BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

KHẢO SÁT VÀ TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY IN VITRO CÂY SẦU RIÊNG
(DURIO ZIBETHINUS MURRAY)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP-DƯỢC-MÔI TRƯỜNG
CBHD: TS. Đỗ Thường Kiệt
ThS. Nguyễn Trần Đông Phương
SVTH: Huỳnh Lê Anh Chí
MSSV: 1153010083
Khóa: 2011 – 2015
GVHD ký xác nhận:

Đỗ Thường Kiệt

Nguyễn Trần Đông Phương

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn ban Giám Hiệu, ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ sinh học trường Đại học Mở Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em được học tập và
rèn luyện trong môi trường tốt nhất.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả các quý thầy cô khoa Công nghệ

: N6 – benzyladenin.

NAA

: 1 – Naphthaleneacetic acid.

PVP

: Polyvinylpyrrolidone.

WSSP

: White Spot Syndrome Virus.

cm

: Centimet.

mm

: milimet.

ii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng I.1: Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g cơm Sầu Riêng ............................ 8
Bảng II.1: Bảng thể hiện cách bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo
chồi in vitro cây Sầu Riêng ...................................................................... 22
Bảng II.2: Bảng thể hiện cách bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của độ thoáng khí đến sự

Bảng III.7: Đặc điểm chồi Sầu Riêng in vitro được nuôi cấy 6 tuần trên môi trường
MS bổ sung PVP ở các nồng độ khác nhau. ............................................ 42
Bảng III.8: Tỷ lệ tạo rễ, số rễ, chiều dài rễ của chồi Sầu Riêng in vitro được nuôi cấy
6 tuần trên môi trường MS có bổ sung NAA 4 mg/l và bổ sung than hoạt
tính ở các nồng độ khác nhau. ................................................................. 44

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Cây Sầu Riêng ................................................................................................ 6
Hình I.1: Auxin ......................................................................................................... 14
Hình I.2: Cytokinin ................................................................................................... 15
Hình I.3: Casein hydrolysate [29] ............................................................................. 18
Hình II.1: Phôi hột Sầu Riêng khi cấy vào môi trường. ........................................... 22
Hình II.2: Hệ thống thùng xốp để điều chỉnh nhiệt độ. ............................................ 22
Hình II.3: Sơ đồ mô tả các thùng xốp để điều chỉnh nhiệt độ. ................................. 22
Hình II.3: Đóng nắp chai bằng nút gòn (A), bịch nilon (B) và nút cao su (C) dùng
trong thí nghiệm khảo sát độ thoáng khí. ................................................ 24
Hình II.4: Quy trình nhuộm hai màu......................................................................... 28
Hình III.1: Chồi bất định (dấu mũi tên) phát triển từ phôi Sầu Riêng được nuôi cấy 3
tuần trên môi trường MS có bổ sung BA 5 mg/l lần lượt ở các nhiệt độ 25
± 2 0C (A), 27 ± 3 0C (B), 32 ± 3 0C (C) và 37 ± 3 0C (D). ..................... 31
Hình III.2: Chồi bất định (dấu mũi tên) phát triển từ phôi Sầu Riêng được nuôi cấy 8
tuần trên môi trường MS có bổ sung BA 5 mg/l lần lượt ở các nhiệt độ 25
± 2 0C (A), 27 ± 3 0C (B), 32 ± 3 0C (C) và 37 ± 3 0C (D). ..................... 33
Hình III.3: Chồi bất định (dấu mũi tên) phát triển từ phôi Sầu Riêng được nuôi cấy 8
tuần trên môi trường MS có bổ sung BA 5 mg/l ở các điều kiện thoáng
khí. ........................................................................................................... 35
Hình III.4: Chồi bất định (dấu mũi tên) phát triển từ phôi Sầu Riêng được nuôi cấy 8

DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... v
MỤC LỤC .................................................................................................................vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN .................................................................................. 4
I.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 5
I.1

Giới thiệu cây Sầu Riêng ........................................................................................ 5

I.1.1

Họ Malvaceae [16] [45] ................................................................................... 5

I.1.2

Vị trí phân loại [21] [42] .................................................................................. 6

I.1.3

Phân bố, sinh thái, sinh trưởng và phát triển [21] [47] .................................... 7

I.1.4

Thành phần hóa học [25] [46].......................................................................... 8

I.2


I.4.2

Vai trò của nuôi cấy mô thực vật [12] ........................................................... 13

I.5

Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật [19] [26] [36] .............................. 14

I.5.1

Auxin ............................................................................................................. 14

I.5.2

Cytokinin [31] [39] ........................................................................................ 15

I.6

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô [26] ......................................... 16

I.6.1

Ánh sáng ........................................................................................................ 16

vii


I.6.2


I.6.10

Casein hydrolysate [5] [29]............................................................................ 18

I.6.11

Oligosacharide [43]........................................................................................ 19

I.6.12

Polyvinylpyrrolidone (PVP) [9] [18] ............................................................. 19

PHẦN 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ....................................20
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY................................................. 21
II.1

Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................................ 21

II.2

Vật liệu thực vật .................................................................................................... 21

II.3

Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 21

II.3.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo chồi bất định từ sự nuôi cấy
phôi hột Sầu Riêng. ...................................................................................................... 21
II.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của độ thoáng khí đến sự tạo chồi bất định từ sự nuôi
cấy phôi hột Sầu Riêng. ............................................................................................... 23

III.1.2 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến sự tạo chồi bất định từ sự nuôi cấy phôi hột
Sầu Riêng. .................................................................................................................... 34
III.1.3 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tạo chồi bất định từ sự nuôi cấy phôi hột
Sầu Riêng. .................................................................................................................... 36
III.1.4 Ảnh hưởng của casein hydrolysate đến sự tạo chồi bất định từ sự nuôi cấy phôi
hột Sầu Riêng. .............................................................................................................. 38
III.1.5 Ảnh hưởng của oligosacharide đến sự tạo chồi bất định từ sự nuôi cấy phôi hột
Sầu Riêng. .................................................................................................................... 40
III.1.6 Ảnh hưởng của polyvinylpyrrolidone (PVP) đến sự sinh trưởng của chồi Sầu
Riêng in vitro. .............................................................................................................. 42
III.1.7

Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tạo rễ của chồi Sầu Riêng in vitro...... 43

III.2 Thảo luận [1] [3] [6] [8] [11] [22] [24] [26] [33] .................................................. 47

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................50
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 51
IV.1 Kết luận ................................................................................................................. 51
IV.2 Đề nghị .................................................................................................................. 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 53
Tài liệu trong nước........................................................................................................... 53
Tài liệu nước ngoài .......................................................................................................... 55
Tài liệu internet ................................................................................................................ 56

PHỤ LỤC .................................................................................................................... i

ix


Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Khảo sát và tối ưu các điều kiện môi
trường nuôi cấy in vitro cây Sầu Riêng (Durio zibethinus Murray)” sẽ hoàn thiện
quy trình nuôi cấy in vitro cây Sầu Riêng.
Nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát khả năng tạo chồi in vitro từ phôi hột
Sầu Riêng và khảo sát một số yếu tố môi trường (nhiệt độ nảy mầm và sinh trưởng;
độ thoáng khí; than hoạt tính; caseinhydrolysate; oligosaccharide; PVP) để cải thiện

2


chất lượng chồi Sầu Riêng in vitro. Từ đó, cung cấp nguồn nguyên liệu chất lượng
cao nhằm tạo ra cây Sầu Riêng con khỏe mạnh với hệ số nhân cao trong thời gian
ngắn.

3


TỔNG QUAN

4


I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.1

Giới thiệu cây Sầu Riêng

I.1.1

Họ Malvaceae [16] [45]

Phân lớp: Magnoliidae
Bộ: Mavales
Họ: Malvaceae
Chi: Durio
Loài: Durio zibethinus Murray

Hình 1: Cây Sầu Riêng
Sầu Riêng là cây thân gỗ, sống lâu năm, cây trồng bằng hột có thể cao 20-40
mét, cây ghép chỉ cao 8-12 mét. Thân thẳng, cành thường nằm ngang, phân cành thấp.
Lá Sầu Riêng thuộc loại lá đơn, mọc cách, dạng tròn hơi dài, gốc lá tròn hoặc tù, có
lông hình vẩy, mặt trên màu xanh sáng, mặt dưới có lông mịn, màu hơi nâu óng ánh.
Chiều dài khoảng 12-20 cm, rộng 4-6 cm. Cuống lá dày, dài 1,3-3 cm.
Rễ Sầu Riêng là loại rễ cọc, chắc khỏe, nếu gặp điều kiện không thuận lợi (mực
nước ngầm thấp, không có tầng sỏi đá phía dưới…); có thể đâm sâu tới 5-6 mét. Sự
phân bố rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chất đất, mực nước ngầm cao hay thấp,
loại cây giống, kỹ thuật chăm sóc.
Hoa Sầu Riêng là hoa lưỡng tính, mọc thành từng chùm từ 3-30 hoa trên những
cành lớn, ít mọc ở những cành nhỏ và không mọc ở đầu cành như một số cây ăn quả
khác (chôm chôm, nhãn, vải…). Đài có 5 cánh, đài phụ phía ngoài có 3 cánh, vành
hoa 5 cánh màu kem hơi xanh. Nhị đực dài hơn cánh, gồm 5 bó hoa dính với nhau ở
phần gốc. Bầu nhụy hình trái xoan, có vòi dài, đầu nhụy tròn có 5 mảnh, khi chín có
nhựa dính. Từ khi nụ bắt đầu nở đến khi thành hoa mất khoảng 2-3 ngày.

6


Trái có nhiều gai hình chóp nhọn, gai có hình dạng và kích thước tùy giống.
Màu sắc vỏ trái tùy thuộc giống, có giống màu xanh nhạt (giống khổ hoa xanh), có
giống màu vàng đồng (sữa lép Bến Tre)… Sau khi đậu trái, từ tuần lễ thứ 5-13 trái
tăng trưởng rất nhanh, sau đó chậm dần, đến tuần thứ 15-16 thì chín. Trái to, gồm 5



thường được trồng trong phạm vi xích đạo tới vĩ tuyến 17-18. Để sinh trưởng và phát
triển bình thường cây Sầu Riêng cần nhiệt độ từ 24-30 0C.
Sầu Riêng là cây ưa ẩm, không khí thường xuyên ẩm (ẩm độ không khí khoảng
75-85%). Sầu Riêng là cây chịu hạn rất kém. Thích hợp với những vùng có lượng
mưa tổng số hàng năm khoảng 1600-4000 mm (tốt nhất là vào khoảng 2000 mm),
nhưng phân bố đều trong năm, vì thế vào mùa khô và những đợt hạn trong mùa mưa
rất cần phải tưới nước cho cây, nhất là ở những vùng đất cao ở vùng Đông Nam Bộ
và Tây Nguyên.
Khi còn nhỏ, cây Sầu Riêng không cần nhiều ánh sáng, thích ánh sáng tán xạ
hơn là ánh sáng trực tiếp, số giờ nắng thích hợp vào khoảng 2000 giờ/năm. Càng lớn
cây càng cần nhiều ánh sáng, không cần cây che bóng, số giờ nắng thích hợp. Thân
cây Sầu Riêng yếu, gỗ giòn, dễ gãy, dễ bật gốc nếu gặp gió, bão, vì vậy nên chọn
những vùng tương đối kín gió để trồng, nên trồng những hàng cây chắn gió xung
quanh vườn để che chắn bớt gió cho cây.
I.1.4

Thành phần hóa học [25] [46]

Cơm trái Sầu Riêng chiếm 20-35% trọng lượng trái, hột chiếm 5-15%, vỏ chiếm
55-56%. Cơm trái và hột chứa nhiều chất dinh dưỡng, giàu carbohydrate, protein,
chất béo, khoáng và vitamin. Mùi thơm của Sầu Riêng do các thiols hoặc thioethers
và sulfides.
Bảng I.1: Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g cơm Sầu Riêng
Thành phần

Hàm lượng

Nước

Thiamine

0,27 mg

Muối natri

1 mg

Riboflavin

0,29 mg

Niacin

1,2 mg

Calcium

20 mg

Phosphorus

63 mg

Vitamin C

57 mg

Vitamin A


sượng cơm trái cây Sầu Riêng Monthong trồng tại Bến Tre.
Năm 2007, Huỳnh Văn Tấn nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất quả chất
lượng và an toàn thực phẩm đối với xoài cát Hòa Lộc và Sầu Riêng cơm vàng sữa hột
lép.

9


Năm 2013, Lê Thị Kim Phụng và Lê Anh Kiên nghiên cứu tối ưu quá trình than
hóa vỏ Sầu Riêng ứng dụng trong xử lý chất màu.
Năm 2013, Nguyễn Tốn Tưởng nghiên cứu đề tài nuôi cấy in vitro cây Sầu
Riêng (Durio zibethinus Murray).
Ngoài nước [35] [37] [38] [41] [42]

I.2.2

Năm 1995, K. C. Wong và D. Y. Tie đã nghiên cứu tìm thành phần dễ bay hơi
của Sầu Riêng.
Năm 2007, Y.Y. Voon cùng các đồng sự đã xác định đặc điểm của giống Sầu
Riêng Malaysia: Mối quan hệ của lý hóa và hương vị thông qua cảm quan.
Năm 2008, Hameed B. cùng các đồng sự đã nghiên cứu sử dụng vỏ Sầu Riêng
(Durio zibethinus Murray) chi phí thấp để hấp thụ loại bỏ thuốc nhuộm acid từ dung
dịch nước.
Năm 2010, KoMSil Pholdaeng cùng các đồng sự đã nghiên cứu về tác dụng
điều hòa miễn dịch của gel polysaccharide chiết xuất từ Durio zibethinus trong
Penaeus Tôm sú chống lại vi khuẩn Vibrio harveyi và WSSV.
Năm 2011, Mahani A. cùng các đồng sự đã nghiên cứu dùng vỏ Sầu Riêng thu
hồi dung dịch vàng.

I.3

cấp (hạch nhân, không bào lớn dần và ti thể, lạp thể phân chia thành các bóng nhỏ).
Một vài biến đổi khác có thể xảy ra trước khi bắt đầu giai đoạn khử phân hóa: mất
dần tinh bột dự trữ trong các lạp hoặc tích lũy tinh bột dự trữ và một số chất khác,
nhưng sự tích lũy như vậy có thể làm chậm sự tạo mô phân sinh. Sau đó là bước
chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái mô phân sinh thứ cấp sang trạng thái mô phân sinh
sơ cấp có khả năng sinh cơ quan. Có sự phân chia không bào thành những không bào
nhỏ. Tế bào có thể tích nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân và hạch nhân
rất to.
Tiếp theo là giai đoạn tái phân hóa của mô phân sinh sơ cấp. Tế bào trở lại trạng
thái mô phân sinh thứ cấp. Sự tái phân hóa cũng trải qua hai bước: bước một, tế bào
trở về trạng thái mô phân sinh hoạt động, các không bào trương nước và hợp thành
không bào trung tâm, kích thước tế bào gia tăng, ti thể dần trở về hình dạng đặc trưng;
bước hai, các lạp phân hóa, các chất sống căn bản (hạch nhân, tế bào chất…), chất dự
trữ, các chất tiết (tanin, tinh dầu…) được tổng hợp. Sau đó, các tế bào này có thể trở
lại giai đoạn phân chia tế bào mới hay trực tiếp phân hóa mà không qua sự phân chia
tế bào.
I.3.2

Phát sinh hình thái rễ bất định [4] [13] [19]

Rễ bất định là rễ được hình thành ở các vị trí bất định: trên lá, thân, ngoài vị trí
cổ rễ. Rễ bất định mọc trên thân hay lá. Các rễ có thể mọc ở trên thân ở vị trí mắt

11


hoặc ở nách lá hoặc ở dọc theo thân, ở vị trí bất định nên gọi là rễ bất định. Rễ bất
định thường gặp ở những cây họ Lúa và nhiều cây ở lớp Hành.
Rễ bất định có thể có ở trụ hạ diệp của một cây con, ở các mấu và lóng của thân
và ở rễ. Hầu hết rễ bất định phát sinh kiểu nội sinh, mặc dù vẫn có những trường hợp

cả các vấn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa học, di truyền học
và cấu trúc thực vật.

12


Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật hiện nay đã được củng cố
vững chắc ở rất nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Nhiều phương pháp đã
được phát triển để nhân giống, chọn lọc các đặc điểm mong muốn khác nhau, tạo
dòng tế bào, nhân nhanh các kiểu di truyền tạo ra các cây đơn bội từ nuôi cấy noãn
và túi phấn, đa dạng hóa các kiểu di truyền bằng cách tạo đột biến và nhân dòng soma,
tạo mô sẹo cô lập và nuôi cấy tế bào để nghiên cứu ảnh hưởng của khoáng, vitamin
và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào. Nhiều
kỹ thuật nuôi cấy mô đặc biệt đã được nghiên cứu và ứng dụng. Trong tương lai, các
mô được nuôi cấy sẽ được sử dụng như công cụ cơ bản và người ta đã sử dụng nhiều
thuật ngữ chuyên biệt để phân biệt các kiểu nuôi cấy khác nhau: cấy cây, cấy phôi,
cấy cơ quan, cấy mô, cấy tế bào, cấy tế bào trần, cấy túi phấn, hạt phấn.
I.4.2

Vai trò của nuôi cấy mô thực vật [12]

I.3.2.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản
- Rút ra quy luật về mối tương quan giữa các bộ phận trong cây.
- Bằng phương pháp nuôi cây mô chúng ta có thể phân biệt được từng giai đoạn
một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể, dễ dàng tạo ra
các bước phát sinh hình thái một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công
tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa
chúng và môi trường bên ngoài. Từ đó có thể thúc đẩy sự phát triển của cây
trồng theo chiều hướng mong muốn.
- Tìm ra được những cơ chế miễn dịch thực vật giúp cho việc phòng bệnh thực

có cấu trúc gần giống AIA, có thể là dẫn xuất hay tiền chất của AIA và có cùng vai
trò với AIA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin theo nghĩa rộng.

Hình I.1: Auxin
Auxin được tổng hợp ở ngọn thân, trong mô phân sinh và lá non, trừ tryptophan
được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng. Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và
tích tụ trong rễ.
Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào,
cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích
thích sự phân hóa mô dẫn.

14


Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của
các sơ khởi rễ này. Auxin được vận chuyển hướng gốc, tích lũy ở phần gốc của khúc
cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định. Trong sự tạo rễ,
auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid
amin (như arginin), nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid
chlorogenic).
I.5.2

Cytokinin [31] [39]

Cytokinin, dẫn xuất của adenin, là chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể kích
thích hoặc ức chế các quá trình sinh lý, hóa sinh, trao đổi chất, phát triển của thực
vật.

Hình I.2: Cytokinin
Cytokinin nội sinh đóng vai trò quan trọng trong sự điều biến các chức năng