh hƣởng đến nhiều ngƣời, nhất là trong độ tuổi lao động trên toàn thế giới. Theo
thông báo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ƣớc tính mỗi năm trên thế giới có 3,4
triệu ngƣời chết do đái tháo đƣờng, trong đó 80% các ca tử vong xảy ra ở những
nƣớc đang phát triển. Hiện nay trên thế giới có 347 triệu ngƣời mắc bệnh đái tháo
đƣờng, có 90% số ca mắc đái tháo đƣờng type 2. Chi phí về y tế dành cho căn bệnh

nhiều, một số thảo dƣợc quý hiếm ngày càng khan hiếm. Do đó, việc sản xuất các
hoạt chất bằng sử dụng nguồn vi sinh vật đang là một hƣớng nghiên cứu mới và cấp
thiết. Việc sản xuất acarbose từ xạ khuẩn Actinoplanes sẽ mang lại hiệu quả kinh tế,
sản xuất nhanh, chủ động, giá thành thấp do sử dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nâng cao khả năng sinh
tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC
9161” trong khuân khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose
làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đƣờng” do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ
nhiệm với các mục tiêu: (1) Tối ƣu đƣợc môi trƣờng lên men thu nhận hoạt chất
acarbose từ Actinoplanes sp. KCTC 9161 đạt năng xuất cao; (2) Nâng cao khả năng
sản xuất hoạt chất acarbose bằng phƣơng pháp gây đột biến; (3) Xây dựng đƣợc quy
trình tách chiết, tinh sạch acarbose.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về acarbose
Acarbose là một pseudo-oligosacharide có tên hóa học O{4,6-dideoxy-4[1S(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl]-amino-α-D-glucopyranosyl}-(1→4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-D-glucopyranose. Acarbose có
cấu trúc lõi acarviosyl gồm một nửa valienamine liên kết với 4-amino-4,6dideoxyglucose qua liên kết N-glycosidic (Hình 1.1). Acarviosyl liên kết với phân
tử maltose qua liên kết α-1,4 tạo nên phân tử acarbose hoàn chỉnh (Truscheit, et al.,
1981, Wehmeier, 2003). Acarbose thành phẩm có dạng bột màu trắng, trọng lƣợng
phân tử 645,6, có thể hòa tan trong nƣớc, trong ethanol, methanol, có pKa 5,1 và
công thức phân tử C25H43NO18.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose

1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose
Acarbose là một chất ức chế cạnh tranh. Khả năng ức chế cạnh tranh của
acarbose có đƣợc là nhờ vào cấu tạo phân tử của nó. Acarbose có cấu trúc và kích


Đào thải: acarbose hoạt tính đƣợc sử dụng trong huyết tƣơng khoảng 2 giờ,
không có hiện tƣợng tích lũy khi uống 3 lần mỗi ngày. 51% liều uống đƣợc đào thải
qua phân dƣới dạng acarbose không hấp thu trong vòng 96 giờ. Khoảng 34% liều
uống đào thải qua thận dƣới dạng chất chuyển hóa hấp thu. Dƣới 2% liều uống đào
thải qua nƣớc tiểu dƣới dạng acarbose và chất chuyển hóa hoạt động (Công báo số
119, Bộ Y tế, 2012).
1.3. Vai trò của acarbose
1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đường
Bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ) là một nhóm các bệnh chuyển hóa đƣợc đặc trƣng
bởi tăng đƣờng máu mãn tính do hậu quả của sự thiếu hụt hoặc giảm hoạt động của
insulin hoặc cả hai trong cơ thể ngƣời bệnh. Trên thế giới, hàng năm căn bệnh ĐTĐ
tiêu tốn hơn 132 tỷ USD. Ƣớc tính năm 2010, có trên 221 triệu ngƣời mắc bệnh
ĐTĐ, năm 2025 sẽ lên tới trên 400 triệu ngƣời bệnh.
Trong đái tháo đƣờng, ĐTĐ type 2 là dạng ĐTĐ thƣờng gặp nhất. Thông
thƣờng, với bệnh ĐTĐ type 2, trong cơ thể vẫn còn sản xuất insulin, nhƣng các tế
bào không thể sử dụng nó. Điều này đƣợc gọi là đề kháng insulin. Theo thời gian,
đƣờng huyết sẽ tăng cao trong máu. Béo phì và ít vận động sẽ làm tăng nguy cơ
phát triển bệnh ĐTĐ type 2 (Công Sơn, Thế Ân, 2013).
Các loại thuốc dùng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2: Các dẫn xuất của
sulfonylurea (glibenclamid, glipizid, gliclazid), có tác dụng hạ đƣờng huyết do ngăn
cản tế bào tuyến tụy tạo ra glucagon, kích thích tế bào beta ở tụy tiết ra insulin. Các
loại thuốc hạ đƣờng máu đang đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ĐTĐ gồm: Nhóm
thuốc cải thiện sự nhạy cảm của insulin (glitazon, benfluorex) làm hạ đƣờng huyết,
nhờ làm giảm đề kháng insulin, có tác dụng điều hòa chuyển hóa lipid. Thuốc chữa
bệnh ĐTĐ có nguồn từ thực vật chuyển gene, insulin “thực vật”. Gene tổng hợp
insulin đƣợc cấy vào cây hoa rum để tổng hợp insulin; thuốc chữa bệnh ĐTĐ có
nguồn gốc từ thảo mộc, chế phẩm dikamo đƣợc phối chế từ cao quả mƣớp đắng và
cao quả nhàu dùng trong điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Quả mƣớp đắng (Monordica


từ 6-8 giờ và đƣợc chuyển hóa hoàn toàn trong ruột ngƣời. Các sản phẩm chuyển
hóa chủ yếu là dẫn xuất của 4-methylpyrogallol không độc. Một phần nhỏ đƣợc hấp
thụ vào máu sẽ đƣợc bài tiết qua đƣờng nƣớc tiểu (Lê Văn Chi, 2004).

6


Hiện nay, acarbose đƣợc nhiều công ty dƣợc phẩm sản xuất và bán ở 110 nƣớc
trên thế giới với nhiều tên thƣơng mại khác nhau nhƣ: glucobay® (Châu Âu và
Trung Quốc), precose® (Mỹ), glucor® (Pháp) và prandase® (Canada). Ở nƣớc ta
Công ty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang sản xuất viên nén có tên thƣơng mại glumeca,
glucobay với hàm lƣợng 100 mg acarbose.
Thuốc acarbose đƣợc dùng đơn hoặc có thể kết hợp với các thuốc trị liệu khác
nhƣ sulfonylurea, metformin hoặc insulin để điều trị bệnh ĐTĐ type 2. Khi dùng
liệu pháp một thuốc, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin
glycosylate (0,6 đến 1%), giảm hemoglobin glycosylate tƣơng quan với giảm nguy
cơ biến chứng vi mạch ở ngƣời đái tháo đƣờng. Trái với thuốc đái tháo đƣờng
sulfonylurea, acarbose không làm tăng tiết insulin. Acarbose cũng không gây giảm
glucose máu lúc đói khi dùng đơn trị liệu ở ngƣời. Khi dùng điều trị phối hợp với
thuốc sulfonylurea chúng sẽ có tác dụng cộng hợp do cơ chế tác dụng của hai loại
thuốc này khác nhau. Do đó, acarbose không gây tăng cân và cũng không làm giảm
tác dụng hƣớng đến insulin của sulfonylurea.
Hiệu quả điều trị ĐTĐ type 2 bằng acarbose đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu:
Mori và cs (2011) đã đánh giá ảnh hƣởng của acarbose đến sự biến động glucose ở
bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng cách giám sát glucose liên tục (continuous glucose
monitoring, CGM). CGM đƣợc thực hiện trong 4 ngày, với hàm lƣợng 300 mg
acarbose/ngày. Tổng cộng 10 bệnh nhân (5 nam và 5 nữ), với độ tuổi trung bình
63,1±12,1 tuổi, chỉ số khối cơ thể 22,6±5,4 kg/m và glycohemoglobin là 9,9±1,9%.
Trong thời gian điều trị với acarbose, ba giá trị trung bình (hàm lƣợng glucose trong
máu, SD của glucose máu, biên độ đƣờng huyết giao động bất thƣờng) đều giảm

trong máu và đến hệ vi khuẩn trong dạ cỏ bò sữa Holstein (với chế độ ăn 0,75 g
acarbose mỗi ngày). Kết quả cho thấy, việc bổ sung chế độ ăn uống chứa acarbose
trong nuôi bò sữa cao sản xuất khẩu có hiệu quả hơn nhƣ: giảm thời gian mà pH dạ
cỏ đạt tối ƣu, không có tác động tiêu cực đến quá trình lên men ở dạ cỏ và chuyển
hóa máu (Blanch, et al., 2010).

8


1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose
1.4.1. Đại cương về Actinoplanes
Chi Actinoplanes đƣợc công bố đầu tiên bởi Couch năm 1950 với loài chuẩn là
Actinoplanes philippinensis (Couch, 1950). Chúng sống chủ yếu trong đất và trong
nƣớc, phát triển dƣới dạng sợi, phân nhánh, không đứt đoạn, gram dƣơng, rất ít sợi
khí sinh hoặc không có, tạo nhiều loại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử chứa
trong túi bào tử, sinh trên cuống bào tử hoặc không có, rất ít khi trong thạch. Bào tử
hình cầu hoặc que ngắn, sắp xếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử,
bào tử có thể di động khi túi bào tử nứt ra (Nguyễn Lân Dũng, 2006). Thành tế bào
có

chứa

meso-2,6-diaminopimelic

acid,

LL-2,6-diaminopimelic

acid,


Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Lớp: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Micromonosporaceae
Chi: Actinoplanes
Loài: Actinoplanes sp.
Đặc điểm hình thái: Actinoplanes sp. KCTC 9161 gram dƣơng có cấu tạo dạng
sợi, các sợi liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành các khuẩn lạc riêng rẽ, màu vàng
cam, ở giữa khuẩn lạc phồng lên phát triển các túi bào tử chứa nhiều bào tử. Bào tử
có thể di động. Toàn bộ hệ sợi của xạ khuẩn chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không
có vách ngăn ngang, nhân đơn giản, không có màng nhân (Nguyễn Lân Dũng,
2006). Thành tế bào có chứa meso-2,6-diaminopimelic acid,

LL-2,6-diaminopimelic

acid, hydroxydiaminopimelic acid và glycine, tỷ lệ GC trong ADN là 71,32%.
Xạ khuẩn sinh sản sinh dƣỡng bằng bào tử, phát triển mạnh trong điều kiện 2528oC, phát triển dƣới dạng sợi, phân nhánh, ƣa ẩm.
Đặc điểm nuôi cấy: Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trƣờng hiếu khí, nhiệt
độ nuôi cấy tối ƣu là 25oC, pH thích hợp trong nuôi cấy với pH 6-8. Trên môi
trƣờng thạch đĩa, khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 có dạng hình tròn,

10


bề mặt nhẵn, có tâm phồng lên, phát triển chậm. Khuẩn lạc có màu cam đƣờng kính
1-2 mm. Sau 7-10 ngày bề mặt nhăn lan rộng (Hình 1.3). Trên môi trƣờng thạch
nghiêng, chủng mọc dày tạo thành vệt, màu cam đậm, rìa gợn sóng. Trên môi
trƣờng lỏng, chủng phát triển tốt, hình thành các hạt pellet hình tròn, không tan khi
lắc lên, màu vàng cam, một số sắc tố màu cam tiết ra môi trƣờng tạo môi trƣờng có

Acarbose đƣợc phát hiện đầu tiên trong hỗn hợp các oligosaccharide từ dịch lên
men chủng Actinoplanes sp. SE50 với hoạt tính ức chế α-glucosidase (Schmidet, et
al., 1997). Năm 1979, Frommer và cs lên men chủng Actinoplanes sp. SE50/110 đạt
năng suất lên tới 1 g/l (Frommer, et al., 1979). Nhiều nghiên cứu về nâng cao năng
suất sinh tổng hợp acarbose từ Actinoplanes đã đƣợc công bố chủ yếu về tối ƣu các
điều kiện lên men, tối ƣu các thành phần môi trƣờng, lên men bổ sung thêm một số
chất kích thích và sử dụng các chủng đột biến.
Choi và Shin (2003) đã nuôi lên men chủng Actinoplanes sp. CKD485-16 (một
dòng đột biến của chủng Actinoplanes sp. SE50/110) với năng suất đạt 2,3 g/l
acarbose và 0,6 g/l thành phần C sau khi kết thúc lên men. Thành phần môi trƣờng
lên men gồm (%): 3 glucose; 14 maltose; 4 bột đậu tƣơng; 0,7 cao nấm men; 0,3
NZ-amin; 0,3 CaCO3; 0,06 K2HPO4; nuôi lên men 192 giờ, 200 vòng/phút, 28oC.
Theo tác giả, maltose, bán phân tử của acarbose cần đƣợc duy trì ở nồng độ cao
trong môi trƣờng trong suốt quá trình lên men để sinh tổng hợp acarbose có hiệu
quả. Trong quá trình lên men, thành phần C cũng đƣợc sinh ra do sự chuyển hóa của
acarbose trong pha nghỉ của tế bào. Việc ức chế sự chuyển hóa từ acarbose cũng đã
đƣợc nghiên cứu để giảm bớt thành phần C, tăng hàm lƣợng acarbose.

12


Valinenamine ở nồng độ 10 mM ức chế mạnh (giảm hơn 90%) việc chuyển hóa
sang thành phần C (Choi, Shin, 2003). Việc thêm Valienamine vào môi trƣờng để
giảm bớt sự chuyển hóa acarbose sang thành phần C cũng đã đƣợc Xue và cs (2013)
nghiên cứu. Theo kết quả nghiên cứu, việc thêm 20 mg/l valienamine trong quá
trình lên men đã tăng hàm lƣợng acarbose từ 3560 mg/l lên 4950 mg/l và giảm
thành phần C từ 289 mg/l xuống còn 107 mg/l (Xue, et al., 2013).
Để nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose, Wei và cs (2010) đã tối ƣu môi
trƣờng lên men cho chủng Actinoplanes sp. A56 sinh tổng hợp acarbose. Thực hiện
phƣơng pháp tối ƣu toán học để nghiên cứu ảnh hƣởng của glucose, maltose, dịch

trƣởng của chủng nhƣng cho sản lƣợng acarbose vừa phải, ngƣợc lại bột đậu tƣơng
tăng cƣờng sản xuất acarbose và là nguồn dinh dƣỡng có giá trị. Monosodium
glutamate là nguồn nitrogen đầu tiên trong liên kết N-glycosidic của acarbose (Lee,
Egelkrout, 1998), nồng độ monosodium glutamate tăng lên 5 g/l cho năng suất sinh
tổng hợp acarbose cao nhất đạt 3892 mg/l. Nồng độ 50 g/l maltose và 30 g/l glucose
thích hợp cho sản xuất acarbose từ chủng A. utahensis ZJB-08196. Glucose kích
thích sự tăng trƣởng của chủng. Maltose nâng cao năng suất sinh acarbose, maltose
là phân tử tiền thân kết hợp trực tiếp với acarviose tạo nên phân tử acarbose (Lee, et
al., 1997). Glycerol cũng ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp acarbose, glycerol ảnh
hƣởng trực tiếp đến áp suất thẩm thấu trong môi trƣờng, áp suất thẩm thấu sẽ ảnh
hƣởng trực tiếp đến hoạt động của tế bào do đó sẽ ảnh hƣởng đến quá trình sinh
tổng hợp ra các hợp chất khác nhau trong quá trình lên men. Nồng độ glycerol tại 5
g/l cho áp suất thẩm thấu môi trƣờng là 591 mOsm/kg sinh lƣợng acarbose cao nhất
đạt 4288 mg/l. Tăng áp suất thẩm thấu môi trƣờng sẽ giúp đẩy mạnh sự chuyển dịch
của phân tử maltose dẫn đến tăng năng suất acarbose (Wang, et al., 2011). Điều này
cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Choi và Shin nhận đƣợc, hàm lƣợng
acarbose tỷ lệ thuận với áp suất thẩm thấu của môi trƣờng nuôi cấy và hàm lƣợng
acarbose đạt cao nhất tại 500 mOsm/kg (Choi, Shin, 2003).
Bên cạnh việc tối ƣu nguồn carbon, nguồn nitrogen và áp suất thẩm thấu trong
môi trƣờng Wang và cs còn tối ƣu một số thông số kỹ thuật nhƣ: pH môi trƣờng, tốc
độ lắc, nhiệt độ và nguồn giống, môi trƣờng đạt kết quả tối ƣu nhất cho sinh tổng

14


hợp acarbose từ chủng A. utahensis ZJB-08196 là pH 7,0; 180 vòng/phút; 27oC; 168
giờ lên men và giống đƣợc tiếp sau 60 giờ nhân giống (Wang, et al., 2011).
Wang và cs (2012) đã thành công trong nghiên cứu sự cần thiết của áp suất thẩm
thấu của môi trƣờng lên men đối với quá trình sinh tổng hợp acarbose từ chủng A.
utahensis ZJB-08196. Theo đó, môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung cơ chất liên tục

acarbose nhất là trong giai đoạn cuối của quá trình lên men. Quá trình lên men giai
đoạn đầu có 10 g/l glucose và 60 g/l maltose bổ sung thêm 100 μmol/l SAM sau 12
giờ, 8 g/l glucose sau mỗi 24 giờ và 20 g/l maltose sau 96 giờ cho năng suất 6,113
mg/l acarbose sau 192 giờ (Sun, et al., 2012).
Xue và cs (2013) cũng tăng cƣờng sản xuất acarbose và giảm bớt sự tạo thành
hợp chất C từ chủng đột biến A. utahensis ZJB-08196 bằng việc bổ sung thêm
validamine trong quá trình lên men. Kết quả cho thấy, quá trình lên men có bổ sung
20 mg/l validamine ngay từ đầu và bổ sung thêm 5 ml hỗn hợp gồm (g/l) : 6
glucose, 14 maltose và 9 bột đậu tƣơng, sau 72 và 96 giờ, đạt năng suất 6606 mg/l
acarbose và 212 mg/l thành phần C sau 168 giờ (Xue, et al., 2013). Validamine là
một chất ức chế glucosyltransferase. Nó ngăn cản sự biến đổi liên kết α,α-1,4 trong
nửa maltose của acarbose thành liên kết α,α-1,1 trong nửa trehalose của hợp chất C,
do đó làm giảm sự tạo thành hợp chất C. Theo một cách khác, validamine nhƣ một
chất hoạt hóa theo hƣớng tạo thành acarbose (Mahmud, 2003).
1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật
Để nâng cao tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật, nhiều
phƣơng pháp gây đột biến đã đƣợc sử dụng nhằm tác động vào vật chất di truyền
làm thay đổi các đặc tính sinh học của vi sinh vật, đặc biệt là gây đột biến trên
Actinoplanes để nâng cao khả năng sinh tổng hợp acarbose.
Lee và cs (2008) đã nghiên cứu 3 cụm gene Tre X-Y-Z, TpS1 và TreS sinh tổng
hợp trehalose từ chủng Actinoplanes sp. SN223/29, đã xác định đƣợc 5 gene sinh
tổng hợp trehalose. Chúng đƣợc nhân dòng và biểu hiện trong E.coli BL21 sử dụng
vector pET19b. Kết quả nghiên cứu cho thấy, gene TreY đã sản xuất thành phần C
từ acarbose bởi enzyme isomerase, nhƣng gene TreS thì không. Từ nghiên cứu này

16


cho thấy rằng khi gây đột biến gene TreY có thể tăng cƣờng sản xuất acarbose bởi
việc ngăn chặn sản xuất thành phần C (Lee, et al., 2008).

Lange và cs (1987) nghiên cứu sử dụng các hợp chất polymer để tinh sạch
acarbose. Việc sử dụng chất trao đổi cation dạng acid mạnh nhƣ lewatit TSW 40
hoặc chất trao đổi cation dowex 50 WX4 dùng nƣớc để đẩy các chất không hấp thụ
ra khỏi cột, sau đó thu acarbose bằng HCl 0,025N. Các phân đoạn chứa acarbose
đƣợc đƣa lên cột trao đổi anion lewatit MP62 và rửa bằng nƣớc để trung hòa dịch
acarbose. Kết quả thu đƣợc acarbose với độ tinh sạch đạt 89,5% (Lange,
Rauenbusch, 1987)
Rauenbusch (1990) tiếp tục tinh sạch acarbose từ dịch acarbose có độ tinh sạch
78-88% đƣợc ông và cs nghiên cứu trƣớc đó (Lange, Rauenbusch, 1987). Ông sử
dụng thêm chất trao đổi cation dạng acid yếu hydrophilic nhƣ: CM-sephadex C25,
CM-sepharose Cl 6B, carboxymethylcellulose CM52 trong khoảng pH 4,0-5,5 để
gắn kết các chất màu và các hợp chất giống đƣờng. Kết quả đã thu đƣợc acarbose
với độ tinh sạch đạt 98% hoặc hơn nữa (Rauenbush, 1990).
Keri và cs (2002) đã tinh sạch đƣợc acarbose từ dịch lên men với độ tinh sạch
lên tới 99%. Dịch lên men đƣợc acid hóa tới pH 2,0-2,2 bằng acid sulfuric và lọc
thu dịch trong, dịch trong đƣợc hấp thụ trong nhựa trao đổi anion dạng acetate hoặc
tartrate và đƣợc rửa với nƣớc. Dịch rửa tiếp tục đƣợc hấp thụ trong nhựa trao đổi
cation amberlite 252H dạng acid và rửa bằng HCl 0,02 M. Sau đó dịch rửa đƣợc
loại bỏ ion Cl- bằng nhựa trao đổi anion dạng base, cô đặc dịch thu đƣợc và kết tủa
acarbose bằng ethanol, lọc và làm khô. Các tinh thể acarbose thu đƣợc có độ tinh
sạch đạt 99% (Keri, Deak, 2002).
Hong và cs (2003) đã tinh sạch acarbose từ dịch lên men chỉ sử dụng 3 loại nhựa
trao đổi qua 3 bƣớc tinh sạch đã thu đƣợc acarbose có độ tinh sạch đạt 98%. Bƣớc
1, dịch lọc chứa acarbose (pH 5) đƣợc tinh sạch sơ bộ nhờ một trong các cột hấp thụ
lewatit EP63, amberlite XAD 1600T, diaion SP850, cột đƣợc rửa với nƣớc ở nhiệt
độ phòng và thu acarbose bằng acetone 10%. Phân đoạn chính thu đƣợc acarbose có
độ tinh sạch trên 50%. Bƣớc 2, sử dụng cột trao đổi anion amberlite IRA67, dịch
rửa chứa acarbose bƣớc 1 đƣợc đƣa lên cột và rửa bằng nƣớc cất để loại màu và

18

2,25 N sau khi phần lớn ion Ca2+ đã đƣợc đẩy hết ra trƣớc. Kết quả sử dụng nhựa

19