BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRẦN THỊ LUYẾN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRÊN
CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE TÍCH HỢP HỆ VI LƯU

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học
Mã số: 62520301

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà Nội – 2017


Công trình được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học:
Hướng dẫn 1: PGS.TS. Mai Anh Tuấn
Hướng dẫn 2: PGS. TS. Huỳnh Đăng Chính

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ……


không đánh dấu nhằm phát hiện các thành phần sinh học.
Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu của luận án là nghiên cứu thực nghiệm. Cách tiếp cận
trong quá trình nghiên cứu là từ các kết quả thực nghiệm, kết hợp với lý thuyết và các
tài liệu tham khảo, giải thích, so sánh, đánh giá và tối ưu qui trình thực nghiệm.
Nội dung của luận án:
Để giải quyết được mục tiêu của đề tài, luận án tập trung nghiên cứu 3 nội dung:
Nội dung nghiên cứu 1: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở
dây nano polypyrrole. Trong nội dung nghiên cứu 1, mục tiêu của NCS là làm quen
với các kỹ thuật điện hóa được thực hiện trong một hệ đo mở, các phép đo điện hóa
không sử dụng các điện cực thương mại mà trên cơ sở các điện cực tự thiết kế và phát
triển, vật liệu thể mềm cấu trúc dây nano được chế tạo giữ vai trò làm lớp vật liệu
trung gian giữa bề mặt cảm biến và bộ chuyển đổi, giúp nâng cao hiệu quả cố định
thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, DNA được lựa chọn làm đối
tượng đo vì DNA có độ bền, độ ổn định cao và dễ đặt mua. Nội dung nghiên cứu 1
bao gồm: nghiên cứu tổng hợp dây nano polypyrrole trên điện cực Pt sử dụng kỹ
thuật điện hóa nhằm biến tính bề mặt cảm biến; nghiên cứu cố định DNA dò lên bề
mặt cảm biến trên cơ sở dây nano polypyrrole; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa
DNA dò – DNA đích của cảm biến DNA điện hóa đã chế tạo.
1


Nội dung nghiên cứu 2: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ
vi lưu. Phát triển từ các kết quả đã đạt được trong nội dung nghiên cứu 1 với các phép
đo điện hóa được thực hiện trong hệ đo mở, đối với nội dung nghiên cứu 2, luận án
tập trung nghiên cứu các tính chất điện hóa diễn ra khi thu nhỏ bình điện hóa. Việc
thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng mẫu tiêu thụ có ý nghĩa rất quan trọng trong phân
tích y sinh vì các mẫu phân tích có thể là mẫu máu, vi khuẩn, virus… Nội dung
nghiên cứu 2 bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo và gắn kết hệ ba điện cực tích hợp
Pt và vi kênh PDMS; nghiên cứu tổng hợp điện hóa dây nano polypyrrole bên trong

truyền (DNA) và kháng thể của vật chủ, sử dụng kỹ thuật đo lường điện hóa. Để phát
triển cảm biến sinh học điện hóa, trước tiên, luận án đã tập trung nghiên cứu thiết kế
và chế tạo các điện cực khác với điện cực truyền thống. Bề mặt điện cực sau đó được
biến tính trên cơ sở lớp vật liệu trung gian với cấu trúc nano. Trên bề mặt phân cách
giữa dung dịch chứa mẫu phân tích và màng sinh học có cấu trúc nano, các tính chất
hóa lý diễn ra có phần khác so với những tính chất đó ở các điện cực truyền thống.
2


Các kỹ thuật quét thế vòng, thế tĩnh, tổng trở và kỹ thuật đo vi sai đã được triển khai
để nghiên cứu các tính chất điện hóa tại đây. Đối với việc phát triển cảm biến sinh
học điện hóa ứng dụng trong phát hiện các thành phần sinh học, vấn đề giảm thể tích
mẫu phân tích, thu nhỏ hệ thống phân tích có ý nghĩa quan trọng. Luận án đã tập
trung nghiên cứu các kỹ thuật đo lường điện hóa trong một vi bình phản ứng có thể
tích rất nhỏ thay vì thực hiện các phép đo trong hệ mở.
Những đóng góp mới của luận án:
Một trong những đóng góp mới của luận án là đã tổng hợp được vật liệu polime
dẫn polypyrrole (PPy) với cấu trúc dây nano nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm
biến, nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học. Dây nano PPy được
tổng hợp trực tiếp trên điện cực làm việc (WE), sử dụng kỹ thuật polime hóa điện
hóa, khắc phục được tình trạng vật liệu PPy được tạo thành dưới dạng đảo, có cấu
trúc hoa súp lơ. Đặc biệt, việc tổng hợp thành công vật liệu PPy có cấu trúc nano tại
chính xác một vị trí mong muốn bên trong vi bình phản ứng (thể tích 4 µl) là một
thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm
được. Hiện nay, số lượng công trình công bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp cấu
trúc nano bên trong hệ tích hợp vẫn còn rất hạn chế.
Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực
tiếp từ trứng gà làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch cũng là một trong những
đóng góp mới của luận án.
Luận án cũng đã góp phần quan trọng trong việc thiết kế, chế tạo và gắn kết bình

1.1.2.2 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa
Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là một
thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định
lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực
tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer). Chất được gắn trên bộ phận
chuyển đổi được gọi là “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích
trong mẫu được gọi là “phần tử đích”. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là
dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên- kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai
hóa DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym- cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các
phản ứng đặc hiệu này,
phần tử nhận biết sinh
học giữ vai trò dò tìm đối
tượng đích trong mẫu
phân tích và phần tử
chuyển đổi giữ vai trò
chuyển đổi tương tác sinh
học thành tín hiệu điện
hóa, quang, nhiệt… sau
đó đưa qua bộ phận xử lý
tín hiệu và hiển thị kết
quả đo, hình 1.3.
Hình 1.3: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học

Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang,
chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi
cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có
nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng y sinh. Nguyên lý hoạt động
của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa
phần tử nhận biết sinh học và phần tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu

sinh học điện hóa và hệ vi lưu được coi là một bước đệm để tiến tới chế tạo các bộ vi
phân tích điện hóa cầm tay, giữ vai trò quan trọng trong việc thực hiện các nhiệm vụ
phân tích lưu động. Tuy nhiên, hiện tại, vấn đề này còn tương đối mới tại Việt Nam.
Vấn đề thứ tư được tập trung hướng đến là nghiên cứu xây dựng qui trình đo
lường điện hóa nhằm phát hiện các thành phần sinh học (phần tử đích) trong mẫu
phân tích, trên cơ sở đó phát triển các thiết bị điện hóa phù hợp phục vụ cho việc đo
lường, phân tích điện hóa sử dụng cảm biến sinh học.
Để giải quyết được những vấn đề nêu trên, đòi hỏi yếu tố liên ngành ở các nhóm
nghiên cứu: hóa học, vật lý, điện tử, sinh học, khoa học vật liệu... Trên thế giới,
những nhóm nghiên cứu liên ngành đang là xu hướng được ưu tiên trong nghiên cứu,
phát triển và chế tạo hệ đo điện hóa sử dụng cảm biến miễn dịch hoặc cảm biến
DNA.
1.2. Biến tính bề mặt cảm biến sinh học điện hóa sử dụng dây nano polypyrrole
Cảm biến DNA điện hóa hoạt động dựa trên kết quả khảo sát những thay đổi về đặc
tính điện hóa khi xuất hiện sự lai hóa đặc hiệu giữa các chuỗi DNA dò và DNA đích.
Khi nồng độ chuỗi DNA rất nhỏ, tương tác giữa hai chuỗi DNA chỉ làm thay đổi một
phần rất nhỏ tín hiệu điện hóa trên bề mặt của màng sinh học (nơi gắn kết DNA dò),
vì vậy hiệu quả truyền tải thông tin điện hóa từ bề mặt cảm biến đến bộ chuyển đổi
quyết định độ nhạy của cảm biến DNA. Trong đó, kỹ thuật cố định DNA dò lên trên
bề mặt cảm biến là một yếu tố quan trọng góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu.
Hiện tại chưa có kỹ thuật ổn định để cố định trực tiếp chuỗi DNA dò lên trên bề mặt
của điện cực kim loại. Nói cách khác, người ta thường phải biến tính bề mặt điện cực
bằng cách sử dụng một lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt cảm biến và chuỗi DNA.
Lớp vật liệu trung gian này cần đáp ứng những yêu cầu sau: 1) bám dính tốt với cả bề
mặt bộ chuyển đổi và sợi DNA; 2) có độ tương thích sinh học, không làm thay đổi
cấu trúc và biến tính sợi DNA; và 3) làm tăng hiệu quả quá trình truyền tải thông tin
từ tương tác sinh học xuống bộ chuyển đổi. Vật liệu polime dẫn, như polypyrrole
(PPy), polythiophene và polyanilin thường được lựa chọn trong chế tạo cảm biến sinh
5


tương đối mới tại Việt Nam. Bên cạnh đó, trong các công trình công bố quốc tế, cảm
biến điện hóa tích hợp hệ vi lưu đã được ứng dụng để định lượng thuốc, sự thay đổi
hình dạng tế bào, kim loại nặng, và glucose trong dung dịch. Tuy nhiên, hiện nay,
trên thế giới, số lượng công trình công bố liên quan đến việc tổng hợp các vật liệu cấu
trúc nano bên trong hệ tích hợp vẫn còn rất hạn chế. Trong luận án này, việc tích hợp
cảm biến sinh học điện hóa và hệ vi lưu, tiếp sau đó là qui trình tổng hợp vật liệu cấu
trúc nano bên trong vi bình phản ứng nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm biến sẽ
được tập trung hướng đến. Việc tích hợp cảm biến sinh học điện hóa với vi bình phản
ứng trong phát hiện các phần tử sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…)
được cho là không những sẽ giúp thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu
thụ mà còn góp phần nâng cao tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu, cải thiện độ chính xác của hệ
thống.
1.5. Kỹ thuật điện hóa trong nhận biết các thành phần sinh học
Trong các kỹ thuật điện hóa ứng dụng trong nhận biết các phần tử sinh học (DNA,
kháng nguyên/kháng thể), mỗi kỹ thuật đều có những ưu điểm riêng. Ưu điểm của
6


phương pháp EIS (phương pháp phổ tổng trở điện hóa) là trong suốt quá trình đo chỉ
cần đưa một điện áp kích thích nhỏ vào hệ nên hoạt tính của các thành phần sinh học
không bị ảnh hưởng và hệ vẫn được giữ ở trạng thái cân bằng. Hơn nữa phương pháp
EIS có độ ổn định cao, cho phép phân tích không chỉ toàn bộ quá trình mà cả các giai
đoạn riêng rẽ, diễn ra đồng thời hoặc song song trong hệ nghiên cứu. Ưu điểm của
phương pháp đo vi sai là có thể loa ̣i bỏ sự nhiễu của môi trường, do đó cho kết quả
đo chính xác ngay cả khi tín hiệu đo nhỏ hoặc bị nhiễu bởi các nguồn nhiễu khác. Ưu
điểm của phương pháp CV (phương pháp quét thế vòng) là do phương pháp này được
sử dụng rộng rãi trong phân tích điện hóa nói chung nên các thiết bị điện hóa được sử
dụng cho phép đo CV là phổ biến. Hơn nữa, khi mục tiêu xa hơn được hướng đến là
nghiên cứu thiết kế, chế tạo bộ vi phân tích điện hóa ứng dụng trong y sinh (sự kết
hợp của đầu đo tích hợp, vi bình phản ứng và thiết bị điện hóa cầm tay) thì phương

Hình 2.1: (A): quy trình chế tạo rút gọn;
(B): điện cực dùng làm cảm biến

2.2.3. Tổng hợp dây nano PPy sử dụng kỹ thuật điện hóa
Quá trình tổng hợp dây nano PPy được thực hiện trên hệ điện hóa AutoLab
PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan. Bình điện hóa sử dụng điện cực Pt tích hợp (bao
7


gồm điện cực làm việc và điện cực đối) và điện cực so sánh Ag/AgCl trong dung dịch
KCl bão hòa. Dây nano PPy được tổng hợp trong môi trường trung tính, pH = 7,4 với
vai trò của đệm muối phốt phát (PBS). Dung dịch điện li được pha chế gồm: monome
pyrrole, gelatin 0,08% về khối lượng, LiClO4 0,1 M và đệm PBS. Dây nano PPy
được tổng hợp trực tiếp lên điện cực Pt (WE) nhờ kỹ thuật điện hóa: áp điện thế
không đổi 0,75V lên điện cực làm việc và đo dòng phản hồi I theo thời gian, gelatin
được sử dụng với vai trò làm khuôn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano
PPy.
2.2.4. Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs
Chuỗi đơn DNA dò được cố định trực tiếp lên bề mặt màng cấu tạo bởi các dây
nano PPy bằng phương pháp hấp phụ. 10 μl dung dịch DNA dò nồng độ 10 μM được
nhỏ đều, phủ lên điện cực Pt-PPy NWs trong 2 giờ. Sau đó điện cực được rửa sạch
nhiều lần bằng nước khử ion nhằm loại bỏ các sợi DNA dò không liên kết hoặc liên
kết yếu với dây nano PPy. Cuối cùng, cảm biến được làm khô tự nhiên và bảo quản ở
4 oC.
2.2.5. Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò
Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò tại các nồng độ DNA
đích khác nhau được khảo sát sử dụng hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco
Chemie, Hà Lan. Dòng xoay chiều đặt vào có biên độ Eac = 10 mV, tần số biến thiên f
= 0,1 Hz đến 104 Hz, điện áp một chiều không đổi Edc = 0,25 V so với Ag/AgCl trong
dung dịch KCl bão hòa.

Pt với cấu trúc hoa súp lơ (cauliflower), hình 2.9c. Với mục đích tổng hợp dây nano
PPy trên điện cực Pt, phản ứng polime
hóa cần được thực hiện trong điều kiện
nồng độ Py ban đầu thấp hơn. Khi nồng
độ ban đầu của Py là 0,1 M, dây nano
PPy có kích thước đồng đều hơn và phân
bố đồng đều hơn trên bề mặt cảm biến,
hình 2.9b, so với khi nồng độ ban đầu
của Py là 0,05 M, hình 2.9a. Với kích
thước đồng đều và sự phân bố đồng đều
của dây nano PPy trên bề mặt cảm biến,
quá trình cố định phần tử cảm nhận sinh
học lên trên dây nano PPy sẽ thuận lợi
Hình 2.9: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng
hơn, vì vậy giá trị nồng độ Py ban đầu
hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt
0,1 M được lựa chọn trong các quy trình
gelatin và Py: (a): 0,05 M; (b): 0,1 M và (c):
tổng hợp dây nano PPy định hướng ứng
0.15 M. Thời gian tổng hợp PPy là 300 s.
dụng trong chế tạo cảm biến sinh học.
2.3.1.5. Thời gian polime hóa
Khi thời gian phản ứng là 150 giây, dây nano PPy bắt đầu hình thành trên bề mặt
điện cực Pt, hình 2.10a. Khi thời gian phản ứng là 200 giây, một số dây nano PPy
phát triển dài thêm, tuy nhiên, một số dây nano PPy vẫn ở trạng thái như khi bắt đầu
hình thành, hình 2.10b. Khi tăng thời gian phản ứng lên 300 giây, dây nano PPy tiếp
tục phát triển dài thêm với kích thước khá đồng đều, đường kính dây khoảng 65 nm
đến 105 nm, chiều dài dây cỡ micromet
và dây phân bố đồng đều trên bề mặt điện
cực Pt, hình 2.10c. Tuy nhiên, khi tiếp tục

được xác định bởi các
pic 1045 cm-1 và 2375
cm-1. Các pic tại 1682
cm-1 và 2923 cm-1 đặc
trưng cho gelatin và pic
tại 963 cm-1 đặc trưng

cho nhóm ClO4 . Kết quả
phân tích phổ FT-IR cho
thấy, dây nano PPy đã
Hình 2.11: Phổ FT-IR của dây nano PPy được tổng hợp trong
được hình thành trên điện
LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M
cực Pt (WE). Bên cạnh
dây nano PPy, xuất hiện thêm các sản phẩm phụ như gelatin, photphat và peclorat.
Các hợp chất này được cho là các chất pha tạp, dùng để biến tính dây nano PPy thu
được. Polime dẫn biến tính được nhận định là có độ dẫn điện cao hơn so với polime
dẫn thuần [53,118] và đặc tính này phù hợp với định hướng ứng dụng dây nano PPy
trong cảm biến sinh học với vai trò làm lớp vật liệu trung gian tăng cường hiệu quả
truyền tải tín hiệu từ tương tác sinh học đến bộ chuyển đổi.
Tóm lại, dây nano PPy đã được tổng hợp trực tiếp trên điện cực Pt sử dụng kỹ
thuật điện hóa phân cực thế tĩnh, giá trị điện thế 0,75V được giữ không đổi và gelatin
được sử dụng với vai trò làm khuôn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano
PPy. Khi nồng độ ban đầu của monome Py là 0,1 M và thời gian thực hiện phản ứng
polime hóa là 300 giây, dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt với kích thước
đồng đều và sự phân bố đồng đều. So sánh với vật liệu PPy cấu trúc hoa súp lơ, vật
liệu PPy cấu trúc dây nano với diện tích bề mặt riêng lớn hơn được cho là sẽ giúp
nâng cao hiệu quả cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, góp
phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định của cảm biến DNA.
2.3.2. Đặc trưng tín hiệu cố định DNA dò

2.14b-h, tăng lên đáng kể so với
tổng trở của cảm biến khi không có
DNA đích, hình 2.14a. Các chuỗi
DNA chứa các nhóm photphat tích
điện âm, trong khi đó, PPy là chất
bán dẫn loại p với hạt tải là các lỗ
trống. Khi có DNA đích trong dung
dịch điện li, hiện tượng lai hóa
DNA diễn ra trên bề mặt dây nano
PPy dẫn đến làm giảm mật độ hạt
tải của PPy, do đó làm giảm độ dẫn
Hình 2.14: Phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWsvà làm tăng tổng trở của cảm biến.
DNA dò tại các nồng độ DNA đích khác nhau
Từ sự thay đổi phổ tổng trở, có thể
nhận thấy, tại nồng độ DNA đích là 10 pM tín hiệu điện hóa được tạo ra bởi sự lai
hóa DNA đã được thiết bị đo thu nhận và hiển thị. Tín hiệu này càng thể hiện rõ (có
giá trị lớn hơn) khi tiếp tục tăng nồng độ DNA đích.
Đường phổ tổng trở Zim vs. Zre thực nghiệm có thể được mô phỏng bằng một mạch
điện tương đương trong đó mỗi phần tử của mạch đại diện cho một tính chất điện của
hệ điện hóa. Mạch tương đương
Randles, thường được sử dụng để
mô phỏng hệ điện hóa trong dung
dịch điện li, gồm các thành phần sau:
(1) điện trở dung dịch Rdd; (2) trở
Hình 2.15: Mô hình mạch tương đương Randles
kháng Warburg ZW; (3) điện dung
được sử dụng trong luận án
lớp kép Clk ; và (4) điện trở chuyển
điện tích Rct. Trong mô hình mạch tương đương Randles, phần tử pha QCPE có thể
được sử dụng để hiệu chỉnh và thay thế cho phần tử điện dung lớp kép C lk, hình 2.15.


317

23.63

1.19

0.82

2.84

0 pM

295.3

32.01

0.74

0.90

2.43

10 pM

282.1

32.25

0.78


219.3

32.57

0.92

0.89

1.71

100 nM

214.4

34.66

0.92

0.89

1.63

300 nM

207.6

36.24

0.92

Dây nano PPy được tổng hợp trực tiếp trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa
phân cực thế tĩnh, điện thế 0,75V được giữ không đổi và gelatin được sử dụng với vai
trò làm khuôn mềm định hướng cho sự phát triển của dây nano PPy. Khi nồng độ ban
đầu của monome Py là 0,1 M và thời gian thực hiện phản ứng polime hóa là 300 giây,
dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt với kích thước đồng đều và sự phân bố
đồng đều.
Chuỗi đơn DNA dò được cố định trực tiếp trên bề mặt cảm biến sinh học trên cơ
sở dây nano PPy. Hiện tượng lai hóa DNA được khảo sát sử dụng phương pháp phổ
tổng trở điện hóa. Cảm biến DNA có giới hạn phát hiện 10 pM tại 25 oC.
12


3. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TÍCH
HỢP HỆ VI LƯU
3.1. Mở đầu
Phát triển từ các kết quả đã đạt được trong nội dung nghiên cứu 1 với các phép đo
điện hóa được thực hiện trong hệ đo mở, trong nội dung nghiên cứu 2, mục đích tích
hợp cảm biến DNA điện hóa với một bình phản ứng kích thước nhỏ có khả năng ghép
nối với mạch đo nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, đồng thời nâng cao tỷ lệ tín
hiệu/nhiễu sẽ được tập trung hướng đến. Việc thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng
mẫu tiêu thụ có ý nghĩa rất quan trọng trong phân tích y sinh vì các mẫu phân tích có
thể là mẫu máu, vi khuẩn, virus… Cũng trong nội dung nghiên cứu 2, dây nano PPy
sẽ được tổng hợp bên trong vi bình phản ứng nhằm biến tính bề mặt cảm biến (đã tích
hợp với hệ vi lưu) thay vì tổng hợp trong hệ mở như nội dung nghiên cứu 1. Cấu trúc
dây nano của PPy và hệ ba điện cực tích hợp với vi bình phản ứng được hi vọng sẽ
cải thiện các đặc tính của cảm biến sinh học điện hóa, đồ ng thời giúp thu nhỏ hê ̣
thố ng phân tích.
3.2. Thực nghiệm
3.2.2. Hệ ba điện cực tích hợp kết nối với bình phản ứng mini
Chế tạo hệ ba điện cực tích hợp:

Dây nano PPy được tổng hợp trong vi biǹ h phản ứng sử dụng kỹ thuật điện hóa
phân cực thế tĩnh (PS-Potentiostatic): điện thế phân cực không đổi là 0,5 V trong thời
gian phản ứng là 1200 giây và quét thế vòng tuầ n hoàn: điêṇ áp từ 0 đế n 0,6 V, 6
vòng, tố c đô ̣ quét 25 mV/s. Các bước xử lý bề mặt điện cực và pha chế dung dịch
điện li được thực hiện tương tự như đã trình bày trong phần 2.2.3.
3.2.4. Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs
Quy trình cố định DNA dò lên điện cực Pt-PPy NWs được thực hiện tương tự như
đã trình bày trong phần 2.2.4. Tuy nhiên, vì hệ điện cực Pt tích hợp đã được gắn kết
với vi kênh PDMS nên dung dịch DNA dò cần được bơm vào vi bình phản ứng thay
vì thực hiện việc nhỏ phủ trực tiếp lên bề mặt điện cực làm việc (WE).
3.2.5. Phát hiêṇ tín hiêụ lai hoá DNA sử du ̣ng Lock-in Amplifier
Tín hiệu dòng xoay chiề u với tần số 10 kHz và biên độ 100 mV từ nguồ n phát
điện của thiế t bi ̣Lock-in Amplifier SR830 được đặt vào hai điện cực giống nhau tích
hợp trong các bình vi phản ứng. Trong đó, bề mặt của một điện cực được cố định
DNA dò/PPy NWs (đóng vai trò điện cực làm việc) và bề mặt của điện cực còn lại
được biế n tin
́ h chỉ với PPy NWs (đóng vai trò điê ̣n cực so sánh).

Hình 3.6: Hê ̣ đo vi sai sử dụng Lock-in Amplifier SR830 DSP

Khi 4 µl dung dich
̣ DNA đích (chuỗi bổ sung) được bơm vào biǹ h vi phản ứng,
hiêṇ tươ ̣ng lai hoá DNA sẽ diễn ra trên bề mă ̣t điện cực làm việc (đã đươ ̣c cố định
DNA dò), dẫn đến sự thay đổi điêṇ tích của màng dẫn, do đó làm chuyể n dich
̣ tín
hiệu đầu ra. Tín hiệu đầu ra từ điện cực làm việc và điện cực so sánh của cảm biến đi
qua hai điện trở 1 k, được thu thập trên kênh A và kênh B của Lock-in, sau đó sẽ
được xử lý và hiển thị kết quả trên máy tính.
3.3. Kết quả và thảo luâ ̣n
3.3.1. Kế t quả chế ta ̣o hê ̣ vi kênh tích hơ ̣p với điêṇ cư ̣c

bật như thời gian gắn kết nhanh và chất lượng gắn kết tốt, ổn định qua nhiều thí
nghiệm. PDMS là hợp chất polime với các mắt xích cơ bản -O-Si(CH3)2-. Khi vi kênh
PDMS được xử lý trong buồng plasma oxy, các nhóm -CH3 có thể được thay thế bởi
các nhóm -OH [107]. Sau đó, vi kênh PDMS được ốp lên điện cực và các liên kết
cộng hóa trị bền vững được hình thành giữa nhóm >Si(CH3)-OH và nhóm ≡ Si-OH
(đồng thời giải phóng phân tử H2O) chính là nguyên nhân dẫn đến sự gắn kết bền
chặt và ổn định giữa vi kênh PDMS và điện cực.
3.3.3. Tổ ng hơ ̣p PPy NWs trong bin
̀ h vi phản ứng
Ả nh FE-SEM của PPy NWs
Hình 3.13 là ảnh FE-SEM của dây nano PPy đươ ̣c tổng hợp sử dụng kỹ thuâ ̣t điêṇ
hoá phân cực thế tiñ h, hình 3.13a, và quét thế vòng tuầ n hoàn, hiǹ h 3.13b. Đố i với cả
hai trường hơ ̣p, sản phẩ m polime dẫn PPy đề u được hình thành trên bề mặt điện cực
làm việc với cấu trúc dây nano,
đường kính dây khoảng 80 nm
đến 110 nm và chiề u dài dây cỡ
vài micromet. Kích thước dây
nano PPy tổng hợp được là đồng
đều và dây nano phân bố tương
đối đều trên bề mặt điện cực.
Việc tổng hợp vật liệu polime
Hình 3.13: Ả nh FE-SEM của dây nano PPy được tổng
hợp trong vi bình phản ứng sử dụng kỹ thuật điê ̣n hoá:
PPy cấu trúc dây nano tại chính
(a) phân cực thế tiñ h (0,5 V, 1200 s);(b) quét thế vòng
xác một vị trí mong muốn (WE)
tuầ n hoàn (0-0,6V, 6 vòng, tố c độ quét 25 mV/s)
trong vi kênh có thể tích rất nhỏ
(4 µl) là thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế
giới làm được. Kết quả nghiên cứu này là một trong những đóng góp mới của luận

chuỗi gelatin và tiếp tục được polime hóa để phát triển giữa monome Py và gelatin
thành các dây nano PPy. Như vậy, gelatin đóng vai trò
như khuôn mềm định hướng cho sự hình thành vật liệu PPy cấu trúc dây nano [38].
3.3.4. Phát hiện hiện tượng lai hóa DNA
Khi 4 µl DNA đích 2 nM được bơm
vào vi bình phản ứng, hiện tượng lai hóa
DNA diễn ra nhanh, được đặc trưng bởi sự
thay đổi trong tín hiệu đầu ra (sự chênh
lệch thế, ΔE = 33 mV) và thời gian đáp
ứng chỉ là một vài giây, hình 3.18a. Điều
này được giải thích là do hiện tượng lai
hóa DNA diễn ra trên bề mặt điện cực làm
Hình 3.18: Tín hiệu lai hóa DNA, CDNA dò = 10
μM, T = 298K: (a) Chuỗi DNA đích 2 nM; (b)
Chuỗi DNA đích không kết cặp 2 nM
16


việc (đã đươ ̣c cố định DNA dò), dẫn đến sự thay đổi điêṇ tích của màng dẫn, do đó
làm chuyể n dich
̣ tín hiệu đầu ra.
Thí nghiệm trên được lặp lại tương tự nhưng với chuỗi DNA đích không kết cặp,
tín hiệu đầu ra gần như không thay đổi (sự chênh lệch thế, ΔE = 1 mV) và đã ổn định
ngay sau một phút, hình 3.18b.
Các mẫu DNA đích với nồng độ khác nhau được bơm vào vi bình phản ứng tích
hợp với cảm biến DNA điện hóa. Từ các kết quả đo vi sai, có thể tính được các giá trị
chênh lệch thế, ΔE (mV), tương ứng với các nồng độ DNA đích khác nhau được
thêm vào bình điện hóa. Trên cơ sở đó, xây dựng được đường chuẩn biểu diễn mối
quan hệ giữa tín hiệu đáp ứng, ΔE, và nồng độ DNA đích đã được thêm vào vi bình
phản ứng, hình 3.19. Kết quả thực nghiệm cho thấy giới hạn mà cảm biến có thể phát

tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 và bình phương hệ số
tương quan đạt 0,9932.
Bên cạnh đó, việc tích hợp cảm biến DNA điện hóa và vi bình phản ứng đã giúp
thu nhỏ hệ thống phân tích và giảm đáng kể lượng mẫu tiêu thụ so với khi thực hiện
các phép đo trong hệ mở. Kết quả này cũng là một trong những đóng góp mới của
luận án.

4. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA
TÍCH HỢP BÌNH PHẢN ỨNG MINI ỨNG DỤNG TRONG PHÁT
HIỆN VIRUS NEWCASTLE
4.1. Mở đầu
Sau khi hoàn thành nội dung nghiên cứu 2 với các qui trình đo lường điện hóa
được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ, trong nội dung nghiên cứu 3, luận án
sẽ tiến gần thêm một bước đến ứng dụng thực tiễn. Các kết quả đạt được của luận án
sẽ không chỉ dừng lại ở các bài báo khoa học mà còn có khả năng hướng đến sự hợp
tác với các công ty, các nhà sản xuất. Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử dụng
DNA làm phần tử dò cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, đòi hỏi chi phí
cao và thời gian dài, luận án sẽ sử dụng
kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết
xuất trực tiếp từ trứng gà – một sản phẩm đã
được bán trên thị trường do công ty cổ phần
công nghệ sinh học thú y BTV (BiotechVet) cung cấp, tương lai hướng đến việc
đánh giá chất lượng kháng thể theo đơn đặt
hàng từ phía công ty. Cũng trong nội dung
nghiên cứu 3, cảm biến miễn dịch điện hóa Hình 4.1: Mô phỏng sơ lược hệ điện hóa
tích hợp bình phản ứng mini sẽ được phát mini đi kèm bình phản ứng mini và đầu đo
tích hợp
triển phù hợp với định hướng ứng dụng
trong phát triển một bộ vi phân tích điện hóa
phát hiện virus gây bệnh. Bộ vi phân tích điện hóa, sẽ là một hệ thống hoàn chỉnh bao

Bình phản ứng mini được thiết kế và chế tạo trên cơ sở kỹ thuật vi cơ khí nhằm
mục đích sử dụng lặp lại nhiều lần (chỉ cần thực hiện các thao tác đóng, mở và thay
thế điện cực tương ứng với các phép đo khác nhau).
4.2.3. Cố định kháng thể trên bề mặt cảm biến
Điện cực vàng sau khi được làm sạch bề mặt, được ủ với 20 µl dung dịch PrA (1
mg/ml) ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, sau đó tiếp tục được ủ với 20 µl dung dịch GA
5 % (30 phút, nhiệt độ phòng), cuối cùng, điện cực được ủ với 20 µl kháng thể (60
µg/ml) ở 4 ᵒC trong 3 giờ. Sau khi kháng thể được cố định lên bề mặt điện cực, 20 µl
BSA 1% được sử dụng để khóa phủ các vị trí không đặc hiệu (30 phút, nhiệt độ
phòng). Sau mỗi bước cố định, điện cực đều được rửa sạch bằng nước khử ion và
được sấy khô bằng khí N2 nhằm loại bỏ những phần tử không tương tác hoặc tương
tác yếu.
4.2.4. Phát hiện virus (bất hoạt) sử dụng cảm biến miễn dịch điện hóa
20 µl virus bất hoạt Newcastle được nhỏ lên trên điện cực ở nhiệt độ phòng trong
1 giờ. Sau đó, điện cực được rửa với nước khử ion để loại bỏ những phần tử đích
không tương tác hoặc tương tác yếu. Quá trình đo CV (Cyclic Voltammetry) được
thực hiện trên hệ điện hóa EC301 từ Stanford Research Systems. Bình điện hóa sử
dụng ba điện cực: điện cực làm việc (WE) là điện cực cảm biến miễn dịch/virus, điện
cực đối (CE) là điện cực Au tích hợp và điện cực so sánh (RE) là điện cực so sánh
thay thế Ag/AgCl. Dung dịch điện li gồm Fe(CN)63-/4- 0,03 M, KCl 0,1 M, khoảng
quét thế từ -0,2 đến 0,5 V và tốc độ quét 25 mV/s.
4.2.5. Thống kê và xử lý số liệu
Để xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đầu ra của cảm
biến miễn dịch (∆Ipeak) và hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml), các mẫu virus
19


Newcastle (bất hoạt) có hàm lượng thay đổi từ 102 đến 106 EID50/ml (EID50: 50%
Empryo Infective Dose – Liều nhiễm trùng trên phôi gà) đã được sử dụng. Từ các
đường CV thực nghiệm có thể xác định được giá trị dòng cực đại Ipeak và ∆Ipeak theo

(b): Au/PrA; (c): Au/PrA/GA/Ab và (d):
PrA/GA/Ab
và
cuối
cùng
là
Au/PrA/GA/Ab/BSA trong dung dịch
PrA/GA/Ab/BSA đã dẫn đến sự sụt giảm
K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M
điện thế tại bề mặt các lớp này, do đó làm
tăng giá trị điện trở chuyển điện tích của cặp oxi hóa khử [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- vào
điện cực Au và làm giảm cường độ dòng của cảm biến.
Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử kháng thể IgG đã được tinh chế làm phần
tử dò cho cảm biến miễn dịch như trong phần lớn những công bố khác [21,30,106],
luận án đã tập trung nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus
Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà lên bề mặt cảm biến. Kháng thể IgG (đơn
dòng và đa dòng) đều phải được sản xuất và tinh chế tại các phòng thí nghiệm tiêu
chuẩn, sử dụng các bộ sinh phẩm thương mại và kỹ thuật hiện đại, vì vậy, đòi hỏi chi
phí cao và thời gian dài [84,97]. Tuy nhiên, theo Jones và cộng sự [71], dịch bệnh
truyền nhiễm thường diễn ra bất ngờ, khó có thể dự đoán khi nào sẽ diễn ra dịch
bệnh, dẫn đến khó khăn trong việc chủ động nguồn kháng thể IgG tinh chế cần thiết
cho các xét nghiệm trong thời gian ngắn. Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng kháng thể
IgY thu thập từ trứng gà, không cần phải qua các qui trình tinh chế phức tạp, yêu cầu
kỹ thuật hiện đại, chi phí cao và thời gian dài làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch
sẽ không những giúp giảm chi phí mà còn là giải pháp hiệu quả nhằm phát hiện kịp
20


thời virus gây bệnh trong các vụ dịch bệnh truyền nhiễm do không còn phụ thuộc
nhiều vào nguồn kháng thể IgG tinh chế.

đến 60 µg/ml, tín hiệu đầu ra của cảm biến
(∆Ipeak) tăng lên. Kết quả này được giải
thích là do khi nồng độ kháng thể tăng, số
lượng kháng thể được cố định hiệu quả trên
bề mặt cảm biến sẽ tăng lên, nhờ đó, làm
tăng xác suất bắt cặp với kháng nguyên đặc
hiệu. Trong nghiên cứu này, kháng thể
được sử dụng làm phần tử dò cho cảm biến
miễn dịch là kháng thể IgY kháng virus Hình 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể
Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà và
đến giá trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch
21


nồng độ 60 µg/ml là giá trị nồng độ kháng thể
cao nhất (dung dịch kháng thể được cung cấp
bởi nhà sản xuất). Do đó, giá trị nồng độ
kháng thể 60 µg/ml sẽ được lựa chọn cho
những thí nghiệm tiếp sau.
4.3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp
kháng thể - virus
Hình 4.16 biểu diễn các đường CV của
điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f):
cảm biến miễn dịch/virus Newcastle trong
dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M,
4.16: Đường CV của điện cực: (a): cảm
KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi Hình
biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn
thời gian bắt cặp kháng thể - virus: (b): 15 dịch/virus Newcastle khi thay đổi thời gian bắt
cặp kháng thể - virus

dịch/virus Newcastle khi thay đổi hàm
0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi hàm
2
lượng virus Newcastle
lượng virus Newcastle: (b):10 EID50/ml, (c):
103 EID50/ml, (d): 104 EID50/ml, (e): 105 EID50/ml và (f): 106 EID50/ml.
Từ các đường CV thực nghiệm có thể tính được các giá trị Ipeak và ∆Ipeak theo các
công thức (4.1) và (4.2) tương ứng với các hàm lượng virus Newcastle khác nhau.
22


Hình 4.19 là đường chuẩn biểu diễn mối
quan hệ giữa tín hiệu đầu ra của cảm
biến miễn dịch (∆Ipeak) và hàm lượng
virus Newcastle (log EID50/ml). Hình
4.19 cho thấy, giới hạn phát hiện của
cảm biến miễn dịch là 102 EID50/ml
virus Newcastle. Cảm biến miễn dịch
điện hóa đạt tuyến tính tốt trong khoảng
hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến
106 EID50/ml với phương trình liên hệ
là: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 và
bình phương hệ số tương quan (R2) đạt
Hình 4.19: Sự thay đổi tín hiệu đầu ra của
cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) phụ thuộc vào hàm
0,9969.
lượng virus Newcastle (log EID50/ml)
4.4 Kết luận
Hệ ba điện cực sử dụng PRE
Ag/AgCl đã được thiết kế, chế tạo và ghép nối với một bình phản ứng mini. Việc sử