Header Page 1 of 148.
B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O

B YT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N I

NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ
NGHIÊN C U XÂY D NG QUY TRÌNH TỔNG HỢP
LEVOTHYROXIN MONONATRI VÀ LIOTHYRONIN
MONONATRI TỪ L-TYROSIN

Chuyên ngành: Công nghệ dư c phẩm và bào ch thuốc
Mã số: 62720402
TÓM T T LUẬN ÁN TI N Sƾ DƯỢC HỌC

Hà N i, năm 2016

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.
Công trình này đư c hoàn thành t i:
-

B môn Công nghiệp Dư c, trường Đ i học Dư c Hà N i

-

B môn Bào ch , trường Đ i học Dư c Hà N i


CÁC KÝ HI U, CH

VI T T T

Ch vi t t t

Ch đầy đ hoặc nghƿa ti ng Vi t

13

Phổ c ng hưởng từ h t nhân carbon-13

C-NMR

(Carbon13- Nuclear Magnetic Resonance)
1

H-NMR

Phổ c ng hưởng từ h t nhân proton
(Proton- Nuclear Magnetic Resonance)

Ac

Acetyl (CH3CO-)

Acac

Acetyl acetonat



Phổ hồng ngo i (Infrared
Spectrophotometer)

LD50

Liều ch t trung bình

Me

Methyl (CH3-)

MS

Phổ khối lư ng (Mass Spectrometry)

OECD

Tổ chức H p tác và Phát triển Kinh t
(Organization for Economic Co-operation
and Development)

Rf

Footer Page 3 of 148.

Hệ số lưu giữ (retention factor)


Header Page 4 of 148.

Nhiệt đ nóng chảy

Ts

Tosyl (p-CH3-C6H4-SO2-)

TsOH

Acid p-toluensulfonic

Footer Page 4 of 148.


Header Page 5 of 148.
MỞ Đ U
Tính c p thi t c a lu n án
Kho ng 3 - 5% dân s Vi t Nam bị suy tuyến giáp. B nh gặp ở nhiều
lứa tuổi và nhiều đ i tượng. Trẻ em bị suy giáp sẽ chậm lớn và kém
phát triển trí tu . B nh cũng hay gặp ở phụ nữ có thai, gây hậu qu
nghiêm trọng đến thai nhi. Ngoài s ít trường hợp suy giáp do dùng
thu c kháng giáp có thể hồi phục khi ngưng thu c, còn đa s các
trường hợp khác đều ph i điều trị bằng hormon giáp tr ng c đời.
Hi n nay, nhu cầu s dụng levothyroxin và liothyronin ở nước ta
trong điều trị b nh là khá lớn mà vi c s n xuất nguyên li u trong
nước chưa thực hi n được. Con đường tổng hợp levothyroxin
mononatri và liothyronin mononatri chủ yếu đi t L-tyrosin, nguyên
li u này có thể điều chế bằng phương pháp thủy phân các nguồn
keratin khác nhau như s ng, tóc… Nếu chúng ta tiến hành nghiên
cứu, s n xuất thành công levothyroxin mononatri và liothyronin
mononatri thì sẽ chủ động được nguồn nguyên li u.

liothyronin mononatri t L-tyrosin s n xuất trong nước theo phương
pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco với c i tiến sau:
 Đã thực hi n thành công ph n ứng kh hóa hợp chất 3,5-dinitro4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenylalanin ethyl ester ở điều ki n
áp suất thường.
 Đã c i tiến phương pháp t o mu i mononatri của levothyroxin
và liothyronin bằng cách dùng natri bicarbonat bão hòa thay cho natri
carbonat bão hòa.
2. Lần đầu tiên thực hi n thành công phương pháp t o ether Ullmann
trong tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester
t ph n ứng giữa dẫn chất L-tyrosin và 4-bromoanisol với xúc tác là
mu i đồng (I) iodid và ph i t

sắt (III) acetylacetonat trong môi

trường kali carbonat và dung môi dimethyl formamid.
C u trúc c a lu n án

2

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.
Luận án gồm 135 trang, 50 hình, 38 b ng, 148 tài li u tham kh o. B
cục gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (32 trang), Nguyên li u,
trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (9 trang), Thực nghi m và
kết qu nghiên cứu (65 trang), Bàn luận (25 trang), Kết luận và đề
xuất (2 trang), Tài li u tham kh o (17 trang), Danh mục các công
trình khoa học đã công b liên quan đến đề tài luận án (1 trang),
Danh mục phụ lục (4 trang), Phụ lục (79 trang).

HO

I

I

O

NH

O N a . x H 2O
2

I

Hình 1.4. Công thức cấu t o của liothyronin mononatri hydrat
1.1.3.

Tác dụng dược lý của hormon tuyến giáp

Kích thích các ph n ứng trao đổi làm tăng chuyển hoá cơ b n, tăng
hấp thu glucose ở ruột và tăng phân huỷ glycogen, nên gây tăng
đường huyết, tăng phân huỷ triglycerid, phospholipid và cholesterol,
tăng tổng hợp protein. Không đủ hormon tuyến giáp sẽ gây ra b nh
3

Footer Page 7 of 148.


Header Page 8 of 148.

7

I
1 . I2/KI/base
2e q

I

ONa
N H2

O

NH 2

O
6

HO

I
HO
I

O
I

ON a
NH2


mu i diaryl iodo. Phản ứng oxy hóa: Oxy hóa các phenol. Các
phương pháp khác.
1.4. Phân tích, l a chọn h ớng nghiên c u
Qua tổng quan tài li u và dựa vào xu hướng nghiên cứu trên thế giới
đã tổng kết được có 4 phương pháp tổng hợp 2 nguyên li u t Ltyrosin: Phương pháp 1: Oxy hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo
phương pháp của L. G. Ginger t o levothyroxin; Phương pháp 2:
Ngưng tụ với dẫn chất iodoni iodid của G. Hillmann t o levothyroxin
và liothyronin; Phương pháp 3: Tổng hợp qua dẫn chất nitro của J.
R. Chalmers t o levothyroxin và liothyronin; Phương pháp 4: T o
cầu n i diaryl ether t

dẫn chất của L-tyrosin với acid 4-

methoxyphenylboronic, xúc tác là Cu(OAc)2 theo tác gi A. David
t o levothyroxin và liothyronin.
T các phương pháp trên chúng tôi dự định tiến hành kh o sát để tìm
ra phương pháp phù hợp nhất với điều ki n thiết bị hi n có và có thể
triển khai tổng hợp ở quy mô lớn hơn. Đồng thời nghiên cứu phương
pháp t o ether Ullmann giữa một aryl halogenid và L-tyrosin để t o
liên kết ether của hormon giáp tr ng với hy vọng sẽ có đóng góp mới
về mặt khoa học, sau đó tiến hành nghiên cứu tiếp kh năng ứng
dụng vào thực tế s n xuất.
Ch

ng 2: NGUYÊN LI U, TRANG THI T B VÀ PH
PHÁP NGHIÊN C U

2.1. Nguyên li u
5


- Đ i tượng th : 3 lô đóng lọ PE, tránh ánh sáng.
- Điều ki n th nghi m: Điều ki n lão hóa cấp t c: Nhi t độ 40 
2°C; độ ẩm: 75  5%. Điều ki n thường: Nhi t độ thường 30  2°C;
độ ẩm: 75  5%

6

Footer Page 10 of 148.


Header Page 11 of 148.
- Các chỉ tiêu kh o sát: tính chất, góc quay cực riêng, mất kh i lượng
do làm khô, giới h n t p chất liên quan và hàm lượng (theo USP 34
đ i với liothyronin mononatri và theo BP 2010 đ i với levothyroxin
mononatri).
2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tính cấp
Mô hình liều c định theo hướng dẫn của OECD.
2.3.7. Xử lý và biểu thị các kết quả nghiên c u
Các kết qu nghiên cứu được x lý bằng công cụ th ng kê thích hợp.
Ch

ng 3: TH C NGHI M VÀ K T QU NGHIÊN C U

3.1. T ng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl
ester
Đây là bước t o cấu trúc diaryl ether, là ph n ứng “chìa khóa” của
quy trình. Tổng hợp theo 3 phương pháp sau:
3.1.1. Phương pháp mới tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-Lthyronin ethyl ester (5)-

ng dụng phương pháp tạo ether Ullmann


5

4

Hình 3.2. Ph n ứng t o 5 theo phương pháp Ullmann
3.1.2. Phương pháp c a J. R. Chalmers và P. Bracco

7

Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.
O
O
OH
NH

HO

H N O /H SO
3 2 4

2

NH

HO



M eO

1 . T s Cl / p y r id i n

OEt

HO

N H Ac

HO

N O2

8 9, 1 %

3

O

O 2N

OE t

9 2, 5 %

N O2

7 7, 1 %

2
2

I

M eO

1 . N aN O / H S O , Ac OH
2 2 4

OE t
N H Ac

O
8 9, 1 %

I

28

5

Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp 5 theo phương pháp J. R. Chalmers và P. Bracco

3.1.3. Phương pháp c a G. Hillmann
O

O
OH


O
I

A c 2O / N aO H

OH

I

32

E tO H , Ts O H
8 8, 0 %
N a I O 3, A c 2O , A c O H
H 2S O 4, K I
M eO

O
I
M eO

I

I

OMe

OE t

+



Header Page 13 of 148.
3.2. T ng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin
Dùng 2 tác nhân: HBr 47% hoặc HI 57%:
OEt
NHAc

O
5

O

a. HBr 47% / AcOH
87,1 %

O
I

MeO

I

HO

b. HI 57% / AcOH
92,4 %

I



86,4 %

I

O
1

NH2
I

OH
NH2
I

3.3.2. Tinh chế levothyroxin
Kết tinh qua d ng mu i dinatri.
K t qu : tonc: 235-236oC; Rf = 0,22 [NH4OH-2-C3H7OHCH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: không có pic l , thời gian lưu
mẫu th và mẫu chuẩn bằng nhau (tR = 5,8 phút). Điều ki n sắc ký:
Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid
H3PO4 trong 1000,0 mL. T c độ dòng: 1,5 mL/phút. Cột C18 Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết quả
phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3243 (OHphenol); 3080 (CHthơm); 1638 (C=Ocarboxylic); 2974 và 2885 (C-Hno); 2599 (N+-Hmu
phân t
ether);

); 1638 (C=Ocarboxylat mu

i nội phân t

i nội

ng

Ph

ng pháp J.

Ph

ng pháp

pháp G.

R. Chalmers và

t o ether

Hillmann

P. Bracco

Ullmann

7

8

5

33,3



khác

tinh chế, hi u

ki n hi n có. Quy

suất thấp

trình khá ổn định.

(12,2%)

Không dùng iod
t đầu.
10

Footer Page 14 of 148.

Phương pháp
mới, khó tinh
chế s n phẩm
của ph n ứng
ether hóa, dùng
iod ngay t
ph n ứng đầu.


Header Page 15 of 148.
3.3.4. Tạo levothyroxin mononatri (8)

Na2C O3 bh

I

8

ONa
NH2
I

K t qu : tonc: 206,5-208,9 (phân hủy); Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH
(70:15:15)] = 0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C = 2 trong HCl
0,2M / EtOH 96%); Hàm lượng: 97,9 %; Kết quả phân tích phổ: IR
(KBr), υmax (cm-1): 3458 (NH2); 3060 (C-Hthơm); 2910 (C-Hno); 1591
(C=Ocarboxylat); 1534 (C=C

thơm);

1242 và 1137 (C-Odiaryl ether); 543 và

436 (C-I). ESI-MS (m/z): 799,4 [M+H]+ (CTPT C15H10I4NNaO4, M =
798,85). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd,
2

JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a =

14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b
13

= 4,5 Hz, H-2); 7,0 (2H, s, H-2’’, H-6’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’).


I

11

Footer Page 15 of 148.

O

HO

ON a
NH2
I


Header Page 16 of 148.
K t qu : tonc: 207-209oC; Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH (70:15:15)] =
0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C=2 trong HCl 0,2M/ EtOH 96%).
3.4. T ng hợp và tinh ch liothyronin mononatri
Gồm 2 giai đo n: Tổng hợp liothyronin t

3,5-diiodo-L-thyronin

(tinh chế qua mu i dinatri); và T o mu i mononatri (kh o sát với 2
tác nhân t o mu i là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa).
O
HO

I

HO

I

I

O

HCl 1 N

OH
NH2

2

I

NaO

I

I

O
37

ONa
NH2
I



và 1496 (C=Cthơm); 1246 và 1175 (C-Odiaryl ether); 534 (C-I). ESI-MS
(m/z): 651,6 [M+H]+ (CTPT C15H12I3NO4, M = 650,97). 1H-NMR
12

Footer Page 16 of 148.


Header Page 17 of 148.
(500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 2JH3a-H3b = 14,0 Hz,
3

JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 =

4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2-H3b = 4,5 Hz, H-2);
6,6 (1H, dd, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, 4JH5’’-H3’’ = 3,0 Hz, H-5’’); 6,8 (1H, d,
JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, H-6’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’-H6’’ = 3,0 Hz, H-2’’); 7,8

3

(2H, s, H-2’, H-6’). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 34,9
(C-3); 54,9 (C-2); 84,5 (C-3’’); 91,9 (C-3’, C-5’); 115,1 (C-5’’);
116,2 (C-6’’); 124,4 (C-2’’); 138,8 (C-2’, C-6’); 140,8 (C-1’); 148,9
(C-4’); 151,9 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 169,1 (C=Ocarboxylic).
Liothyronin mononatri:
Kh o sát 2 phương pháp t o mu i mononatri với 2 tác nhân t o mu i
là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa. Hi u suất t o mu i của 2
phương pháp tương đương nhau (71,1 %).
K t qu : tonc: 205-206°C (phân hủy); Rf = 0,31 [CHCl3 - MeOH HCOOH (70:15:15)]; Hàm lượng: 98,2%; Kết quả phân tích phổ:
IR (KBr), υmax (cm-1): 3389 (NH2); 2963 (C-Hthơm); 1618

H N O 36 8 % /H 2S O 4 9 8 %

N -A C E T Y L H Ó A

A c 2O / N a O H 2 N

E ST ER H ÓA

E t O H / S O C l2

E TH ER H ÓA

p -m e t h o x y p h e n o l/p y r i d in

T s C l / p y ri d i n

K H HÓ A
á p s u ấ t t h ườ n g

H 2/ P d -C

D IA Z O H Ó A
IO D O H Ó A
(o n e p o t)

N a N O 2/ H 2S O 4 9 8 % , A c O H
I 2/K I

H B r 4 7 % /A c O H


Footer Page 18 of 148.


Header Page 19 of 148.
Kh i lượng L-tyrosin: 525,0 g. Hi u suất toàn chặng: levothyroxin
mononatri đ t 27,4 %, liothyronin mononatri đ t 23,0 %. Các ph n
ứng cho hi u suất tương đ i ổn định.
3.6. Kiểm tra ch t l ợng s n phẩm theo tiêu chuẩn d ợc điển
Nguyên li u liothyronin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu chuẩn
theo USP 34 và levothyroxin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu
chuẩn theo BP 2010.
3.7. Đánh giá độ n đ nh c a s n phẩm
S li u độ ổn định ở điều ki n lão hóa cấp t c cho thấy 2 s n phẩm
không có biến đổi đáng kể về các chỉ tiêu chất lượng đã theo dõi. Dữ
li u độ ổn định dài h n cho thấy hàm lượng trong giới h n qui định.
Tuổi thọ của levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri được
dự đoán lần lượt là 26 tháng và 30 tháng.
3.8. Đánh giá độc tính c p
C hai nguyên li u không độc, không xác định được LD50.
Ch

ng 4: BÀN LU N

4.1. V t ng hợp hóa học
4.1.1. Các phương pháp tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin
Qua tổng quan tài li u chúng tôi tìm được 5 phương pháp tổng hợp
levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri t L-tyrosin. Trong
đó có 2 phương pháp chúng tôi không kh o sát: Phương pháp oxy
hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo phương pháp của L. G.
Ginger; và Phương pháp t o cầu n i diaryl ether t dẫn chất của Ltyrosin với acid 4-methoxyphenylboronic, xúc tác là Cu(OAc)2 theo

81 %. Không chỉ d ng ở đó, đến năm 2010, hai tác gi người Trung
Qu c là Xiaoyan Liu và Songlin Zhang cùng cộng sự đã tiếp tục c i
tiến phương pháp t o ether Ullmann kết hợp xúc tác Cu/Fe đã làm
gi m đáng kể lượng chất xúc tác. Các tác gi này đã tổng hợp thành
công cấu trúc diaryl ether của hàng chục chất với quy mô lớn và hi u
suất tương đ i t t. Nghiên cứu của Xiaoyan Liu và Songlin Zhang
cùng cộng sự t o ý tưởng cho chúng tôi trong quá trình tìm kiếm
phương pháp mới tổng hợp cấu trúc diaryl ether của hormon giáp
tr ng. Chúng tôi th nghi m ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether giữa
3,5-diiodo-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester và 4-bromoanisol với xúc
tác là các nguồn đồng và ph i t là các nguồn sắt. Nghiên cứu bước
đầu cho thấy, ph n ứng có nhiều ưu điểm như: d tiến hành, thích
16

Footer Page 20 of 148.


Header Page 21 of 148.
hợp để nâng cấp quy trình. Tuy nhiên cũng có một s vấn đề cần
khắc phục như khi tiến hành ph n ứng ph i đặc bi t tránh nước, tất c
các chất tham gia ph n ứng cũng như dung môi ph i đ m b o khan
để hợp chất 4-brommoanisol không bị thủy phân t o ra hợp chất
phenol. Đồng thời khi kết thúc ph i tiến hành x lý ngay để tránh
ph n ứng thủy phân s n phẩm trong môi trường kiềm.
Về cơ chế của ph n ứng, theo Ying-Peng Zhang và cộng sự, có thể
gi i thích như sau:
PhOH

Fe(acac)3 HO-Cu-OPh
Fe(acac)3

O
O
Cu
O
O

d

HO→Cu←OPh
a

17

Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.
Cu (I) thường t o phức với s ph i trí 2, do đó nếu dùng xúc tác Cu
(I) thì ưu tiên phức (a). Cu (II) thường t o phức với s ph i trí 4, do
đó nếu dùng xúc tác Cu (II) thì ưu tiên phức (d). Phức (a) tham gia
vào chu trình ph n ứng theo cơ chế ph n ứng đã đề cập ở trên nên
hi u suất ph n ứng cao nhất khi dùng xúc tác CuI.
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của phối tử: ph i t Fe(acac)3 cho
hi u suất ph n ứng cao nhất, có thể gi i thích do có cấu trúc phức
chất khác hẳn cấu trúc thông thường của các ph i t khác nên kh
năng tham gia ph n ứng của ph i t sắt (III) acetylacetonat cao nhất.
Mặc dù hi u suất của ph n ứng t o ether theo phương pháp Ullmann
tương đ i cao nhưng do thời gian nghiên cứu h n hẹp và nguyên li u
đắt tiền là iod l i được dùng ngay t ph n ứng đầu tiên của quy trình
nên vi c áp dụng để triển khai s n xuất trong thời điểm này là chưa


O Ts
T sC l

O2 N

N O2

O CH 3

+
N
H

R
N

26

Cl
R
tosylat ester

N
H3 C O

N
H

27

tăng đáng kể hi u suất, gi m lượng 4-methoxyphenol s dụng.
Phương pháp của P. Bracco không chỉ làm tăng hi u suất của ph n
ứng mà vi c tách và tinh chế chế s n phẩm của ph n ứng cũng được
đơn gi n hóa so với phương pháp của J. R. Chalmers. Vi c tiến hành
ph n ứng một giai đo n trong pyridin cho thấy quy trình thích hợp để
triển khai quy trình ở quy mô lớn hơn.

19

Footer Page 23 of 148.


Header Page 24 of 148.
Ph

ng pháp qua muối iodoni c a G. Hillmann: Tổng hợp 6 theo

con đường qua mu i iodoni qua 5 giai đo n. Hi u suất 3 ph n ứng
đầu tiên tương đ i cao, hi u suất toàn chặng 33,3% (không tính hi u
suất ph n ứng tổng hợp mu i iodoni). Riêng ph n ứng tổng hợp mu i
iodoni, dùng đến các nguyên li u natri iodat và kali iodid đắt tiền,
nhưng cho hi u suất rất thấp (12,3%). Hơn nữa, s n phẩm khó tinh
chế và d gây nổ. Do vậy khó làm ph n ứng với cỡ mẻ lớn hơn. Một
s kh o sát thay đổi tỉ l natri iodat và anhydrid acetic nhưng không
tăng được hi u suất ph n ứng.
4.1.2. Về quá trình tổng hợp levothyroxin và liothyronin từ 3,5diiodo-L-thyronin
Vi c định hướng s n phẩm của ph n ứng iodo hóa 3,5-diiodo-Lthyronin (6 hoặc T2) để được levothyroxin hay liothyronin khác nhau
ở tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin, t c độ tiến hành ph n ứng iodo
hóa và nhi t độ của ph n ứng. Với tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin
= 1/1 thì quá trình iodo hóa chủ yếu x y ra ở 1 vị trí ortho- so với

X

O

HO

I

I

O

OH

pH < 8
X

O

NaO

I

I

O

N H2
I



T phân tích trên, về mặt lý thuyết cho thấy có thể dùng NaHCO3
thay cho Na2CO3 để t o mu i mononatri mà không cần dùng acid
điều chỉnh về pH của hỗn hợp ph n ứng về 9-10. Do đó, chúng tôi đã
21

Footer Page 25 of 148.