BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THỊ MỸ THỦY

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC
THEO NGUYÊN LÝ ĐIỆN HÓA KHÔNG SỬ DỤNG
CHẤT ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG TRONG Y SINH
Chuyên ngành: HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. HUỲNH ĐĂNG CHÍNH
2. PGS. TS. TRẦN ĐẠI LÂM

Hà Nội – 2012


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học, đề tài
Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử
dụng chất đánh dấu ứng dụng trong y sinh là công trình nghiên cứu độc lập của
mình , các kết quả phân tích đợc thực hiện là chính xác không sử dụng của các tác
giả khác.
Trong luận văn tôi có tham khảo kết quả nghiên cứu của một số tác giả đợc
chỉ rõ trong danh mục tài liệu tham khảo. Mọi số liệu, tài liệu sử dụng trong luận
văn đều có nguồn gốc rõ ràng.


................................................................30

I.4.3. Phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ ...................................................32
CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU .37
II.1. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ..............................................................37
II.1.1. Điện cực làm việc ....................................................................................37
II.1.2. Chế tạo hạt nano Fe3O4 được bọc bằng copolyme poly .........................38
II.1.3. Trùng hợp điện hóa màng PANi và PANi-

..................................40


II.1.4. Cố định enzyme Cholesterol ...................................................................41
II.1.5. Các phân tích điện hóa ...........................................................................43
II.1.6. Phân tích cholesterol bằng phương pháp CHOD-PAP ..........................44
II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................45
II.2.1. Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier .....................................45
II.2.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét ..................................................46
II.2.3. Các phương pháp nghiên cứu điện hóa ..................................................48
II.2.4. Phương pháp trắc quang .............................................................................50
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................52
III.1. TỔNG HỢP ĐIỆN HÓA MÀNG NANOCOMPOSITE PANi/Fe3O4 .......52
III.2. HÀNH VI ĐIỆN HÓA CỦA ĐIỆN CỰC PANi VÀ PANi-Fe3O4..............54
III.3. PHÂN TÍCH HÌNH THÁI HỌC QUA ẢNH FE-SEM .................................1
III.3.1. Ảnh FE-SEM màng PANi và PANi-Fe3O4 .............................................55
III.3.2. Ảnh FE-SEM màng PANi và PANi-Fe3O4 cố định ChOx .....................55
III.4. PHỔ HỒNG NGOẠI PANi và PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx ..........................57
III.5. CÁC PHÉP ĐÁNH GIÁ ĐIỆN HÓA ĐỐI VỚI CẢM BIẾN ChOx ...........58
III.5.1. Phương pháp Von-Ampe vòng (CV) ......................................................58


Coenzyme

CV

Phân cực vòng

E

Enzyme

p(St-co-AA)

Copolyme polystyren và polyacrylic axit

EIS

Phổ tổng trở điện hóa

EM

Emeraldine

ES

Muối Emeraldine

FT-IR

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier


Pernigraniline

PEDOT

Poly (3, 4-ethylenedioxythiophene)

PPy

Polypyrol

PS

Phân cực thế tĩnh

RE

Điện cực so sánh

SCE

Điện cực calomen bão hòa

SEM

Kính hiển vi điện tử quét

USB

Universal Serial Bus

Hình I. 15. Dạng bipolaron của PANi .......................................................................26
Hình I. 16. Cấu trúc hạt nano Fe3O4 [38] ..................................................................30
Hình I. 17. Cơ chế hình thành và phát triển hạt nano trong dung dịch .....................32
Hình I. 18. Công thức phân tử của glutaraldehyde ...................................................35
Hình I. 19. Phương pháp liên kết chéo (cross-linking) .............................................35
Hình II. 1. Sơ đồ chế tạo vi điện cực tích hợp ..........................................................38
Hình II. 2. Vi điện cực tích hợp ................................................................................38
Hình II. 3. Hệ điện hóa đa năng Autolab/PGSTAT12 ..............................................41
Hình II. 4. Hệ ủ hơi GA cố định enzyme ..................................................................42
Hình II. 5. Sơ đồ nguyên lý của máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier .........46
Hình II. 6. Sơ đồ các bộ phận của kính hiển vi điện tử quét .....................................48
Hình II. 7. Phương pháp quét thế tuyến tính đa chu kỳ ............................................49
Hình II. 8. Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong phương pháp CV ..................49


Hình II. 9. Sơ đồ nguyên lý máy trắc quang .............................................................51
Hình II. 10. Đường chuẩn và cách xác định nồng độ (Cx) theo phương pháp đường
chuẩn từ Ax đo được ................................................................................51
Hình III. 1 Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV màng (a) PANi và (b)
PANi-Fe3O4 trên vi điện cực Pt ...............................................................52
Hình III. 2. So sánh cường độ dòng phổ CV (chu kỳ thứ 20) của quá trình trùng hợp
màng PANi và PANi-Fe3O4 ....................................................................53
Hình III. 3. Ảnh hệ điện cực trước và sau khi trùng hợp ..........................................54
Hình III. 4 Phổ CV của điện cực Pt/PANi và Pt/PANi-Fe3O4 trong đệm PBS (KCl
0,9%) .......................................................................................................54
Hình III. 5 Ảnh FE-SEM màng (A) PANi và (B) PANi-Fe3O4 trùng hợp theo
phương pháp CV trên vi điện cực Pt .......................................................55
Hình III. 6 ảnh FE-SEM của (A) hạt nano Fe3O4, điện cực (B) Pt/PANi/ChOx, (C)
Pt/PANi-Fe3O4/ChOx và (D) Pt/PANi-Fe3O4/ Fe3O4-ChOx...................56
Hình III. 7. Phổ FT-IR của (đường a) PANi và (đường b) PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx ....57

tích lâu, người sử dụng phải có chuyên môn, người bệnh phải chịu chi phí cao, mất
nhiều thời gian chờ đợi...
Cảm biến sinh học đo tín hiệu điện hóa (electrochemical biosensor) đáp ứng
được các yêu cầu của hóa học phân tích hiện đại đó là có khả năng phân tích nhanh
theo thời gian thực (real-time), có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao; thiết bị
phân tích nhỏ gọn, sử dụng đơn giản, có giá thành phù hợp. Với sự phát triển của
công nghệ vi điện tử, công nghệ nano và các loại vật liệu mới, khả năng chế tạo và
ứng dụng cảm biến sinh học ngày một hiện thực hơn, phương pháp không đòi hỏi
nhiều hóa chất, dung môi; chỉ cần lượng mẫu phân tích nhỏ đây là tiền đề của hóa
học phân tích xanh là chủ đề của hóa học hiện đại đang hướng tới. Do vậy việc
dùng cảm biến sinh học xác định nồng độ các chất như ure, glucose, cholesterol,

1


amylase ... được coi là một phương pháp bổ sung cho các phương pháp phân tích
tiêu chuẩn hiện có tại các bệnh viện.
Do tính hữu ích và khả năng ứng dụng cao, luận văn “Nghiên cứu phát triển
cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng
trong y sinh”, hướng tới chế tạo cảm biến sinh học với điều kiện công nghệ hiện có
ở trong nước, khảo sát các kết quả của cảm biến đã chế tạo, so sánh với các kết quả
đã được kiểm tra đối chứng tại khoa hóa sinh Bệnh viện Bạch mai. Qua đó ứng
dụng để xác định nhanh chỉ số cholesterol trong các chế phẩm sinh học.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
I.1. CẢM BIẾN SINH HỌC (BIOSENSORS)
I.1.1. Sơ lược quá trình phát triển của cảm biến sinh học


Hình I. 2. Phòng sạch tại Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội

I.1.2. Cấu tạo chung của cảm biến
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính:
- Đầu thu sinh học
- Tác nhân cố định
- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu
- Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra

4


Mục đích là để dò tìm, phân tích các tác nhân cần phát hiện một cách chọn lọc.

Hình I. 3. Sơ đồ cấu tạo chung của cảm biến sinh học

- Tác nhân cần phát hiện : được phân loại theo cấu tạo như sau
+ Các vi khuẩn như vi khuẩn E-coli, vi khuẩn Candida...
+ Các phân tử nhỏ như glucose, ure, thuốc trừ sâu,…
+ Các phân tử sinh học có kích thước lớn như phân tử ADN, RNA, protein...
- Đầu thu sinh học (Biological Receptor) có tác dụng bắt cặp và phát hiện
sự có mặt của các tác nhân sinh học cần phân tích. Đầu thu sinh học phản ứng trực
tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học.
+ Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng phổ biến nhất: đầu thu làm từ các
enzyme urease, glucose oxidase, ...
+ Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên.
+ Ngoài ra đầu thu sinh học làm từ các protein , các axit nucleic như ADN, ARN

5


tạo đơn giản, có độ nhạy và độ chính xác cao phù hợp trong chế tạo cảm biến sinh
học ứng dụng phân tích nhanh. Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa trên
điện thế (potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric) .
- Bộ phận xử lý và đọc tín hiệu: bộ phận này có tác dụng chuyển, khuếch đại
thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị hiển thị khác đưa ra kết quả cho
người cần phân tích.
I.1.3. Cảm biến theo nguyên lý điện hóa
Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa có tính ứng dụng cao đo
nguyên lý đơn giản, độ ổn định và độ nhạy cao. Nhờ những phản ứng hóa học hay
sinh học đều có thể gây ra các tương tác sinh điện tử một cách trực tiếp (như lai hóa
của ADN, oxy hóa khử của enzyme…) nên rất thích hợp để phát hiện nhanh trong
phân tích cận lâm sàng .

Hình I. 5. Một hệ cảm biến điện hóa

7


Quá trình nhận biết tín hiệu có thể thực hiện bằng các phép đo dòng, đo thế
và độ dẫn [11, 16, 17].
Phép đo dòng: Dựa trên sự thay đổi dòng điện gây ra do sự oxy hóa - khử
điện hóa của chất cần phát hiện. Phương pháp này được thực hiện bằng cách áp một
điện thế giữa điện cực làm việc (WE) và điện cực so sánh (RE), tín hiệu dòng sẽ
được đo giữa điện cực làm việc (WE) và điện cực phụ trợ (CE). Khi điện thế đạt
đến một giá trị nào đó (thường là điện thế oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện
và các electron được sinh ra. Dòng điện thu được liên quan trực tiếp đến nồng độ
chất cần phân tích [16, 18].
Phép đo thế: Liên quan đến việc xác định sự chênh lệch thế giữa một điện
cực chỉ thị và một điện cực chuẩn hoặc hai điện cực chuẩn so sánh cách nhau bởi

Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều ưu điểm so với các phương pháp
truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản và chính xác. Chính vì
vậy nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống.
- Thực phẩm và kiểm soát môi trường
Ngày nay vấn đề môi trường và vầ sinh an toàn thực phẩm là mối quan tâm
của toàn xã hội. Các hệ cảm biến được phát triển và ứng dụng đó là phân tích nhanh
dư lượng các loại thuốc trừ sâu, dư lượng các chất kháng sinh, các nâm mốc độc hại
tồn tại trong lưới thức ăn như sabutamon, aflatoxin... [19]
-An ninh Quốc phòng :
Một số báo cáo gần đây cho thấy đã chế tạo thành công mũi điện tử phát hiện
thuốc nổ TNT [20], phát hiện các vụ tấn công hóa sinh và các chất phóng xạ với độ
nhạy cao.
- Y học, sinh học:
Cảm biến sinh học ứng dụng phát hiện các protein ung thư và các siêu vi trùng
tiềm ẩn. Nhiều loại cảm biến như cảm biến đo nồng độ oxi, lượng glucose trong máu,
cảm biến huyết áp, … những cảm biến giúp người bệnh có thể thường xuyên theo dõi

9


tình hình bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y tế. Ngày
nay, các cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà
còn được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ và dễ sử dụng.
Nếu như cảm biến glucose đã được thương mại hóa trên thị trường, bất cứ
người nào đều có thể mua và sử dụng dễ dàng với giá thành ngày một hạ thì cảm
biến xác định nhanh cholesterol toàn phần vẫn còn khá mới mẻ [21]. Chính vì thế
trong nội dung luận văn này đã lựa chọn cholesterol là đối tượng nghiên cứu.
I.2. ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL
I.2.1. Enzyme [22]
Sự sống là mộtquá trình trao đổi chất liên tục. Quá trình trao đổi chất bao

- Trung tâm hoạt động bao gồm những nhóm chức hóa học của mạch bên
(gốc R) của các axit amin (a.a) trong phân tử, phân tử H2O liên kết, các nhóm chức
của CoE. Các nhóm chức của a.a thường gặp trong TTHĐ là nhóm SH của Cys;
nhóm – OH của Tyr; nhóm carboxyl của Glu, Asp; nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm
ε-amin của Lys, vòng imidazol của His…Các nhóm chức trong TTHĐ của E có thể
có vai trò khác nhau :kết hợp hoặc xúc tác , các gốc khác thì có vai trò đối với tính
đặc hiệu của E.
- TTHĐ có cấu hình không gian xác dịnh được giữ vững nhờ mạng lưới liên
kết hydrogen mạng lưới này đủ linh động để có thể thay đổi cấu hình không gian
của TTHĐ dưới tác dụng của các yếu tố bên ngoài,khi tương tác với cơ chất hoặc
các chất khác.
- Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa TTHĐ và cơ chất được hình
thành trong quá trình E tiếp xúc với cơ chất (S).
E Fisher đề ra giả thuyết giữa E và S , theo đó sự tương ứng về cấu trúc của
TTHĐ của E và S sắn có và cố định trong quá trình E kết hợp với S, thuyết này đã
được thừa nhận trong nhiều năm vì giải thích được tính đặc hiệu của E , nhưng
không phù hợp với đặc tính cấu trúc không gianmềm dẻo của phân tử protein. Năm
1958, Koshland đã đưa ra giả thuyết “ khớp phản ứng”,theo đó quá trình E kết hợp S sẽ
làm thay đổi cấu trúc không gian ,tạo nên sự tương ứng về cấu trúc giữa E và S.

11


Hình I. 6. (a) Mô hình Fisher (b) Mô hình Koshland

- Tương tác giữa E và S là các tương tác yếu ,dễ dàng bị cắt đứt trong quá
trình phản ứng để giải phóng E và sản phẩm tương ứng.
I.2.1.2. Đặc điểm sự xúc tác của enzyme
Chất xúc tác là chất làm tăng cường phản ứng hóa học, nhưng không bị
biến đổi tiêu hao và tham gia vào thành phần sản phẩm của phản ứng.Chỉ cần một

trúc phân tử;phân tích các chất, xác định chính xác hàm lượng các chất; ứng dụng
trong các ngành công nghiệp;ứng dụng trong y, dược.
I.2.1.3. Cơ chế xúc tác của E
Các phản ứng do E xúc tác có thể được khái quát bằng phương trình phản
ứng chung dưới đây:
E + S Ù ES Ù ES* Ù E + P
Trong đó E là enzyme; S là cơ chất (substrate); ES là phức chất hình thành
giữa E và cơ chất; ES* là phức chất giữa E với cơ chất, trong đó cơ chất đã được
biến đổi thành dạng gần như sản phẩm của phản ứng; P là sản phẩm (product) của
phản ứng.

13


Bước 1: cơ chất gắn vào trung tâm hoạt động của E tạo thành phức hợp
enzyme – cơ chất (ES).
E + S Ù ES
Bước 2: dưới tác dụng nhóm hoạt động của E ,cấu tạo điện tử của cơ chất bị
biến đổi, những liên kết chịu tác dụng của enzyme bị căng ra, độ bền vững của liên
kết giảm đi,hoạt tính hóa học của cơ chất tăng lên rất nhiều, do đó chỉ cần năng
lượng hoạt hóa rất nhỏ cũng làm phản ứng xảy ra rất nhanh.
ES Ù ES*
Bước 3: cơ chất được biến đổi thành sản phẩm (P) và enzyme được giải
phóng ra dưới dạng tự do.

Hình I. 7. Xúc tác Enzyme làm giảm năng lượng của phản ứng

I.2.1.4. Tính đặc hiệu của enzyme
Mỗi E đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất
nhất định đối với một loại phản ứng nhất định.Tính chất xúc tác chọn lọc này được

số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng (miligam hay gam) protein.
Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn
vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.
Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc
tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của

15


enzyme (1U) là lượng enzyme xúc tác sự biến đổi 1 µmol cơ chất sau 1 phút ở điều
kiện nhất định.
1 U = = 1 µmol cơ chất (10-6mol)/phút
Đơn vị Katal(kat): Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo
nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme. Một Katal là lượng
enzyme xúc tác sự biến đổi 1 mol cơ chất trong 1 giây và trong những điều kiện
nhất định
1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây
1µKat/l = 60 U/l
U/l = 16,67 nKat/l (nanokatal)
Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).
I.2.1.6. Enzyme không tan và điện cực enzyme
E không tan là các E bị giữ hoặc được cố định trong một vùng, một khoang
nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường,vẫn giữ được hoạt động
xúc tác,có thể sử dụng liên tục và lặp lại nhiều lần. Do đặc tính không bị hòa tan mà
vẫn giữ được hoạt độ xúc tác ,nên ưu điểm của E không tan là : có thể sử dụng lặp
lại nhiều lần một lượng E xác định,do đó làm giảm đáng kể giá thành chế phẩm E.
Ngoài ra nó còn có độ bền với các yếu tố hóa lý hơn khi ở dạng hòa tan. Một số E
xúc tác cho quá trình oxi hóa khử cũng là dạng E không tan.
Biosensor điện cực enzyme, cũng gọi là điện cực E không tan có thành phần
cấu tạo sinh học của điện cực này là E, được cố định trên bề mặt của điện cực, đáp


17