ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN MẠNH CƢỜNG
Tên đề tài:
TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG CẤP 1 NẤM
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012-2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM


i

Lời cảm ơn
Trong suốt quá trình thực tập tại Phòng nghiên cứu và sản xuất nấm
Đông trùng hạ thảo - Viện Khoa Học Sự Sống - Đại học Thái Nguyên, em đã
nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy
cô hƣớng dẫn, bạn bè và gia đình.
Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS. Dƣơng Văn
Cƣờng, ThS. Bùi Tuấn Hà giảng viên Khoa CNSH - CNTP, đã hƣớng dẫn tận
tình và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khoá luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Ma Thị Trang, KS. Vũ Hoài Nam
ngƣời đã hƣớng dẫn em một số thao tác thực hành và vận hành thiết bị giúp
em hoàn thành tốt khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP,
trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong
quá trình học tập và hoàn thành khoá luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời
đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện
khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái nguyên, tháng 05 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Mạnh Cƣờng


i


và môi trƣờng P10 sau 25 ngày nuôi cấy. .................................................................36
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện sự sinh trƣởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris
ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau ...........................................................................38
Hình 4.7 Sự sinh trƣởng của nấm Cordyceps militaris trên hai điều kiện
nhiệt độ khác nhau trong 25 ngày. ............................................................................39
Hình 4.8. Biểu đồ thể hiện sự sinh trƣởng của hệ sợ nấm Cordyceps militaris
ở các điều kiện pH khác nhau....................................................................................41
Hình 4.9 Sự sinh trƣởng của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trƣờng
có pH lần lƣợt là 5,6 ..................................................................................................42


iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

CB

:Môi trƣờng dinh dƣỡng gồm (Glucose,
Yeast, Peptone, Sucrose)

C. sinensis

:Cordyceps sinensis

CT

:Công thức

ĐTHT


1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
Phần 2 TổNG QUAN TÀI LIệU ....................................................................... 4
2.1. Cơ sở khoa học ........................................................................................... 4
2.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ Thảo ................................................................... 4
2.1.2. Nấm Cordycep militaris .......................................................................... 5
2.2. Giá trị dƣợc liệu của nấm ........................................................................... 9
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .............................................. 15
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 15
2.3.2 Tình hình Nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 18
Phần 3 ĐốI TƢợNG, NộI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ...... 21
3.1. Đối tƣợng (vật liệu) .................................................................................. 21
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 21
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 21
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................ 21
3.2.1. Địa điểm ................................................................................................ 21
3.2.2. Thời gian tiến hành ............................................................................... 22
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 22
3.4.1 Những môi trƣờng cơ bản đƣợc sử dụng ............................................... 22


v

3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành .......................................................................... 23
3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi, phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu ...................... 26
Phần 4 KếT QUả NGHIÊN CứU VÀ THảO LUậN ....................................... 28
4.1. Kết quả nghiên cứu sự sinh trƣởng của nấm Cordyceps militaris
trên môi trƣờng cơ bản để xác định môi trƣờng tối ƣu. ................................. 28
4.2. Kết quả Nghiên cứu ảnh hƣởng của Nhộng tằm đến sự sinh trƣởng

chất tƣơng tự nucleoside có các hoạt tính sinh học bao gồm kháng khuẩn,
kháng nấm, kháng u, hoạt động kháng virus [5],[39]. Ngoài ra, Cordycepin
còn có tiềm năng điều trị ung thƣ và u ác tính [12]. Adenosine có nhiều tác
dụng dƣợc lý, nó có thể điều trị suy tim mãn tính. Hơn nữa, đã có nghiên cứu
chỉ ra rằng adenosine có tác dụng ức chế các bệnh về thần kinh, trong đó bao
gồm quy định của giấc ngủ, mức độ hƣng phấn, giảm đau [33]. Mannitol
đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc lợi tiểu, chống các chứng ho ra máu [23].
ĐTHT còn có chứa nhiều loại vitamin (trong 100g ĐTHT có 0,12g vitamin
B12; 29,19mg vitamin A; 116,03mg vitamin C; vitamin B2; vitamin E;
vitamin K…), ngoài ra còn có khoảng 25 – 30 % protein.


2

Trên thế giới các nhà khoa học đã nghiên cứu nấm ĐTHT từ sớm.
Những hợp chất quý có trong nấm đƣợc nghiên cứu kĩ hơn để sử dụng cho
mục đích y học. Lƣợng nấm thu hoạch ngoài thiên nhiên mỗi năm không
nhiều, chƣa đủ đáp ứng nhu cầu thị trƣờng nên việc nghiên cứu để nuôi trồng
nhân tạo rất đƣợc quan tâm. Với nền khoa học công nghệ phát triển, nhiều
nƣớc đã nuôi trồng thành công nấm trên chất nền rắn và áp dụng cho quy mô
sản xuất công nghiệp.
Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm ĐTHT còn hạn chế.
Các công trình đã đƣợc công bố về loài nấm dƣợc liệu quý này mới chỉ dừng
lại ở việc phát hiện một số chủng có trong tự nhiên. Để nuôi trồng nhân tạo
thành công nấm ĐTHT, cần phải có một chủng giống tốt và môi trƣờng thích
hợp để nhân nuôi hệ sợi. Hiện nay, các tài liệu nghiên cứu về giai đoạn này
còn khá hạn chế. Hơn nữa, đây cũng là bƣớc quan trọng có sự ảnh hƣởng trực
tiếp tới sự thành công của quá trình nuôi trồng nhân tạo nấm.
Xuất phát từ thực tiễn đó, cũng nhƣ góp phần vào nghiên cứu môi
trƣờng nuôi cấy Đông trùng hạ thảo tại Việt Nam tôi tiến hành thực hiện đề

4

Phần 2
TổNG QUAN TÀI LIệU
2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ Thảo
“Dong Chong Xia Cao” (Đông trùng hạ thảo) là tên gọi của loài nấm
Ophiocordyceps sinensis ký sinh trên ấu trùng của loài bọ cánh phấn. Trong y
học của Tây Tạng loài nấm này có tên là "yartsa gunbu", còn trong y học
Trung Quốc có tên là “Dong Chong Xia Cao” (mùa Đông là sâu, mùa hè là
cỏ). Đông trùng hạ thảo là một phƣơng thuốc đã đƣợc sử dụng trong y học cổ
truyền Trung Quốc trong hơn 700 năm [26].
Ngoài ra, tên gọi “Dong Chong Xia Cao” còn đƣợc công nhận với ý
nghĩa rộng hơn ở Trung Quốc nhƣ sau [26] :
- Các loại dƣợc liệu có nguồn gốc từ O. sinensis (syn. C. sinensis).
- Thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ O. sinensis.
- Các loại nấm O. sinensis.
- Các loại nấm Cordyceps spp.
- Các loại nấm Ophiocordyceps spp.
- Các loại dƣợc liệu thiên nhiên có quả thể mọc ra từ sâu bƣớm.
- Các sợi nấm của O. sinensis có nguồn gốc từ nuôi cấy.
- Các sợi nấm của H. sinensis có nguồn gốc từ nuôi cấy.
- Các loại dƣợc liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của hepialidae
(Lepidoptera) bị ký sinh bởi O. sinensis.
- Các loại dƣợc liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của thitarodes
(syn. Hepialus) bị ký sinh bởi O. sinensis.
- Các loại dƣợc liệu cổ truyền có nguồn gốc từ ấu trùng của T.
armoricanus (syn. H. armoricanus) bị ký sinh bởi O. sinensis.




Bộ

:Hypocreales

Họ

:Clavicipataceae

Chi

:Cordyceps

Loài

:Cordyceps militaris

Dƣới đây là tên thƣờng gọi của nấm Cordyceps militaris [14] :


6

Bảng 2.1: Một số tên gọi của nấm Cordyceps militaris
Tên thƣờng gặp

Caterpillar

fungus,

Cordyceps,

Chong cao, Dong chong cao, Aweto

khác
Ký chủ phổ biến nhất của nó trong tự nhiên bao gồm ấu trùng của bọ
cánh phấn (sâu bƣớm) và nhộng, có thể ký sinh lên ấu trùng của bọ cánh
cứng, bộ cánh màng và cả côn trùng nhỏ.
Ký chủ bọ cánh phấn của Cordyceps militaris thuộc các họ khác nhau
gồm [30] :
Scarabaeidae,
Arctiidae,

Scolytidae,

Bombycidae,

Lasiocampidae,

Drepanidae,

Lymantriidae,

Sphingidae, Thyatiridae.

Tenebrionidae,

Noctuidae,

Tipulidae,

Cimbicidae,

phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn
các chất dinh dƣỡng trong cơ thể sâu. Đến một giai đoạn nhất định thƣờng là
vào mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra khỏi sâu nhƣ một ngọn cỏ và vƣơn
lên khỏi mặt đất phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát


8

tán bào tử. Các bào tử nấm sống bên trong ấu trùng và phát triển. Nấm sẽ tạo
ra chất nền, từ đó mọc lên quả thể. Quả thể có dạng màu cam, gắn không
chắc chắn trên cơ thể ký chủ. Những quả thể sẽ phát triển đến một độ dài
khoảng 2-8 cm và có chiều rộng khoảng 0,5 cm [12].


Sơ lược nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis và

Cordyceps militaris
Đông trùng hạ thảo là một loại nấm dƣợc liệu truyền thống nổi tiếng
của Trung Quốc. Các loài Cordyceps là một nguồn tài nguyên rất đa dạng và
phong phú của tự nhiên với những hoạt tính sinh học hữu ích [14]. Một số
loài Cordyceps từ lâu đã đƣợc sử dụng cho mục đích y tế ở Trung Quốc,
Nhật Bản và Hàn Quốc và các nƣớc Đông Á khác vì nhiều hoạt tính sinh học
và dƣợc lý của chúng mà thƣờng là do sự hiện diện của các thành phần có
hoạt

tính

sinh

học


chống lại chứng thiếu máu não cục bộ, chống mệt mỏi, điều trị hen suyễn,
tạo hồng cầu, ổn định nhịp tim, chống lão hóa, tăng cƣờng testosterone, an
thần, ngăn ngừa và điều trị các tổn thƣơng ruột, nâng cao thể lực và tăng độ
bền bỉ, cải thiện trí, ngăn chặn đào thải tế bào, và làm giảm bớt bệnh lupus
[26].
So với Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris dễ dàng nuôi hơn trong
cả môi trƣờng rắn và chất lỏng với nguồn dinh dƣỡng nhiều carbon và nguồn
nitơ. Cordyceps militaris cũng đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền của
Trung Quốc trong một thời gian dài. Gần đây, Cordyceps militaris ngày càng
đƣợc xem nhƣ là một nguồn thay thế cho Cordyceps sinensis vì các chất có
hoạt tính sinh học và tính chất dƣợc liệu tƣơng tự nhau [15],[17],[37]. Hơn
nữa, nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng Cordyceps militaris chứa
nhiều loại thành phần có hoạt tính nhƣ cordycepin, ergosterol, mannitol và
polysaccharides, và thể hiện các chức năng dƣợc lý. Nó bây giờ đã đƣợc sử
dụng cho nhiều mục đích y tế do các hoạt động sinh lý khác nhau
[14],[16],[29].
Khoa học phát triển, ngày nay loài ngƣời đã phát hiện hàng trăm loài
nấm Đông trùng hạ thảo trên 6 lục địa ở các điều kiện sống rất khác nhau
nhƣng đều có những giá trị dƣợc liệu tƣơng tự. Chi nấm Cordyceps đã đƣợc
thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại
truyền thống các loài này đƣợc xếp vào họ Clavicipitaceae [31].
2.2. Giá trị dƣợc liệu của nấm
Cordyceps militaris là loại nấm dƣợc liệu mọc lên từ cơ thể của các loài
côn trùng cánh phấn. Quả thể nấm có màu cam đặc trƣng và chứa rất nhiều
những hoạt chất quý giá. Đã có rất nhiều nhà nghiên cứu phân tích đƣợc một
số thành phần các hoạt chất có trong nấm Cordyceps militaris nhƣ cordycepin
(3'-deoxyadenosine), ergothioneine, ergosterol, D-mannitol, γ-aminobutyric



9787
Mycelia

3.29 × 104

Adenine

2.9

2.8

Guanine

18.5

175.2

Uracil

37.1

105.0

Adenosine

91.1

52.6

Guanosine


Guanine

23.2

271.7

Uracil

29.2

185.2

Adenosine

45.4

132.0

Guanosine

41.3

97.8

Urideine

45.4

122.6

các thành phần quan trọng trong Cordyceps militaris [21].
Adenosine có nhiều tác dụng dƣợc lý, nó có thể điều trị suy tim mãn tính
và ức chế sự dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ƣơng. Các
nucleosides khác cũng có thể đƣợc sử dụng để điều trị nhiều bệnh khác nhau.
Ví dụ, Ribeiro (1995) thấy rằng adenosine ức chế sự dẫn truyền hệ thần kinh
kích thích. Dunwiddie & Masino (2001) nhận thấy rằng adenosine là một bộ
điều biến có tác dụng ức chế và tổng hợp về hoạt động thần kinh, trong đó
bao gồm quy định của giấc ngủ và mức độ hƣng phấn, rối loạn thần kinh, quy
định về giữ tính nhạy cảm, vận động, giảm đau, điều hòa những tác động của
ethanol và chất gây nghiện. Tabrizchi & Bedi (2001) xem xét các đặc tính của
phân nhóm của các thụ thể adenosine trong mạch máu, cũng nhƣ ảnh hƣởng
của các thụ thể adenosine trên hệ tuần hoàn ngoại biên. Carlezon et al. (2005)
nhận thấy rằng cytidine có tác dụng chống trầm cảm giống nhƣ trong các thử
nghiệm bơi ở chuột [12].
-

Cordycepic acid (D-mannitol)(C6H14O6)
Cordycepic acid, một chất đồng phân của axit quinic, là một trong những

thành phần dƣợc phẩm chính hoạt động. Cordycepic acid đã đƣợc xác định là
D-mannitol. Mannitol là một chế phẩm sinh học với hoạt động sinh học quan
trọng. Hàm lƣợng của mannitol trong loài Cordyceps thay đổi theo môi
trƣờng sống. Nghiên cứu cho thấy, có khoảng 25-80 mg/g ở trong quả thể
nấm [9],[24].
- Polysaccharides
Một số polysaccharides và đƣờng khác đã đƣợc xác định có trong chiết
xuất Cordyceps militaris và các hoạt động dƣợc lý của chúng đã đƣợc nghiên
cứu. Những polysaccharides có hiệu quả trong việc điều chỉnh lƣợng đƣờng



14

Tuy nhiên, ergothioneine là hầu nhƣ chỉ đƣợc sản xuất bởi nấm và một số
sinh vật nhân sơ [7]. Ergothioneine chỉ có thể đƣợc hấp thụ từ chế độ ăn uống
và không thể tự sinh tổng hợp đƣợc ở ngƣời.
Tổng hợp một số công dụng chính của nấm Cordyceps militaris
Cordyceps militaris là nguồn dƣợc liệu giàu tiềm năng sinh học do chứa
các chất chuyển hóa cho nhiều loại thuốc và có những ghi chép về các ứng
dụng của nó đối với sự phục hồi của các cơ quan trong cơ thể. Một số những
hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps militaris đã đƣợc tổng hợp lại nhƣ sau
[14] :
- Cải thiện chức năng tình dục,
- Chống viêm,
- Chống oxy hóa/chống lão hóa,
- Kháng khối u/ kháng ung thu/ điều trị bệnh bạch cầu,
- Ngăn sự phát triển của các khối u,
- Ngăn chặn di căn,
- Điều hòa miễn dịch,
- Kháng khuẩn,
- Kháng virus,
- Kháng nấm,
- Ngăn chặn các bệnh về xơ hóa,
- Hạ đƣờng huyết,
- Hạ lipid trong máu,
- Ức chế quá trình tạo mạch (giúp ngăn ngừa di căn),
- Chống đái tháo đƣờng,
- Chống lại HIV,
- Chống lại bệnh sốt rét,
- Chống mệt mỏi,




16

militaris phát triển trên cơ thể ấu trùng dƣới điều kiện thông thoáng. Do đó,
khi nuôi trên môi trƣờng rắn thì điều kiện khá thích hợp, sợi nấm có thể lan
rộng trên bề mặt của môi trƣờng rắn, trong đó không khí có thể lƣu thông
giữa quả thể của nấm. Hơn nữa các báo cáo trƣớc đây đã chứng minh rằng
trên quả thể của nấm có chứa nhiều các hoạt tính sinh học hơn trong các sợi
nấm [12]. Do đó, môi trƣờng rắn đã đƣợc tập trung nghiên cứu và đƣợc coi
nhƣ một công nghệ đầy hứa hẹn cho việc nuôi trồng để sản xuất quả thể nấm
Cordyceps militaris. Trong 20 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm cách trồng
nấm trên môi trƣờng rắn. Trong ống nghiệm, quả thể nấm đã đƣợc trồng
thành công trên môi trƣờng có giá thể là gạo lứt (Choi et al, 1999; Sung et al.,
2002) [12]. Tuy nhiên, việc sản xuất quả thể nấm không đƣợc ổn định đã trở
thành một vấn đề quan trọng đối với việc khai thác quy mô lớn các hợp chất
sinh học có hoạt tính từ trong nấm Cordyceps militaris. Để khắc phục vấn đề
này, bào tử hữu tính đã đƣợc tìm thấy bằng cách cấy các chủng đơn bào tử
vào trong môi trƣờng nhộng gạo. Mặc dù công nghệ này đã cải thiện đáng kể
chất lƣợng quả thể nhƣng lại không phù hợp với ngƣời nông dân, vì công
nghệ này đòi hỏi phải có một số kiến thức cơ bản về di truyền nấm cũng nhƣ
cần phải có một phòng thí nghiệm cơ bản. Hiện nay, đã có một số nƣớc
nghiên cứu thành công quá trình nuôi cấy nấm và tối ƣu hóa các điều kiện để
có thể tạo ra nồng độ các hoạt chất cao nhƣ:
- Năm 2012, tại Malaysia, các nhà khoa học gồm LekTeng Lim,
ChiaYen Lee, & EngThuan Chang đã tiến hành nghiên cứu: Tối ƣu hóa các
điều kiện nuôi cấy nấm trên môi trƣờng rắn để sản xuất Adenosine,
Cordycepin, và D-mannitol trong quả thể của nấm dƣợc liệu Cordyceps
militaris (L.:Fr.) Link (Ascomycetes) [22].
- Năm 2013 Tang Jiapeng, Liu Yiting, and Zhu Li [40] ba nhà khoa học

chống oxy hóa và đăc biệt là khả năng úc chế hoạt động của HIV-1 protease .