ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

NGUYỄN THỊ NHUNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ
TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Bản khóa luận này đƣợc thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm
An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Lê Thị
Hồng Hảo.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.
TS Lê Thị Hồng Hảo đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn và góp ý giúp
em hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị
Hà Bình đã hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An
toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS. Trần Cao Sơn và các cán bộ khoa Độc
học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài.

1.2.1. Các phƣơng pháp thử sinh học ...............................................................9
1.2.2. Phƣơng pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA ........................................10
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................ 11
1.2.4 Kỹ thuật điện di .....................................................................................13
1.2.5 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) ...............13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................16
2.1. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu ..............................................................16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..........................................................................16
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................16
2.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ...................................................................16
2.2.2 Phƣơng phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) .................................17
2.2.3. Thẩm định phƣơng pháp ......................................................................23

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................26
2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu ..............................................................................26
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................26
2.3.2. Dung môi, hóa chất ..............................................................................27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............. Error! Bookmark not defined.
3.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS Error! Bookmark not defined.

3.1.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy của thiết bị khối phổ MS/MS Error! Bookmark not d

3.1.2 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Error! Bookmark
3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu ....................... Error! Bookmark not defined.

6

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định
PSP 11
Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm viêc̣

Error!

Bookmark

not

defined.
Bảng 3.1: Ion mẹ của từng chất Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS

Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.4: Chương trình gradient

Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu

Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.7: Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết Error!



Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các PSP
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu
Ngao Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu
Hàu Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn Hà Nội

Error!

Bookmark not defined.

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của các độc tố PSP 3
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của STX 4
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo 5
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1

5

Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng 18
Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử
Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực

Trường ĐHKH Tự Nhiên


thu hồi

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.9: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích chiết đến hiệu suất thu
hồi

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu Error! Bookmark not defined.
Hình 3.11: Phổ khối của các PSP

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng không có tín hiêụ chấ t phân tích.

Error!

Bookmark not defined.
Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn ở mức 200 ng/mL

Error!

Bookmark

not


Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên


Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diêṇ tích pic

Error!

Bookmark

defined.

Nguyễn Thị Nhung

Trường ĐHKH Tự Nhiên

not


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
CAN
AOAC

Tiếng Anh
Acetonitrile
Association of Official
Analytical Communities



Thế đầu ra

DP

Declustering Potential

Thế phân mảnh

DSP

Diarrhetic Shellfish Poisoning

Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy

d-SPE

Dispersive solid phase
extraction

nhớ

Chiết phân tán pha rắn

Eq

Equivalents

Tƣơng đƣơng


GTX-1

Gonyautoxins-1

Độc tố gonyautoxins-1

HPLC

High performance liquid
chromatography

Nguyễn Thị Nhung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trường ĐHKH Tự Nhiên


HILIC
IS
LC-MS/MS

Hydrophilic interaction liquid
chromatography
Ionspray Voltage
Liquid chromatography tandem
mass spectrometry

Sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc
Thế phun ion

Khối phổ

NEO

Neosaxitoxin

Độc tố neosaxitoxin

PSP

Paralytic Shellfish poisoning

Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD(%)

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard Deviation


cải thiện đời sống cho nhiều hộ dân cƣ ven biển.
Đô thị hóa, ô nhiễm môi trƣờng làm môi trƣờng biển ngày càng bị suy
thoái tạo điều kiện cho sự xuất hiện và bùng nổ của các loài vi tảo biển độc hại.
Các loài thân mềm hai mảnh vỏ là đối tƣợng trung gian chính để gây ra hiện
tƣợng ngộ độc ở ngƣời và các sinh vật bậc cao nhƣ chim biển, thú biển. Đặc biệt
sự có mặt các nhóm độc tố độc tố gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning).
Chính vì vậy, nghien cứu phát hiện các độc tố cần đƣợc quan tâm để giảm nguy
cơ ảnh hƣởng đến sức khỏe cũng nhƣ tính mạng của con ngƣời.
Trong đề tài này tập trung nghiên cứu nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ
PSP (Paralytic Shellfish Poisoning). Độc tố này gây nguy hiểm đến sức khoẻ và
tính mạng con ngƣời là do động vật nhyễn thể bị nhiễm và tích lũy độc tố PSP do
ăn phải tảo độc nhóm Dinoflagellates bao gồm loài Dinophysis spp, Aurocentum,
prorocentrumlima.Việc xác định một số độc tố nhuyễn thể gây liêt cơ là rất cần
thiết, là công cụ rất tốt phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra an toàn thực phẩm.
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp “Xác định đồng
thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối
phổ LC-MS/MS”. Phƣơng pháp hiện đại, có độ tin cậy và chính xác cao.
Mục tiêu của thực hiện đề tài luận văn là:
- Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS.
- Sơ bộ đánh giá một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
tiêu thụ tại Hà Nội.

Nguyễn Thị Nhung

1

Trường ĐHKH Tự Nhiên




R1

R2

R3

Hệ số độc

M

STX

-H

-H

-H

1

299

NEO

-OH

-H

-H


-H

-OSO3- -H

0,64

395

GTX-4

- OH

-OSO3- -H

0,73

411

R4

O

NH2
O

- Nguồn gốc: Sinh ra bởi vi sinh vật sống cộng sinh trên một sinh vật khác, gồm
các tảo dinoflagellates Gonyaulax catenella và G. Tamarensi, tìm thấy ở các loài
nhuyễn thể ở vùng Alaska, Saxidomus giganteus và các loài, Mytiluscalifornianeus. Độc tố có thể sản sinh riêng biệt bởi S. giganteus hay M.
californianeus.

-

Khối lƣợng mol phân tử : 299.29 g/mol

1.1.2 Giới thiệu về NEO
- Danh pháp thƣờng: Neosaxitoxin
- Danh pháp quốc tế:

Nguyễn Thị Nhung

4

Trường ĐHKH Tự Nhiên


[(3aS,4R,10aS)-5,10,10-Trihydroxy-2,6-diiminooctahydro-1H,8Hpyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methyl carbamate
- Công thức cấu tạo:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo
- Công thức thu gọn: C10H17N7O5
-

Khối lƣợng mol phân tử : 315.286 g/mol.

1.1.3 Giới thiệu về GTX-1
- Danh pháp thƣờng: Gonyautoxins-1
- Danh pháp quốc tế: {4-[(carbamoyloxy)methyl]-5,10,10-trihydroxy-2,6diimino-decahydropyrrolo[1,2-c]purin-9-yl}oxidanesulfonic acid
- Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1

Australia

Động vật có vỏ

Saxitoxin

80 µg/100g

Canada

Nhuyễn thể

PSP


Na Uy

Tấ t cả

PSP

40-80 µg/100g

Panama

Nhuyễn thể

PSP

400 MU/100g

Singapore

Nhuyễn thể

Saxitoxin

80 µg/100g

Mỹ

Nhuyễn thể

PSP


hàng năm từ tháng 3 đến tháng 9. Gần đây, trong khoảng tháng 3-6/2012 ở Cát
Bà Hải Phòng cũng đã xuất “thủy triều đỏ”, tuy nhiên loại tảo này có tên
Noctiluca scintillans không sinh độc tố, nên không có nguy cơ gây độc cho ngƣời
[11].
 Ảnh hƣởng của tảo độc trong ao tôm.
Trên các ao nuôi tôm sú Penaeus monodon và P. orientalis ở Đài Loan, Trung
Quốc và Malaysia có nhiều giống tảo nở hoa do môi trƣờng giàu ding dƣỡng bao
gồm: Euglena spp, Noctiluca scintillan, Alexdrium tamarense, Chattonella spp,
chúng gây ra tình trạng thiếu oxy máu, tiết ra độc tố PSP, ASP làm giảm sinh
trƣởng ở tôm, gây bệnh, hoặc trực tiếp gây chết tôm.
Ở Việt Nam, tảo độc Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực Vân Phong thuộc
vùng biển Khánh Hòa đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm với thiệt hại ƣớc tính

Nguyễn Thị Nhung

7

Trường ĐHKH Tự Nhiên


khoảng 6 tỷ đồng.
 Ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời.
Ở ngƣời, nhiễm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là do ăn phải nhuyễn thể
chứa độc tố này. Nhuyễn thể bị nhiễm và tích lũy các loại độc tố này là do ăn tảo
độc.
Dấu hiệu đầu tiên của sự nhiễm độc trên ngƣời xuất hiện khoảng 5-30 phút sau
khi ăn nhuyễn thể bị nhiễm với các triệu chứng: cảm giác kim châm hoặc tê nhẹ
đến liệt cơ hô hấp hoàn toàn. Trong trƣờng hợp nặng có thể tử vong do liệt cơ hô
hấp, xảy ra trong vòng từ 2-12h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc PSP.
Mỗi năm, các trƣờng hợp ngộ độc do PSP vẫn đƣợc ghi nhân trên toàn thế giới.

cơ thể động vật nhuyễn thể, các độc tố tập trung nhanh chóng trong nội tạng và
sau giảm dần. Thành phần các độc tố không giống nhau mà biến đổi theo thời
gian và vị trí trong động vật. Cơ khép vỏ không tích lũy độc tố mà thực tế cho
thấy đã làm bất hoạt độc tố. Ống tiêu hóa, màng, tuyến sinh dục và mô mang giữ
lại độc tố với trọng lƣợng khác nhau giữa các mô và giữ các loài. Sau khi hấp thụ
và phân bố, các độc tố có thể bị biến đổi. Các loài hai mảnh vỏ có cách xử lý và
phản ứng với PSP khác nhau và sự nhạy cảm của chúng với độc chất này cũng
khác nhau, ví dụ: vẹm tích lũy các độc tố PSP nhiều hơn hàu trong cùng hoàn
cảnh. Các nghiên cứu nuôi trong phòng thí nghiệm cho thấy vẹm hấp thụ dễ dàng
các độc tố của tảo giáp nhƣng với lƣợng độc tố tƣơng đƣơng nhƣ thế thì hàu
ngừng lọc.

1.2. Các phƣơng pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ
Có hai nhóm phƣơng pháp chính để xác định các độc tố sinh học biển
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bao gồm nhóm phƣơng pháp sinh học và nhóm
phƣơng pháp hoá học:
1.2.1. Các phƣơng pháp thử sinh học
Thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) vẫn là phƣơng pháp thử nghiệm
chính trong hầu hết các chƣơng trình giám sát ngộ độc thủy sản. MBA đƣợc sử
dụng phổ biến trên thế giới trong hơn 50 năm qua và là phƣơng pháp chính thức
của AOAC.

Nguyễn Thị Nhung

9

Trường ĐHKH Tự Nhiên



phát hiện là 4 ng/g mô nhuyễn thể [26].
-

Ƣu điểm: Dễ thực hiện và thời gian phân tích ngắn.

Nguyễn Thị Nhung

10

Trường ĐHKH Tự Nhiên


-

Nhƣợc điểm: chi phí mua kit thử đắt, không có khả năng định danh và

phân loại các thành phần của độc tố PSP. Do đó, khi phát hiện mẫu thử dƣơng
tính phải dùng phƣơng pháp sắc ký để kiểm tra [23].
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao sử dụng detector huỳnh quang
(HPLC-FLD) là phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất trong phân tích các PSP
và AOAC 2005:06.
Ƣu điểm của phƣơng pháp là có độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc cao.
Nhƣợc điểm là tốn thời gian vì các PSP phải đƣợc dẫn xuất hóa trƣớc cột
hoặc sau cột để phân tích bằng detector huỳnh quang. Ngoài ra, việc xác định
PSP phức tạp hơn do sự chồng chéo các sản phẩm oxi hóa các chất tƣơng tự PSP
trong trƣờng hợp oxi hóa trƣớc cột.
Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp HPLC-FLD để xác
định PSP
TLTK và

ammonium

photphat 48 mmol/mL và tetrahydrofuran
B:

acid

heptanesulfonic

(µg/g)
LOQ =
0,07

0,75% trong nƣớc
+ Kênh

0,035

7

octanesulfonic
mmol/L,

và

(µg/g)

ammonium

photphat 48 mmol/mL, tetrahydrofuran 1% và


mM trong nƣớc (pH = 7,1)
+ Kênh B: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 16,5
mM, methylnitril 11,5% trong nƣớc (pH = 7,1)

µg/g
Độ thu

+ Oxi hóa sau cột

hồi: 88%

+ Tốc độ dòng 0,8 mL/phút

– 113%

+ Bƣớc sóng kích thích và phát xạ: 330 nm và 390
nm
- Nền mẫu: Hàu, sò, hến
- Điều kiện sắc kí

LOD =

+ Cột Supelcosil LC-18 (5 µm; 4,6 x 15 mm)
+ Kênh A : ammonium formate 0,1 M
Llewellyn

+ Kênh B : ammonium forrmate 0,1 M trong 5%

[20]

hợp chất mang điê ̣n , và thậm chí khi không có điện tích nó có thể hợp chất bẫy
trong mixen mà sau đó sẽ di chuyển.
Wright và cô ̣ng sƣ̣ (1989) [29] áp dụng một hệ thống CE cùng với một
máy dò huỳnh quang để xác định STX. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các STX
ở cấp µg /kg. Mặc dù khối lƣợng tiêm là nhất thiết phải nhỏ (1-10 nL), giới hạn
phát hiện lý thuyết cho các mẫu nằm trong khoảng pg/kg. Những nhƣợc điểm
hiện nay với kỹ thuật là không xác đinh
̣ đƣơ ̣c độc tố hỗn hợp.
Thibault và cô ̣ng sƣ̣ (1991) đã áp dụng một phƣơng pháp CE cho các mẫu
sinh vật biển. Sƣ̣ phân tách của Neo và STX đã đạt đƣợc và sử dụng phép đo phổ
UV với gi ới hạn phát hiện cỡ 1,5 µg/mL. Các tác giả cho rằng kỹ thuật CE-UV
có thể áp dụng cho vi ệc kiểm tra thƣờng xuyên các chất độc trong các chiết xuất
tự nhiên, nhƣng giới hạn phát hiện hiện nay là quá cao đ ể có thể sử dụng trong
các chƣơng trình giám sát.
1.2.5 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS)
Gần đây phƣơng pháp sắc kí lỏng tƣơng tác ƣa nƣớc kết hợp với detector
2 lần khối phổ cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao khi phân tích các PSP (HILICMS/MS).
Liyang Zuo [31] đã sử dụng kĩ thuật QuEChERS (nhanh, dễ dàng, giá rẻ,
hiệu quả, bền và an toàn) cho việc tách chiết, làm sạch và phát hiện 10 độc tố
PSP trong thực phẩm biển bằ ng HILIC-MS/MS ở chế đô ̣ ESI dƣơng.

Nguyễn Thị Nhung

13

Trường ĐHKH Tự Nhiên


-



-

Làm sạch: d-SPE (chất hấp phụ polymeric ABS Elut – NEXUS).

-

Điều kiện sắc kí:
+ Cột: TSK-gel Amide-80 (3 µm; 2,0 x 150 mm).
+ Kênh A: acetonitril 95% với 5% là amoni format 20 mM và acid
formic 26 mM (pH = 3,2).
+ Kênh B: 95% nƣớc và 5% là amoni format 20 mM và acid formic
26 mM (pH = 3,2).
+ Chạy theo chƣơng trình gradient.
Kết quả: Phƣơng pháp cho giới ha ̣n phát hiê ̣n của các PSP là

3 µg/kg,

giới hạn định lƣợng là 7 µg/kg; hiê ̣u suấ t thu hồ i trong khoảng tƣ̀ 98 – 109% tại
mƣ́c thêm chuẩ n LOQ và mƣ́c giƣ̃a đƣờng chuẩ n xây dƣ̣ng .
Aversano [10] đã tiến hành phân tích các độc tố PSP bằng phƣơng pháp
HILIC-MS. Nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát dung môi pha động và lựa chọn

Nguyễn Thị Nhung

14

Trường ĐHKH Tự Nhiên