TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG
CÁC LỚP CHẤT LIPID TRONG LIPID
TỒNG MỘT SÓ LOÀI THÂN MỀM
BIỂN VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên n g àn h : H óa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học
THS. ĐẶNG THỊ PHƯƠNG LY

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN

Khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu thành phàn, hàm lượng các lớp chất
lipid trong lipid tổng một số loài thân mềm biển Việt Nam” được thực hiện tại
phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Họp chất thiên nhiên - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Em xin chân thành cảm ơn GS. TS. Phạm Quốc Long và Ban lãnh đạo
Viện Hóa học các Họp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị
của viện để hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Đặng Thị Phương Ly, cùng
các anh (chị) phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Họp chất thiên

2.2. Dụng cụ, hóa chất ................................................................................. 18
2.2.1. Dụng c ụ ........................................................................................... 18
2.2.2. Hóa c h ấ t.......................................................................................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 18
2.3.1. Phương pháp chiết lipid tổ n g ..........................................................18
2.3.2. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất
ừong lipid tổ n g .......................................................................................... 19
2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết lipid
tô n g ............................................................................................................ 20
a. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào.........................................................20

b. Đánh giá hoạt tính kháng v s v kiểm đ ịn h .......................................... 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LU Ậ N ..................................................21


3.1. Hàm lượng lipid tổ n g ............................................................................21
3.2. Phân tích thành phàn và hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng ..... 24
3.3. Thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết lipid tổng 16 mẫu thân
mềm nghiên c ứ u ...........................................................................................30
KẾT LUẬN.................................................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 33
PHỤ LỤC....................................................................................................... 35


DANH MUC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1.Các lớp chất lipid trong sinh vật biển............................................. 12
Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và hình ảnh thân mềm nghiên cứu................. 16
Bảng 3.1. Hàm lượng lipid tổng của 16 mẫu thân mềm................................ 21
Bảng 3.2. Thành phần và hàm hượng các lớp chất lipid trong lipid tổng

PL

Phospholipid

ST

Sterol

FFA

Free Fatty Acid

TG

Triacylglycerol

MADG

Monoalkyldiacylglycerol

HC

Hydrocarbon

WE

Wax Ester

Hep


Biển Việt Nam có trên 3.000 hòn đảo, phân bố tập trung ở ven bờ Tây Bắc
Vịnh Bắc Bộ (Quảng Ninh - Hải Phòng). Một số đảo ven bờ miền Trung và
Tây Nam bộ và hai quàn đảo ngoài khoi là quần đảo Hoàng Sa thuộc thành
phố Đà Nằng và quần đảo Trường Sa thuộc tỉnh Khánh Hòa. Bên cạnh đó, địa
hình nước ta phức tạp chạy dọc ven biển và 112 cửa sông chính đổ trực tiếp ra
biển điều này đã tạo nhiều đầm, phá, cửa sông, vũng vịnh, các ao đầm thuộc
vùng triều. Đây là tiềm năng rất lớn cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản ở
vùng ven biển Việt Nam nói chung và động vật thân mềm biển nói riêng.
Theo Jorgen Hyllenberg (2003), trong hệ sinh thái biển có khoảng 2200 loài
động vật thân mềm thuộc 700 giống của 200 họ [1]. Trong đó, hiện nay ở
nước ta có khoảng hơn 25 loài khác nhau có thể đưa vào nuôi trồng ở các
vùng ven biển. Hàng năm, sản lượng nuôi trồng và đánh bắt loài này lên đến
hàng chục nghìn tấn và đã đóng góp một phần ngân sách không nhỏ cho
ngành thủy sản nói riêng và nền kinh tế quốc gia nói chung. Vì vậy việc nuôi
trồng và phát triển loài động vật nhuyễn thể rất được quan tâm và đầu tư theo
quy hoạch của bộ Thủy sản [2].
Ngành thân mềm không những giữ vai trò quan trọng trong các hệ sinh
thái mà còn có giá trị kỉnh tế, y học, dược học.... Trên 80 loài có giá trị kinh
tế cao, chủ yếu tập chung ở họ Sò (Arcidae), Ngao (Vereridae), Phi
(Psammobiidae), Bào ngư (Halitidae), Hàu (Ostreidae), Vẹm, Tu hài..., đây
cũng là những đối tượng được nuôi trồng rộng rãi phục vụ nhu cầu trong nước
và xuất khẩu [ 1].
Thành phần hóa học của thân mềm có chứa nhiều họp chất có hoạt tính

1


sinh học cao, trong đó lipid là một thành phàn quan trọng. Việc nghiên cứu
thành phần hóa học của thân mềm sẽ tạo điều kiện cho việc định hướng khai
thác và sử dụng các nguồn hoạt chất sinh học, ứng dụng vào các sản phẩm

trên bề mặt cơ thể. Hình thành cơ quan lưỡi gai (lưỡi bào) đặc trưng để nạo và
cuốn thức ăn. cấu trúc cơ thể được chia thảnh 3 phần là đầu, thân và chân,
mức độ phát triển của các phần tuỳ thuộc vào từng nhóm khác nhau. Hầu hết
cơ thể động vật Thân mềm có đối xứng 2 bên, riêng nhóm Chân bụng (ốc) có
hiện tượng mất đối xứng [4].

Hình 1.1. Sơ đồ tỗ chức cơ thể của các nhổm Thân mềm (Theo storer)
Từ ừái sang phải: lớp v ỏ một tấm (Mônplacophora); Song kinh
(Amphineura); Chân thùy (Scaphopoda); Chân rìu (Pelecypoda); Chân bụng
(Gastropoda) và Chân đầu (Cephalopoda). ANTERIOR: Phần trước cơ thể;
POSTERIOR: Phần sau cơ thể; M: Miệng; A: Hậu môn

3


Cơ thể động vật Thân mềm thường được chia thành 3 phần là phần đàu,
phần thân và phần chân. Lớp biểu bì của phần thân hình thành nên áo (hay
được gọi là vạt áo). Từ ngoài vào ữong, áo gồm có 3 lớp rõ ràng là biểu bì
ngoài, lớp mô liên kết và trong cùng là lớp biểu bì trong. Biểu bì của áo (lớp
tế bào ngoài) hình thành nên vỏ bọc cơ thể với độ dày và cấu trúc khác nhau.
Ngoài cùng của vỏ là lớp sừng (conchyolin = periostracum) mỏng, tiếp đến là
lóp caxin gồm các tỉnh thể hình lăng trụ khá dày, trong cùng là lóp xà cừ
mỏng hơn. Khoảng trống giữa vạt áo và nội quan được gọi là xoang áo, trong
đó thường có cơ quan hô hấp, cơ quan cảm giác, lỗ sinh dục, bài tiết, hậu
môn... (hình 1.2). Các cơ quan này được gọi chung là phức họp cơ quan áo
của động vật thân mềm.

1
2 'ĩ Vỏ


hoàn chỉnh. Ở mực tim có một tâm thất và 2 hay 4 tâm nhĩ). Hệ bài tiết là
dạng biến đổi của hậu đơn thận. Hệ thần kỉnh theo kiểu bậc thang kép (ở
nhổm thân mềm cổ) hay dạng hạch phân tán. Hệ tiêu hoá có cơ quan đặc
trưng là lưỡi gai (radula). Cơ quan hô hấp là lược mang (ctenidia) [1]
Lưỡi gai (lưỡi bào - radula) (hình 1.3) là cấu trúc đặc trưng của động vật
Thân mềm, cấu tạo là một khối kitin hay prôtein lát thành dưới của thực quản,
mặt trên lưỡi gai có nhiều dãy răng kitin. Phần gốc của lưỡi gai có các tế bào
sinh ra phần lưỡi gai bị bào mòn do qúa trình tiêu hoá. Hoạt động của lưỡi gai
được điều khiển bởi các chùm cơ co và duỗi và lưỡi gai có thể thò ra ngoài
cạo và cuốn thức ăn là thực vật vào miệng. Sự sắp xếp của các gai trên lưỡi
gai là đặc điểm chẩn loại quan trọng [1],

5


¿SS&

¿ísìi

ổ s ẩ i £253 ứ s ã
A

Hình 1.3. Một số kiểu lưỡi bào (radula) của Chân bụng (Theo Hickman)
A. Busycon carỉca; B. Murex regius; c. Cypraea tigris; D. Elysia
viridis; E. Scaphander
1.2. Phân loại động vật Thân mềm
Động vật Thân mềm khá phong phú về thành phần loài và nơi sống.
Hiện nay đã biết khoảng 130.000 loài, trong số đó có 35.000 loài đã hoá
thạch. Phần lớn sống ở biển, một số sống ở nước ngọt. Phân loại thân mềm
chủ yếu dựa vào sơ đồ cấu tạo cơ thể, sự thích ứng với các lối sống khác

tổng số loài của động vật Thân mềm (có khoảng 90.000 loài). Hiện nay đã
biết khoảng 75.000 loài đang sống và 15.000 loài đã hoá thạch. Phần lớn động
vật Chân bụng sống ở biển, một số sống ở nước ngọt, ở cạn hay chuyển sang
đời sống ký sinh [4].
Lớp Chân rìu (Pelecypoda) = Hai mảnh vỏ (Bivalvia) = Mang tấm
(Lamellibrachia) số loài hiện sống ( 8.000 loài) ít hơn nhiều so với các loài
hoá thạch ( 12.000 loài), trong đó chủ yếu sống ở biển, còn ở nước ngọt chỉ
chiếm (10 - 15%) [4].
Lớp Chân thùy = Chân búa = Chân xẻng (Scapoda) hoá thạch tìm thấy
của các đại diện thuộc lớp này xuất hiện muộn hơn (khoảng 450 triệu năm), lớp
này có khoảng 300 loài. Cơ thể đối xứng 2 bên, vỏ dạng ống nhỏ dần về phía
một đàu và thủng cả 2 đầu. Chân thùy sống chui rúc trong bùn [4].
Lóp Chân đầu (Cephalopoda) có khoảng 6.000 hiện sống và 7.000 loài
hoá thạch. Phần lớn chân đầu bơi giỏi, sống ở biển. Cơ thể có đối xứng hai
bên [4].

7


1.3. Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học động vật thân
mềm
Đã có một số nghiên cứu về thành phần hóa học và các chất hoạt tính sinh
học phân lập từ đối tượng thân mềm. Berg, Krzynowek, Alatalo và Wiggin
(1985) nghiên cứu thành phần sterol và axit béo của loài Codakỉa orbicularis
cho thấy trong thịt của chúng chứa 74,8% nước, 1,1% mỡ, 2,9% tro. Hàm
lượng cholesterol là 20,6 mg/100g, chiếm 44,5% tổng của sterol [10].
Theo Đông y, thịt của các loài thân mềm có tính giãn mạch, làm mạch tuần
hoàn ngoại vi, phổi và tạng phủ, làm tăng sức dẻo dai của gân cốt cơ bắp, kích
hoạt các chức năng sinh sản, giải độc, giải nhiệt, giải khát, có lợi cho tóc, móng
và sinh dục... Ngoài giá trị hàm lượng đạm cao trong mô thịt với thành phần các

dịch chiết từ một số loài động vật thân mềm hai mảnh vỏ đặc biệt là vẹm
xanh, có hoạt tính cao chống lại một phổ rộng các virut (kể cả vimt cúm gia
cầm), vi khuẩn và protozoa. Các phân đoạn polypeptit đặc biệt này được đặc
trưng bởi khả năng liên kết đặc thù sinh học với axit sialic khi có mặt các ion
Ca2+, ít nhất với một phân tử đường amin trong nhóm axit sialic. Axit béo
không no (PUFA) được phát hiện mới đây từ các loài vẹm xanh có hoạt tính
sinh học mạnh hơn 300 lần eicosapentaenoic axit (EPA), đặc biệt hoạt tính
chống viêm nhiễm. Các PUFA được tìm thấy trong dịch chiết vẹm xanh thể
hiện hoạt tính kháng viêm nhiễm rất cao và không có phản ứng phụ mặc dù
đã được thử nghiệm trên hàng ngàn bệnh nhân.
1.4. Lipid, các ỉớp chất lipid
Lipid (có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp cổ - hipos nghĩa là mỡ hay là chất
béo) là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào các cơ thể
sống, trong động vật, thực vật và vi sinh vật. Chúng có thành phàn hoá học và
cấu tạo khác nhau nhưng có tính chất chung là không hoà tan trong nước mà
thường hoà tan trong các dung môi hữu cơ như: ete, clorofom, benzen, ete
dầu hỏa... [9]. Lipid là hợp phàn cấu tạo quan trọng của các màng sinh học tế

9


bào, là nguồn cung cấp năng lượng (37,6.106 J/kg), nguồn cung cấp các
vitamin A, D, E, F, K và F cho cơ thể sống [9].
Trong tự nhiên, những hợp chất thuộc về lớp chất lipid tồn tại rất đa dạng
như: các hydrocacbon bậc cao, các ancol, các aldehyde, các axit béo, các dẫn
xuất của chúng như glyceride, sáp, phospholipid, glucolipid, sulíolipid... [12].
Lipid có nhiều kiểu cấu trúc khác nhau, tuy nhiên cấu tạo lipid thường có
chung một nguyên tắc ừong thành phần phân tử lipid bao gồm hai phần: đầu
phân cực ưa nước và đuôi hydrocacbon kị nước (hình 1.4). Hai phần của phân
tử lipid được liên kết với nhau bởi mắt xích liên kết ở giữa. Thường người ta

2

H

3 CH2---- OCOR3
3 c h 2oh

Glyxerol (1)

Triglyxeride (2)

Hình 1.5. Cấu tạo lipid trên cơ sở glyxerol
Nhóm chất lipid khác cũng phân bố rộng rãi trong lớp màng tế bào, đặc
biệt ở não là các sphingolipid, chúng được cấu tạo trên cơ sở liên kết nhóm
amin của sphingosine (3) với các axit béo. Các sphingolipid đóng vai trò quan
trọng trong việc truyền dẫn tín hiệu và nhận biết tế bào, chúng có tác động
đặc biệt vào mô thần kinh. Một trong những dẫn xuất phổ biến trong động vật
biển là ceramide (4) và có công thức cấu tạo mô tả ở hình 1.6 [9].
C H oO H

,,2

1

H«

-Ó —

nh


và trong dịch chiết có thể chứa nhiều lớp chất với độ phân cực khác nhau, bao
gồm các họp chất có nguồn gốc từ cơ thể sinh vật, và cả những họp chất hình
thành do những tác động của các yếu tố bên ngoài. Nhà khoa học Christopher

11


c . Parrish (2013) đã chia các lớp chất lipid trong sinh vật biển thành 3 nhóm:
nhóm A là những lớp chất ít phân cực nhất như các hydrocacbon, các ester
đơn giản (sáp, ester của sterol....); nhóm B gồm các lớp chất có độ phân cực
trung bình như các ester phức tạp (triacylglycerol, diacylaglycerol...), các axit
béo tự do, các họp chất rượu, sterol; nhóm c gồm các lớp chất phân cực nhất
và phức tạp nhất như các pigment, monoacylglycerol, glycolipid,
phospholipid [ 12] (bảng 1. 1)
Bảng l.l.C ác lớp chất lipid trong sinh vật biển
Tên họp chất đại

Lớp chất lỉpỉd

Công thức cấu tạo

diên
■

Aliphatic
hydrocarbon

V X A A A A A A A /

n-nonadecane

Methyl palmitate

í?
oII
h2c'

Triacylglycerol

1 oII

Tripalmitin

II
Ö

12


O
II

A x it b é o tự do

P a lm itic acid

R ư ợ u m ạ c h dài

P h y to l

S terol

sinh vật biển khác như san hô, da gai..., các lớp chất lipid chính được xác
định đó là hydrocacbon, sáp, monoalkyldiacylglycerol, triacylglycerol, sterol,
lipid phân cực (glycolipid, phospholipid)
1.5. Phu’O'ng pháp xác định hàm lượng các lóp chất lỉpỉd sử dụng phần
mềm xử lí hình ảnh SORBFIL
Sử dụng phần mềm xử lý hình ảnh để đo mật độ quang học là một
trong những phưomg pháp thuận tiện nhất để tính toán định lượng đối với sắc
ký lớp mỏng (TLC). Để thực hiện, người ta sử dụng phép đo mật độ trên bản
mỏng TLC đã được scan bằng một chùm tia sáng có bước sóng cụ thể để tính
toán theo hình ảnh hiển thị của sắc ký đồ. Ưu điểm của phương pháp này
chính là thao tác không quá phức tạp và tốc độ xử lý nhanh.
Phần mềm Sorbfil (được sản xuất bởi Công ty Sorbpolimer) có thể xử
lý được bất kỳ một TLC nào, nhìn thấy trong ánh sáng ban ngày hoặc ánh
sáng tia cực tím với bước sóng 254 hoặc 365 nm. Hình ảnh của bản mỏng thu
được sau khi scan hoặc chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số sẽ được chuyển ra
máy tính. Căn cứ vào hình ảnh thu được, phép đo mật độ sẽ tính toán kích
thước và cường độ của những vệt màu và sẽ thể hiện lượng chất tại vết đó.
Chương trình Sorbfil sẽ tính toán thành phần tỉ lệ phần trăm của các chất
trong hỗn họp và nồng độ các chất ữong mẫu. Khả năng tái hiện của phép đo
là 98%, trong khi độ lệch chuẩn tương đối của khu vực sắc ký nhỏ hơn 4%,
không vượt quá giá trị cho phép. Các kết quả tính toán (đồ thị, bảng), văn bản
ghi chú, thậm chí cả hình ảnh sắc kí phổ, có thể được lưu lại và in ra trong
báo cáo.
Tính đơn giản và độ chính xác cao, khả năng tái phân tích khi cần thiết
và kết quả đáng tin cậy của phần mềm này giúp nó có thể được sử dụng trong
các phòng thí nghiệm một cách phổ biến, mà không đòi hỏi phải thay đổi

14



Nam

Nhiêt
• đô•
Ảnh mẫu

noi thu
mẫu (°C)

Ostreidae

1 TM-1

Ostrea cucullata

Hầu

19.5

Gọ Tu mit

22

Ốc nhảy

20

Ốc mút

21

Fam. Veneridae
5

TM-5

Venus (Periglypta)

Con Sang

Ü /í

20

‘'ó. • ’ ^

lacerata (Hanley)
Fam. Veneridae

6

TM-6

Venus (Periglypta)

Con Sang

rM1"

21



Annadara

Sô long

binakayanensis
(Faustino)

m

21

Arcidae

10
TM-10

Trisidos semitorta

Sô

20

Biêp quat

20

(Lamarck)
Propeamussidae



(Bruguiere)

1

Veneridae
14 TM-14

Radytapes variegata

Hến

(Sowerby)